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(1.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003; 2.山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心,山東青島 266002)

近年來,食品安全問題已成為人們普遍關(guān)心的問題[1],其中食物過敏問題也越來越受到人們的重視[2]。世界衛(wèi)生組織(WTO)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)已將過敏疾病認定為當今世界性的重大問題之一[3-4]。調(diào)查顯示,一些西方國家2.5%的成年人和6%～8%的兒童會有過敏疾病[5]。在中國,約有6%的人群患有過敏疾病[6]。特別在中國沿海地區(qū),海產(chǎn)品的消費量很大,因食用海產(chǎn)品而過敏的消費者逐年增加,以及過敏的長期性和嚴重性,使得海產(chǎn)品過敏成為重要的公共健康問題[7]。蝦與蟹等甲殼類動物及其制品是引起食物過敏較常見的一類食品[8],且多數(shù)為終生過敏[9]。蝦類過敏反應(yīng)嚴重影響著過敏人群的身體健康和生活質(zhì)量[10],極微量的過敏原就能導(dǎo)致嚴重的過敏反應(yīng)[11]。

南美白對蝦作為海蝦淡養(yǎng)的優(yōu)良品種[12],其養(yǎng)殖在我國各地得以迅速推廣[13],因此有必要對南美白對蝦的過敏原進行檢測分析。目前,已有許多關(guān)于南美白對蝦過敏原檢測相關(guān)研究。García-Orozco等[14]對南美白對蝦的一種過敏原精氨酸激酶的分子特性進行了研究。吳海明[15]對南美白對蝦過敏原進行了鑒定并用酶法消減。這些方法為過敏原的檢測提供了一定技術(shù)支持。但是,隨著水產(chǎn)品市場需求不斷擴大,亟需開發(fā)一種高通量、靈敏準確且操作簡便的水產(chǎn)品過敏原檢測方法。

高效液相色譜作為一種新的液相色譜技術(shù),相對于常規(guī)液相色譜而言,有更好的分離效率、峰容量以及靈敏度[16]。這一技術(shù)與能夠測定化合物的精確質(zhì)量并與具有MS/MS功能的飛行時間質(zhì)譜(time-of-flight mass spectrometer,TOF-MS)聯(lián)用,成為復(fù)雜體系分離分析以及化合物結(jié)構(gòu)鑒定的良好平臺[17],在水產(chǎn)品過敏原鑒定方面具有很大的潛力。三重四級桿質(zhì)譜以其高靈敏、精確度和重現(xiàn)性[18],在分析檢測中起到了重要作用。因此,本研究采用高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜檢測南美白對蝦的過敏原,并初步建立了三重四級桿多反應(yīng)檢測模式快速檢測表征過敏原肽段的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南美白對蝦 市售;測序級胰蛋白酶(18523 U/mg) 美國Promega公司;甲酸(質(zhì)譜級) 美國Sigma公司;乙腈 美國Fisher公司;碘代乙酰胺 美國Sigma公司;Folin-酚乙液 北京索萊寶科技有限公司;二硫蘇糖醇、尿素、碳酸氫銨、碳酸鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、五水硫酸銅、牛血清蛋白 國藥集團化學試劑有限公司。

Nexera X2 30A高效液相色譜儀 日本島津公司;1290高效液相色譜 美國Agilent 公司;AB SCIEX Triple TOF? 5600質(zhì)譜儀 美國SCIEX公司;Triple QuadTM 5500三重四級桿質(zhì)譜儀 美國SCIEX公司;MQS50001型超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司;AB135-S型精密電子分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司;A11分析研磨機 德國IKA公司;CR21G II高速冷凍離心機 日本CHTACHI公司;UFC501008超濾管 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 南美白對蝦蛋白的提取 取六個體形完整的南美白對蝦,肌肉用液氮研磨成粉末。取1 g蝦粉,用10 mL蛋白提取液(8 mol/L尿素,50 mmol/L NH4HCO3),垂直振蕩30 min,高速低溫離心20 min(4 ℃,15000 r/min),取上清液,測其蛋白含量,實驗平行三次。

1.2.2 提取液蛋白含量的測定 采用Folin-酚法[19]。

1.2.2.1 溶液的配制 Folin-酚甲液由A液和B液5∶1混合而成,臨用時現(xiàn)配(A液:10 g碳酸氫鈉,2 g氫氧化鈉,0.25 g酒石酸鉀鈉溶于500 mL蒸餾水;B液:0.25 g五水硫酸銅溶于100 mL蒸餾水水中),乙液為商品化試劑。

1.2.2.2 標準曲線的制作 取6支試管,分別加入0、200、400、600、800、1000 μL mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液,用蒸餾水補足到1 mL。每管加入Folin-酚甲液5 mL,搖勻,于25 ℃靜置10 min。每管加入Folin-酚乙液0.5 mL,迅速搖勻,30 ℃靜置30 min,以蒸餾水為空白,在650 nm處比色測吸光值,實驗重復(fù)三次。

1.2.2.3 南美白對蝦蛋白含量的測定 為了準確測定南美白對蝦提取液的蛋白含量,必須使吸光度在線性范圍內(nèi),因此取1.2.1中的上清原液以及10～1000倍梯度稀釋的樣品,取樣量為1 mL,每管加入Folin-酚甲液5 mL,搖勻,于25 ℃靜置10 min。每管加入Folin-酚乙液0.5 mL,迅速搖勻,30 ℃靜置30 min,以蒸餾水為空白,在650 nm處比色測吸光值,實驗重復(fù)三次。

1.2.3 蛋白提取液胰蛋白酶酶解 參考Wisniewski等[20]和Mi等[21]的方法,取1.2.1制得的上清液100 μL,分別加入2 μL 1 mol/L二硫基蘇糖醇在60 ℃反應(yīng)1 h,實驗重復(fù)三次。取5 μL 1 mol/L現(xiàn)配的碘代乙酰胺,加入到已經(jīng)冷卻至室溫的上述反應(yīng)液中,室溫避光反應(yīng)1 h。采用10K超濾離心管在15000 r/min離心超濾20 min后,每次用200 μL 50 mmol/L碳酸氫銨溶液洗滌膜上層蛋白,共洗滌三次。最后在膜上層加入200 μL 50 mmol/L碳酸氫銨溶液作為緩沖液,并按酶和底物比1∶50,將胰蛋白酶溶液加入到上述蛋白溶液中,混勻并在37 ℃酶解16 h,使酶解徹底。在超濾離心管15000 r/min離心超濾20 min,收集下層的肽段濾液,待上機檢測。

1.2.4 南美白對蝦肽段的分離和檢測

1.2.4.1 高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜法 液相色譜條件:色譜柱為安捷倫AdvanceBio Peptide Map column(150 mm×2.1 mm,130 ?,2.7 μm);柱溫:40 ℃。流動相A:0.1%甲酸-乙腈,流動相B:0.1%甲酸-水;流速:0.25 mL/min;進樣量:30 μL;進樣時間:46 min;流動相梯度:0～2 min(95% B),2～17 min(95%～80% B),27～37 min(85%～65% B),37～39 min(65%～20% B),39～42 min(20%～95% B),42～46 min(95% B)。質(zhì)譜條件:質(zhì)譜掃描范圍為350～1500 Da,正離子反應(yīng)模式,霧化氣GS1:35 psi,輔助加熱器GS2:45 psi,氣簾氣壓:35 psi,噴霧電壓5500 eV,離子源溫度:500 ℃,解簇電壓:100 V,碰撞能量:10 eV,信號強度閾值:2e4。

1.2.4.2 高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜法

傳輸離子對的確定:為了提高過敏原肽段的靈敏度和選擇性,使用Skyline軟件產(chǎn)生傳輸離子對,并優(yōu)化傳輸離子對的碰撞能量(CE)和解簇電壓(DP),建立三重四級桿MRM的方法。每條肽段選擇5對響應(yīng)強度最高的傳輸離子對,駐留時間設(shè)置為5 ms。通過檢測肽段的傳輸離子對來鑒定肽段,并使用肽段來表征過敏原蛋白。

高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜參數(shù):液相色譜條件:色譜柱為安捷倫Advance Bio Peptide Map column(150 mm×2.1 mm,130 ?,2.7 μm);柱溫:40 ℃。流動相A:0.1%甲酸-乙腈,流動相B:0.1%甲酸-水;流速:0.35 mL/min;進樣量為20 μL;流動相梯度:0～0.5 min,5% B;0.5～17 min,5%～35% B;17～17.5 min,35%～95% B;17.5～20 min,95% B;20～20.1 min,95%～5% B;20.1～25 min,5% B。質(zhì)譜條件:正離子模式,噴霧電壓為5500 V,霧化氣為35 psi,離子源溫度為575 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

質(zhì)譜和計算機采集肽段質(zhì)荷比和保留時間、響應(yīng)強度等數(shù)據(jù),生成wiff文件,導(dǎo)入Protein Pilot軟件,檢索NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)南美白對蝦(LitoLitopenaeus vannamei)的蛋白數(shù)據(jù)庫。ProteinPilot軟件參數(shù)設(shè)置如下:搜庫方法:Paragon method;消化:Trypsin;儀器:TripleTOF 5600;物種:None;ID Focus:Amino acid Subtitutions,Biological modifications;Search Effort:Thorough ID;檢測蛋白質(zhì)閾值(Unused Protscore(conf)):>0.05%(10.0%);提交錯誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery rate analysis,FDR)分析報告。

2 結(jié)果與分析

2.1 南美白對蝦提取液蛋白含量的測定結(jié)果

2.1.1 標準曲線的建立 以牛血清蛋白含量為橫坐標,650 nm處吸光值為縱坐標,線性回歸方程為:y=2.7834x+0.0149(R2=0.9975),繪制的標準曲線如圖1所示。

圖1 蛋白含量標準曲線Fig.1 Standard curve of protein content

2.1.2 南美白對蝦提取液中的蛋白含量 采用稀釋100倍的樣品,測得650 nm處的吸光值平均數(shù)為0.601,換算成提取液蛋白含量為20.7 mg/mL。

2.2 南美白對蝦蛋白胰蛋白酶降解產(chǎn)物的分析

2.2.1 高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜分析 南美白對蝦蛋白胰蛋白酶降解產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜檢測分析,觀察得到的譜圖,發(fā)現(xiàn)其譜峰尖銳,峰形較為對稱,數(shù)據(jù)采集情況良好,譜圖重現(xiàn)性好。高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜上南美白對蝦蛋白胰蛋白解產(chǎn)物得到的有代表性的總離子流色譜圖如圖2所示。

圖2 高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜上南美白對蝦 蛋白胰蛋白解產(chǎn)物得到的有代表性的總離子流色譜圖Fig.2 Representative total ion chromatogram (TIC)scan spectra of hydrolysate of Litopenaeus vannamei on HPLC-QTOF

南美白對蝦蛋白胰蛋白酶降解產(chǎn)物經(jīng)超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜檢測,采集的數(shù)據(jù)在Protein Pilot軟件中用NCBI的南美白對蝦數(shù)據(jù)庫進行譜庫檢索。在95%的置信度下,共鑒定出7種過敏原,分別是原肌球蛋白、精氨酸激酶、肌球蛋白輕鏈、血藍蛋白亞基L1、血藍蛋白亞基L2、血藍蛋白亞基L3、肌鈣蛋白C1,對應(yīng)的肽段條數(shù)分別為214、16、84、145、225、163和93條。表1列出了南美白對蝦中過敏原的蛋白名稱和NCBI中的登記號,以及每個過敏原蛋白對應(yīng)的響應(yīng)強度最高的10條肽段。

表1 南美白對蝦中的過敏原及代表性肽段Table 1 Allergens of Litopenaeus vannamei and representative peptides

2.2.2 高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜分析

2.2.2.1 產(chǎn)生傳輸離子對 Skyline軟件產(chǎn)生的傳輸離子對及對應(yīng)的碰撞能量和解簇電壓如表2所示。為了簡化說明,僅選取3條代表性的過敏原肽段作為示例。

表2 Skyline預(yù)測的南美白對蝦過敏原代表性肽段解簇電壓和碰撞能量Table 2 The declustering potential and collision energy values of representative peptide of Litopenaeus vannamei predicted by Skyline

2.2.2.2 MRM結(jié)果 高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜上南美白對蝦蛋白胰蛋白解產(chǎn)物得到的的總離子流色譜圖和提取離子流色譜圖如圖3所示。圖4為南美白對蝦過敏原代表性肽段DNAMDR的提取離子色譜圖和二級質(zhì)譜圖,母離子為361.15,子離子分別為492.22、421.19、290.15、175.12、230.08,其保留時間為1.58 min。圖5為南美白對蝦過敏原代表性肽段LSSLEGELK的提取離子色譜圖和二級質(zhì)譜圖,母離子為488.27,子離子分別為862.45、775.42、575.30、446.26、201.12,其保留時間為7.67 min。圖6為南美白對蝦過敏原代表性肽段SEEEVHNLQK的提取離子色譜圖和二級質(zhì)譜圖,母離子為635.30,子離子分別為795.44、696.37、559.31、217.08、475.17,其保留時間為2.10 min。

圖3 南美白對蝦胰蛋白酶解產(chǎn)物在高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜上的總離子流圖和提取離子流色譜圖Fig.3 Representative total ion chromatogram(TIC)scan spectra and extracted ion chromatogram(XIC) scan spectra of hydrolysate of Litopenaeus vannamei on triple quadrupole mass spectrometer注:A為總離子流色譜圖,B為提取離子流色譜圖。

圖4 肽段DNAMDR的提取離子色譜圖和二級質(zhì)譜圖Fig.4 Representative extracted ion chromatogram(XIC) scan spectra and secondary ion mass spectrometry(SIMS)of peptide DNAMDR注:a～e為提取離子色譜;f為二級質(zhì)譜圖;圖5～圖6同。

圖5 肽段LSSLEGELK的提取離子色譜圖和二級質(zhì)譜圖Fig.5 Representative extracted ion chromatogram(XIC) scan spectra and secondary ion mass spectrometry(SIMS)of peptide LSSLEGELK

圖6 肽段SEEEVHNLQK的提取離子色譜圖和二級質(zhì)譜圖Fig.6 Representative extracted ion chromatogram(XIC)scan spectra and secondary ion mass spectrometry(SIMS)of peptide SEEEVHNLQK

3 結(jié)論

采用高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜共檢測出南美白對蝦中7種過敏原,分別是原肌球蛋白、精氨酸激酶、肌球蛋白輕鏈、血藍蛋白亞基L1、血藍蛋白亞基L2、血藍蛋白亞基L3、肌鈣蛋白C1,對應(yīng)的肽段條數(shù)分別為214、16、84、145、225、163和93條。高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜通過檢測母離子和子離子的精確質(zhì)量數(shù),結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索可以匹配出肽段。高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜的MRM模式靈敏度高、選擇性好、操作簡單,但是需要預(yù)先設(shè)定母離子和子離子。本研究建立了一種檢測南美白對蝦過敏原的新思路:從高分辨飛行時間質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)過敏原的肽段到三重四級桿MRM方法的開發(fā)。本研究有助于進一步認識過敏原,為水產(chǎn)品的食用安全性提供一定的基礎(chǔ)理論依據(jù)。