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(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽 621010; 2.四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心,四川綿陽 621010)

景天三七(SedumaizoonL.),景天科植物又被稱為高鈣菜、救心菜、土三七等[1],四川、浙江、陜西、甘肅、山西、寧夏、湖北、青海等地均有種植[2]。景天三七營養(yǎng)豐富,有研究表明,景天三七具有降低血管硬化、促進(jìn)新陳代謝、抗氧化及解毒消腫等[3-5]作用,是有一定藥食潛力的資源。景天三七具有種植范圍廣,環(huán)境適應(yīng)性強,且采收期長等優(yōu)點,可以為功能性提取物的生產(chǎn)加工提供穩(wěn)定的原料來源。近年來,黃酮類化合物的研究在食品領(lǐng)域趨于熱門,加快了對具有良好功能性的藥食同源的植物資源的開發(fā),付煜榮等[6]采用顏色反應(yīng)檢識證明景天三七中含有黃酮類化合物。張興桃等[7]通過超臨界CO2萃取景天三七總黃酮。

目前,對景天三七功能性成分的研究與開發(fā)主要集中在黃酮類、生物堿、甾醇[8-11]等活性成分。黃酮類化合物具有抗氧化性、抗炎癥、抗病毒、抗菌[12-13]等功效,并對防治癌癥、腫瘤、心血管[14-16]等疾病具有重要意義。而關(guān)于景天三七中的黃酮類化合物純化及性質(zhì)研究較少。本研究基于文獻(xiàn)報道[17-19],選用大孔樹脂靜態(tài)吸附方法純化景天三七總黃酮,并研究了景天三七總黃酮最佳純化工藝及其性質(zhì),為景天三七中黃酮類化合物的系統(tǒng)性研究做出一定的補充。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

景天三七 均于2017年8月采自西南科技大學(xué)蔬菜實驗園,新鮮,無蟲害,并由統(tǒng)一干燥方法加工制樣;蘆丁對照品 南京替斯艾么中藥研究所 標(biāo)準(zhǔn)品;二苯代苦味肼基自由基(DPPH)、ABTS SIGMA ALDRICH 公司,分析純,抗氧化劑;乙醇、鹽酸、三氯乙酸、鐵氰化鉀、四硼酸鈉、硝酸鋁、抗壞血酸、鎂粉、鋅粉 成都市科龍化工試劑廠,分析純;D-101、AB-8、X-5、DA-201型大孔樹脂 成都市科龍化工試劑廠。

U-3900H型紫外分光光度計 Hitachi日立公司;Agilent1200系列LC-MS 安捷倫公司;pH 510酸度計 EUTECH INSTRUMENTS公司;FD-T12N-80型冷凍真空干燥儀 Thermo Electron Corporation;DJ靈巧型中藥粉碎機 海淀久中藥機械制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 景天三七總黃酮粗提物樣品液的制備 景天三七燙漂30 s后55 ℃烘干,置入中藥粉碎機粉碎,粉末過40目篩,取100 g粉碎后的景天三七經(jīng)由乙醇浸提(81 ℃,90%乙醇,料液比1∶44,浸提3 h),采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除醇后加入等體積石油醚萃取除雜,再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去石油醚,加入95%乙醇溶解,低溫靜置12 h后經(jīng)離心(4500 r/min,15 min)取上清液,濃縮除醇,進(jìn)行預(yù)凍過夜(0 ℃)后置于真空冷凍干燥機中干燥36 h得景天三七總黃酮粉末。精確稱取0.1000 g總黃酮粉末,用30%乙醇微熱溶解后,用同濃度乙醇定容到100 mL,得1.00 mg·mL-1景天三七總黃酮粗提物樣品液,測定總黃酮實際含量,備用。

1.2.2 大孔樹脂的預(yù)處理 預(yù)處理過程為:將各樹脂用95%乙醇浸泡24 h后依次用乙醇、去離子水沖洗,至洗盡醇味;用5%鹽酸溶液處理,用去離子水洗至中性;最后用5%NaOH溶液處理,用去離子水洗至中性,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 總黃酮含量測定 以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為對照,采用NaNO2-Al(NO3)3法[20]測定黃酮含量;進(jìn)行蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和回歸方程的建立,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所得回歸方程為y=1.1688x+0.0054,決定系數(shù)R2=0.9998,具有良好線性關(guān)系,x為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度(mg·mL-1)。

樣品的測定:準(zhǔn)確量取景天三七總黃酮粗提物樣品液1 mL。按上述方法測定吸光度,并帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算,得出總黃酮含量。

1.2.4 大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸附實驗

1.2.4.1 大孔樹脂篩選 將預(yù)處理好的四種大孔樹脂(D101型、DA-201型、X-5型、AB-8型)抽濾并經(jīng)濾紙吸干后,各精確稱取1.0 g于200 mL錐形瓶中,再準(zhǔn)確加入一定濃度的景天三七總黃酮樣品液25 mL。于30 ℃、振蕩頻率100 r/min的條件下振蕩吸附24 h后,測定平衡液總黃酮濃度Ce。分別抽濾后,將大孔樹脂移回錐形瓶中,準(zhǔn)確加入25 mL 95%乙醇,再在30 ℃、振蕩頻率100 r/min的條件下振蕩靜態(tài)解吸附24 h后,測定解吸液總黃酮濃度Cd。通過比較吸附率、解吸率和回收率,篩選出理想型大孔吸附樹脂。

1.2.4.2 大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸附動力學(xué)曲線 樹脂靜態(tài)吸附曲線:精確稱取篩選出的大孔吸附樹脂1.00 g于200 mL三角錐形瓶中,加入25.00 mL濃度為0.7 mg·mL-1的景天三七總黃酮純化液。在pH為4.0、30 ℃、振蕩頻率100 r/min的條件下振蕩靜態(tài)吸附7 h,每隔30 min取0.2 mL上清液測定總黃酮濃度計算吸附率,建立吸附率與時間的靜態(tài)吸附動力曲線。

樹脂靜態(tài)解吸附曲線:將上述已經(jīng)吸附飽和的大孔吸附樹脂抽濾并用濾紙吸干后轉(zhuǎn)移到200 mL三角錐形瓶中,加入95%乙醇25 mL,在pH為4.0、30 ℃、振蕩頻率100 r/min的條件下振蕩靜態(tài)解吸附7 h,每隔30 min取0.2 mL上清液測定總黃酮濃度并計算解吸率,建立解吸率與時間的靜態(tài)解吸附動力學(xué)曲線。

1.2.4.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附及解吸附條件優(yōu)化 使用篩選出的DA-201依照方法1.2.4.1及1.2.4.2進(jìn)行靜態(tài)吸附和靜態(tài)解吸附實驗,研究樹脂靜態(tài)吸附和解吸附動力學(xué),考察樣液質(zhì)量濃度(0.1、0.3、0.7、1.4、2.8 mg/mL,pH為4.0)和pH(2、3、4、5、6,樣液質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL)對靜態(tài)吸附的影響,乙醇濃度(75%、80%、85%、90%、95%,pH為4.0,樣液質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL)對靜態(tài)解吸附的影響。實驗均重復(fù)三次取平均值。

1.2.4.4 樹脂吸附率及解吸率的計算 吸附量(Q)、吸附率(E)、解吸率(D)、回收率(R)分別按照如下公式計算[21]。

式(1)

式(2)

式(3)

式(4)

式中:C0-溶液總黃酮起始濃度,mg·mL-1;Ce-溶液平衡時黃酮濃度,mg·mL-1;V0-吸附液體積,mL;m-樹脂質(zhì)量,g;Cd-解吸液黃酮濃度,mg·mL-1;Vd-解吸液體積,mL。

1.2.5 景天三七總黃酮抗氧化活性測定

1.2.5.1 景天三七精提液樣品的制備 按1.2.4優(yōu)化試驗得到的DA-201型樹脂純化分離條件處理景天三七總黃酮樣品液,收集洗脫液,離心(4500 r/min,15 min,25 ℃),濃縮除醇,進(jìn)行預(yù)凍過夜(0 ℃)后置于真空冷凍干燥機中干燥36 h得景天三七精提物總黃酮粉末。按照方法1.2.1配制成景天三七精提物溶液,比較純化前后的黃酮純度和抗氧化活性。

1.2.5.2 總黃酮純度的測定 總黃酮溶液理論濃度值為1.00 mg·mL-1(P2),測定粗提物及精提物液樣品純度(P1),計算含量。按式(5)計算含量(P)。

式(5)

式中:P1-溶液實際濃度,mg·mL-1;P2-溶液理論濃度,mg·mL-1。

1.2.5.3 DPPH·清除作用測定 參考Helal等[22]對DPPH·清除率測定方法,于517 nm下測定吸光值,按下式(6)計算DPPH·清除率(K)。以VC作為陽性對照。

式(6)

式中:Ai-加入樣品溶液吸光值;Aj-樣品溶液本底吸光值;Ac-空白吸光值。

1.2.5.4 ABTS+·清除活性 以過硫酸鉀溶液配制ABTS+儲備液,并以磷酸鹽緩沖液稀釋得到ABTS+·測定液,參照Binsan等[23]的方法,按下式(7)計算ABTS+·自由基清除率。以VC作為陽性對照。

式(7)

式中:Ai-加入樣品溶液吸光值;Aj-樣品溶液本底吸光值;Ac-空白吸光值。

1.2.5.5 對羥基自由基清除作用測定 參照薛丁萍等[24]對羥自由基的測定方法,按下式(8)計算羥自由基清除率(R)。以VC作為陽性對照。

式(8)

式中:Ai-加入樣品溶液吸光值;Aj-樣品溶液本底吸光值;Ac-空白吸光值。

1.2.6 景天三七總黃酮純化物初步鑒定

1.2.6.1 紫外-可見光譜掃描 用紫外可見分光光度計,于250～600 nm波長范圍內(nèi)對景天三七總黃酮純化液進(jìn)行紫外-可見光譜掃描分析。

1.2.6.2 紅外光譜掃描 取適量景天三七總黃酮純化物粉末,與適量的溴化鉀研磨混合后壓片,在400～4000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.2.6.3 顏色反應(yīng) 采用鹽酸-鋅粉反應(yīng)、四氫硼鈉反應(yīng)、鋁鹽反應(yīng)、鎂鹽反應(yīng)、與濃硫酸反應(yīng)[25],觀察并記錄顏色,對景天三七總黃酮的種類進(jìn)行初步鑒定。

1.2.6.4 HPLC-MS分析 供試品溶液制備:取景天三七精提物總黃酮粉末0.1 g,置50 mL容量瓶中,加入70%乙醇40 mL,超聲處理30 min,放至室溫,用70%乙醇定容。搖勻后取適量離心5 min(12000 r/min),取上清液,即得。

色譜條件:色譜柱為ZorbaxEclipseXDB-C18(4.6×250 mm,5 μm);柱溫40 ℃;進(jìn)樣量50 μL;檢測波長270 nm;流速0.63 mL/min。流動相A:水;流動相B:甲醇。洗脫程序:0 min,0 A;5 min,20% A;10 min,40% A;15 min,80% A;20 min,95% A。質(zhì)譜條件:采用ESI源,負(fù)離子模式,離子掃描范圍0～1000 m/z;霧化氣壓力:207 kPa;干燥氣流速:10 L/min;干燥氣溫度:325 ℃;TrapICC:30,000 units;最大累計時間:300 ms;MS誘導(dǎo)碰撞能量為1.0 V。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗均平行重復(fù)3次,采用Excel,SPSS 23軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,使用Origin 8.5處理數(shù)據(jù)和繪圖;紅外、紫外、色譜圖、質(zhì)譜圖由儀器自帶系統(tǒng)給出。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂對景天三七總黃酮靜態(tài)吸附解吸優(yōu)化

2.1.1 大孔樹脂篩選 在相同靜態(tài)吸附試驗條件下,測得各樹脂對景天三七總黃酮的靜態(tài)吸附-解吸附結(jié)果如表1所示。

表1 不同大孔吸附樹脂對景天三七總黃酮靜態(tài)吸附和解吸結(jié)果Table 1 Static adsorption and desorption of total flavonoids from different macroporous

通常對大孔樹脂吸附作用影響較大的因素有極性、樹脂孔徑、比表面積等。由表1可知,所選取的4種大孔樹脂對景天三七總黃酮均有一定的吸附量,且相互之間差異性顯著(p<0.05),DA-201的吸附量、吸附率、解吸率、回收率均高于其它類型樹脂。推測所選樹脂的極性和目標(biāo)物極性越相近,DA-201屬于極性共聚體,與黃酮類化合物極性相似,因此其具有較強的吸附能力。雖然X-5和AB-8型樹脂孔徑和比表面積大更有利于解吸過程,但可能因其極性原因,其吸附率較DA-201型低。綜合各方面因素,最終選用DA-201型大孔樹脂作進(jìn)一步研究。

2.1.2 大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸附動力學(xué)曲線 由圖1、圖2可知,DA-201型大孔樹脂的吸附率和解吸率在對景天三七總黃酮的吸附-解吸附的過程中,隨時間的增加而分別相應(yīng)增長,吸附率在1 h后維持在相對平穩(wěn)的狀態(tài),解吸附率在3 h后趨于平穩(wěn),所以從實際生產(chǎn)的角度考慮,1 h為最適宜吸附時間,3 h為最適宜的解吸附時間。

圖1 DA-201樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線Fig.1 Static adsorption kinetic curve of DA-201 resin

圖2 DA-201樹脂靜態(tài)解吸附動力學(xué)曲線Fig.2 Static desorption kinetic curve of DA-201 resin

2.1.3 樣液質(zhì)量濃度對DA-201樹脂吸附率的影響 由圖3可知,DA-201樹脂吸附率隨樣液質(zhì)量濃度的升高不斷提升,但在樣液質(zhì)量濃度增加至0.7 mg/mL后,上升趨勢近于平穩(wěn)。在樣液濃度較低時,樣液中的黃酮分子和DA-201樹脂的接觸幾率較小,所以吸附率低;當(dāng)樣液質(zhì)量濃度持續(xù)增加后,DA-201樹脂的孔徑已經(jīng)處于填充飽和狀態(tài),繼續(xù)提升樣液質(zhì)量濃度對其吸附率起不到提升作用?？紤]吸附效率,所以樣液質(zhì)量濃度選用0.7 mg/mL為宜。

圖3 樣液質(zhì)量濃度對DA-201樹脂吸附率的影響Fig.3 Effect of mass concentration of liquid sample on adsorption rate of DA-201 resin

2.1.4 樣液pH對DA-201樹脂吸附率的影響 由圖4可知,隨樣液pH的升高,DA-201樹脂吸附率逐漸降低,在pH為2～3時吸附率呈緩慢下降趨勢。依據(jù)大孔樹脂的吸附原理,樣液pH應(yīng)當(dāng)接近吸附目標(biāo)物的酸堿度時,吸附效果最好,但pH過低時易對黃酮類化合物產(chǎn)生破壞作用,導(dǎo)致分解變性等。因此雖然黃酮類化合物多為酸性或弱酸性的酚類物質(zhì),但實際采用pH=3為最佳條件。

圖4 樣液pH對DA-201樹脂吸附率的影響Fig.4 Effect of sample solution pH on adsorption rate of DA-201 resin

2.1.5 乙醇濃度對樹脂靜態(tài)解吸附的影響 由圖5可知,當(dāng)乙醇濃度為90%時,景天三七總黃酮的解吸率達(dá)到最高。因為黃酮類化合物多易溶于乙醇,乙醇濃度越高,黃酮類物質(zhì)溶解程度越高,但由于有解吸液中其余醇溶性雜質(zhì)的存在,當(dāng)乙醇濃度過高會導(dǎo)致其雜質(zhì)解吸增多,降低黃酮類化合物的吸附率。故乙醇濃度選擇90%為宜。

圖5 乙醇濃度對DA-201樹脂解吸率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the desorption rate of DA-201 resin

2.2 景天三七總黃酮純化前后的抗氧化活性

對景天三七總黃酮經(jīng)DA-201型大孔樹脂純化前后的總黃酮純度進(jìn)行對比,并通過IC50(50%清除率)作為評價標(biāo)準(zhǔn)對ABTS清除率、羥自由基、DPPH清除率三個指標(biāo)進(jìn)行純化前后的體外抗氧化能力對比分析。IC50值可通過SPSS 23軟件對圖6中的清除率曲線進(jìn)行回歸分析擬合處理,結(jié)果見表2。由表2可知,經(jīng)DA-201型大孔樹脂純化后,總黃酮的純度由19.38%提高到43.78%,景天三七總黃酮純度提升了2.26倍,且羥自由基、DPPH清除率的IC50均低于純化前,IC50值越低,說明樣品抗氧化性越強。單方方等人[26]在對牡丹葉的黃酮類化合物純化對抗氧化能力影響研究時,同樣發(fā)現(xiàn)黃酮純度越高抗氧化效果越明顯。所以DA-201型大孔樹脂對景天三七總黃酮純化效果整體突出,較大程度上提升了景天三七總黃酮的純度和體外抗氧化活性,可以為下一步的景天三七總黃酮性質(zhì)研究提供適宜樣品。

表2 純化前后景天三七總黃酮純度、體外抗氧化能力比較Table 2 Comparison of purity and antioxidant capacity of total flavones of Sedum aizoon before and after purification

圖6 景天三七總黃酮體外抗氧化作用Fig.6 Antioxidant activity of total flavonoids from Sedum aizoon in vitro注:(a)～(c)分別為ABTS自由基清除率、 羥自由基清除率和DPPH自由基清除率。

2.3 景天三七總黃酮性質(zhì)初步鑒定

2.3.1 紫外可見吸收光譜分析 通常大多數(shù)黃酮類化合物的紫外可見吸收光譜由峰帶I(300～350 nm,產(chǎn)生于黃酮類化合物基本結(jié)構(gòu)中的環(huán)苯甲酰系統(tǒng))和峰帶II(350～400 nm,產(chǎn)生于黃酮類化合物基本結(jié)構(gòu)中的環(huán)肉桂酰系統(tǒng))兩部分組成。)對樣品溶液在250～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見光譜掃描。結(jié)果如圖7所示,景天三七總黃酮的吸收波長主要分為兩個吸收帶,峰帶I的吸收峰在350～390 nm間,峰帶II的吸收峰位于270 nm,符合黃酮醇類化合物吸收峰帶的特征,峰帶II的吸收峰強度明顯強于峰帶I,并且峰帶I峰型較寬、平緩,可能是因為環(huán)苯甲酰系統(tǒng)上取代基成分種類較多。

圖7 景天三七總黃酮的紫外-可見吸收光譜圖Fig.7 UV Vis absorption spectra of total flavonoids from Sedum aizoon

2.3.2 紅外可見吸收光譜分析 由圖8可知,費總黃酮樣品和蘆丁在400～4000 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)多處波峰。其中,標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁在3427 cm-1和樣品在3432 cm-1處的寬大且強度極高的吸收峰均為游離O-H伸縮振動的吸收峰,說明了酚羥基的存在;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的2935 cm-1和樣品的2920 cm-1,為-CH2的反對稱伸縮振動峰[27];在1650～1450 cm-1區(qū),是蘆丁的苯環(huán)骨架震動特征吸收峰分布區(qū)域,此處景天三七總黃酮樣品和蘆丁一致具有三個吸收峰,可推測樣品可能有苯環(huán)的存在;在1500～1300-1cm-1處,蘆丁和樣品都出現(xiàn)一定特征峰,這是O-H的面內(nèi)彎曲振動峰;C-O的伸縮振動吸收峰位是1300～1200 cm-1,蘆丁和樣品在此區(qū)域都有相應(yīng)的特征峰;蘆丁和樣品位于573 cm-1處的吸收峰是苯環(huán)上的取代基引起的,樣品此處的吸收峰強度低于蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,表明羥基取代位置不同[28]。依據(jù)上述基于吸收譜帶的位置及對官能團推測的信息,景天三七總黃酮與蘆丁的紅外光譜有多處相似,初步判斷景天三七總黃酮可能為黃酮醇,但具體的結(jié)構(gòu)還需要進(jìn)一步的研究與探索。

圖8 景天三七總黃酮和標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁的紅外光譜圖Fig.8 Infrared spectrum of total flavones and standard Rutin of Sedum aizoon

2.3.3 顏色反應(yīng)鑒定分析 對純化后的景天三七總黃酮進(jìn)行顏色反應(yīng),結(jié)果見表3。通過顏色反應(yīng)結(jié)果,結(jié)合文獻(xiàn)[29]報道,對景天三七總黃酮的性質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定分析,初步推測為黃酮醇類化合物。

表3 景天三七總黃酮顏色反應(yīng)結(jié)果及分析Table 3 Results and analysis of the color reaction of the total flavonoids of Sedum aizoon

此結(jié)果也與紫外-可見光譜掃描和紅外光譜掃描的結(jié)果一致。

2.3.4 HPLC-MS信息分析 由于純化后的樣品是仍含有一部分雜質(zhì)的混合物,且成分復(fù)雜未知,對質(zhì)譜信息造成一定的干擾,本研究決定采用低分辨質(zhì)譜儀對純化后的樣品進(jìn)行初步的物質(zhì)推測,以期為后續(xù)景天三七黃酮類化合物分級分離定性研究作一定參考。

如圖9總離子流圖,各峰分離效果較好,對其中主要的6個峰的質(zhì)譜信息進(jìn)行推斷,依據(jù)特征碎片離子峰的質(zhì)荷比結(jié)合文獻(xiàn)報道的黃酮類化合物信息[30-31],從而可以初步推測樣品中可能含有的黃酮化合物,結(jié)果如表4所示,可能主要存在的黃酮類化合物有蕓香糖苷、水飛薊素類、蘆丁類、金絲桃苷類、山奈酚-3-O-糖苷類、槲皮素-3-O-糖苷類。

圖9 景天三七純化后總黃酮樣品負(fù)總離子流色譜圖Fig.9 Total negative ion chromatograms of total flavonoids after purification

圖10 代表化合物的質(zhì)譜圖Fig.10 Mass spectrum of the represents compound 注:圖(a)～(f)分別為1～6代表化合物一級質(zhì)譜圖。

表4 代表化合物質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 4 Mass spectrometry data representative compound

3 結(jié)論

通過靜態(tài)吸附解吸附實驗,篩選出DA-201型大孔吸附樹脂為最佳樹脂類型,且獲得DA-201型大孔吸附樹脂最佳靜態(tài)吸附分離工藝參數(shù)為:吸附時間3 h,樣液質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL,上樣液pH為3.0,解吸附乙醇濃度為90%。在該條件下靜態(tài)吸附率為81.05%,解吸附率為86.05%。純化后,總黃酮的純度由19.38%提高到43.78%,其羥自由基、DPPH清除率的IC50分別由69.47、44.02 μg/mL下降到43.25、30.16 μg/mL,純化后的純度和抗氧化能力明顯提升。通過紫外可見光譜、紅外光譜、顏色反應(yīng)等一系列性質(zhì)鑒定分析方法,初步推測本文所研究的純化后的景天三七總黃酮中可能含有蕓香糖苷、水飛薊素類、蘆丁、金絲桃苷類、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-糖苷類等化合物,具體的成分組成及結(jié)構(gòu)分析有待進(jìn)一步研究。