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(1.陜西理工大學,陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心,陜西漢中 723001; 2.陜西理工大學,生物科學與工程學院,陜西漢中 723001)

白及(Bletillastriata),蘭科白及屬,是多年生草本,主產(chǎn)于貴州、四川、湖南、湖北等省?！度杖A子本草》中記載,“白及止驚邪、血邪,刀箭瘡撲損,溫熱瘧疾,血痢,湯火瘡,生肌止痛,風痹”[1]。研究表明,白及中含有甾類、萜類、多糖、聯(lián)菲、聯(lián)芐類以及酯類等上百種活性化合物[2]。

目前對白及的研究主要集中于其組培技術(shù)[3]、中藥配伍與炮制[4]、塊莖中多糖膠的活性和藥物開發(fā)[5],而對白及花的研究主要集中于其花青素、多糖、黃酮類等活性物質(zhì),而對其脂溶性成分的研究鮮見報道。黃進等[6]研究了6種不同干燥方法對白及花中花青素、多糖、總黃酮和總酚的含量和抗氧化活性的影響。呂婉婉等[7]研究了白及花中花青素的含量及其抗氧化活性,為制作白及花飲品奠定了基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)多種藥用植物中脂溶性成分具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化和降血糖等生物活性。Liang[8]研究發(fā)現(xiàn)巨大蒲公英根中脂溶性成分具有抑菌和體外抗氧活性,Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)從無花果脂溶性成分中分離的β-谷甾醇具有較高的抗腫瘤活性。脂溶性成分作為白及花中一類重要化合物,優(yōu)化其提取工藝,研究其生物活性對充分開發(fā)利用其藥用資源有重要意義。

本研究采用索氏提取法對白及花中脂溶性成分進行提取,采用Box-Behnken設(shè)計分析對脂溶性成分提取工藝影響較大的三個因素即提取時間、提取次數(shù)和料液比進行優(yōu)化,確定最優(yōu)方案并驗證,擬獲得經(jīng)濟、科學的提取條件。采用濾紙片擴散法對脂溶性成分抑菌活性進行研究,采用CCK-8法對脂溶性成分抗腫瘤活性進行研究,并采用DPPH法、ABTS法和Fenton法考察其抗氧化活性,以期通過本研究為白及花的深入研究和綜合開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白及(Bletillastriata)花 采自陜西省漢中市漢臺區(qū)漢王鎮(zhèn)(北緯N33°04′10″ 東經(jīng)E107°01′38″),將其曬干后備用;人肺腺癌細胞株A549中國科學院上海細胞生物學研究所;枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,批號CMCC63501)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus,批號ATCC25925)、大腸埃希菌(Escherichiacoli,批號ATCC25922)、白色念珠菌(Candidaalbicans,批號CMCC85021) 以上菌株由陜西理工大學陜西省資源生物重點實驗室菌種保藏中心提供,-80 ℃低溫冰箱凍存;DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基) Sigma公司;ABTS(2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽) 上海生物工程有限公司;正己烷、石油醚(60～90 ℃)等 均為國產(chǎn)分析純。

EYELA N100 O型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛郎儀器有限公司;SW-CJ-1D型單人超凈工作臺 上海蘇凈實業(yè)有限公司;YXQ-LS-50S型高壓滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;UV2550型紫外分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 初始提取條件下白及花脂溶性成分的提取 將白及花在烘箱中40 ℃恒溫干燥48 h,干燥至恒重,研磨過40目篩,稱取8 g(M)白及花粉末,用石油醚80 ℃索氏提取,初始提取條件為2.5 h,連續(xù)提取3次,料液比為1∶20 g/mL,減壓回收石油醚,得脂溶性成分樣品,烘箱中40 ℃恒溫干燥至恒重后稱重,記作m,加入正己烷溶解后配成5 mg/mL的白及花脂溶性成分母液(LCBS)備用。利用下列公式計算脂溶性成分得率。

脂溶性成分得率(%)=m×100/M

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 提取時間對脂溶性成分得率的影響 固定反應條件為料液比為1∶20 g/mL,提取次數(shù)為3次,考察不同提取時間(1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 h)對得率的影響。

1.2.2.2 提取次數(shù)對脂溶性成分得率的影響 固定反應條件為料液比為1∶20 g/mL,提取時間為3.5 h,考察不同提取次數(shù)(1、2、3、4、5次)對得率的影響。

1.2.2.3 料液比對脂溶性成分得率的影響 固定反應條件為提取時間為3.5 h,提取次數(shù)為3次,考察不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)對得率的影響。

1.2.3 響應面法試驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理[10],選取提取時間(A)、提取次數(shù)(B)、料液比(C)為變量,以脂溶性成分得率為響應值,每個變量按低、中、高3個水平分別以-1、0、+1進行編碼[11]。試驗因素及水平見表1。

表1 響應面分析因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.4 白及花脂溶性成分的抗菌活性研究 采用濾紙片擴散法[12]研究白及花脂溶性成分對致病菌的抑菌效果,以含20%二甲基亞砜100 μL的紙片作為溶劑陰性對照,以含25 μg/mL青霉素100 μL的紙片作為陽性對照,以0.96%生理鹽水100 μL的紙片為空白對照。利用十字交叉法測量抑菌圈直徑D,抑菌效果(E)按下列公式計算:

E=(D樣品組-D陰性對照組)/(D陽性對照組-D空白對照組)

1.2.5 白及花脂溶性成分的抗腫瘤活性研究 實驗分成陰性對照組、空白組和給藥組,每組設(shè)4個復孔[13];陰性對照組、給藥組加入濃度為5×104cfu/mL人肺腺癌細胞株A549細胞懸液于96孔板中,每孔90 μL細胞懸液;空白組不加細胞加等量培養(yǎng)基;以上各組置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取10 μL用正己烷配制的1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的LCBS溶液加在各給藥組孔板內(nèi),對照組孔板內(nèi)加入正己烷,空白組內(nèi)加入培養(yǎng)基,于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng),分別于24、48、72 h時測定1次[14]。測定時向每孔加入10 μL CCK-8試劑和90 μL無血清培養(yǎng)基,于37 ℃培養(yǎng)1 h,用酶標儀測定各孔OD450值。利用公式計算抑制率:

抑制率(%)=[1-(OD給藥組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)]×100

1.2.6 白及花脂溶性成分的抗氧化活性分析

1.2.6.1 還原能力測定 參考文獻[15],稍作修改,用DMSO將白及花樣品配成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同濃度的樣品溶液,取1 mL樣品,加入1 mL pH6.6磷酸緩沖液,1 mL 1%鐵氰化鉀溶液,混勻后于50 ℃水浴中反應20 min然后加入1 mL 10%三氯乙酸,混勻后取上清液2 mL,加超純水2 mL與200 μL 0.1%三氯化鐵,靜置10 min后,測定OD700,同時將樣品替換成1 mL二甲基亞砜作為空白組,將鐵氰化鉀溶液替換成1 mL去離子水作為對照組,重復3次,取平均值。

1.2.6.2 DPPH自由基清除能力的測定 參考文獻[16],稍作修改,用DMSO將白及花樣品配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同濃度的樣品溶液,取2 mL樣品溶液加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH-99.9%乙醇溶液,混勻,放置在室溫暗處10 min后測定517 nm處吸光值,每樣重復3次,取平均值,并按下列公式計算DPPH自由基去除率。

清除率(%)=[1-(AS-ASB)/(AC-ACB)]×100

式中:AS為2 mL樣品液+1 mL DPPH-乙醇溶液的樣品吸光值;ASB為2 mL樣品液+1 mL 99.9%乙醇溶液的樣品對照組吸光值;AC為2 mL二甲基亞砜+1 mL DPPH-99.9%乙醇溶液的空白組吸光值;ACB為2 mL二甲基亞砜+1 mL 99.9%乙醇溶液的空白對照組吸光值。

1.2.6.3 ABTS自由基清除能力的測定 參考文獻[17],稍作修改,將7 mmol/L的ABTS溶液和2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合,在室溫、避光條件下靜置過夜,形成ABTS儲備液。使用前將ABTS儲備液用99.9%乙醇稀釋(約稀釋50倍),即OD734為0.7±0.02。用DMSO將白及花樣品配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同濃度的樣品溶液,取50 μL樣品溶入1000 μL ABTS工作液,振蕩混合,放置于暗處5 min后測定OD734,每樣重復3次,取平均值,并按下列公式計算 ABTS自由基清除率:

式中:AS為1 mL樣品液+2 mL ABTS工作液的樣品吸光值;ASB為1 mL樣品+2 mL 99.9%乙醇溶液的樣品對照組吸收值;AC為1 mL二甲基亞砜+2 mL ABTS工作液的空白組吸光值;ACB為1 mL二甲基亞砜+2 mL 99.9%乙醇溶液的空白對照組吸光值。

1.2.6.4 羥自由基清除作用 參考文獻[18],稍作修改,用DMSO將白及花樣品配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL溶液,分別加入9 mmol/L FeSO4和9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液各2 mL,最后加1.2 mmol/L H2O22 mL啟動反應,于37 ℃反應30 min,以去離子水調(diào)零在波長510 nm測定樣品濃度吸光度A1;另外,去離子水代替H2O2重復上述操作,測白及樣品本身的吸光值A(chǔ)2,同時以水代替白及花樣品溶液,測定吸光度A0。

羥自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)計算和繪圖用Origin 8.5軟件進行,方差分析和數(shù)據(jù)變異采用Design-Expert 8.0.6、SPSS 21.0軟件進行,比較不同處理間差異采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始提取條件下白及花脂溶性成分得率

由脂溶性成分得率公式可得,在初始提取條件下,白及花脂溶性成分得率為1.102%±0.105%。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 提取時間對脂溶性成分得率的影響 由圖1可知,白及花脂溶性成分得率隨提取時間的增加而增加,提取時間較短時,脂溶性物質(zhì)無法完全溶解出來,得率較低。當提取時間到3.5 h時脂溶性成分得率迅速增加,得率為1.232%,3.5 h后脂溶性成分得率上升趨勢趨于平緩,說明脂溶性物質(zhì)基本溶解完全,故選取最佳提取時間為3.5 h。

圖1 提取時間對白及花脂溶性成分得率的影響Fig.1 Effect of extract time on the yield of liposoluble constituents of B. striata flower

2.2.2 提取次數(shù)對脂溶性成分得率的影響 由圖2可見,白及花的脂溶性成分得率隨次數(shù)的增加呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢,當提取次數(shù)少于3次時,脂溶性成分得率增加較為明顯,當提取次數(shù)達到第3次時得率為1.458%,第3次提取后的得率已經(jīng)基本平穩(wěn),這可能是脂溶性物質(zhì)以充分溶解與溶劑中的緣故,繼續(xù)增加次數(shù)也不會增加得率,故提取次數(shù)選擇最佳為3次。

給夏小凡拍的這張相片，是高志明的最后一張流動攝影作品。1981年初秋，因為未婚妻父親的關(guān)系，高志明終于成為城區(qū)春風照相館的一名正式職工。那些活潑的湖村姑娘，以及他悄悄注目過的少女，夏小凡，如醉湖上的波光，在之后的日子里，隨嶄新的生活和忙碌的工作，漸漸淡去。

圖2 提取次數(shù)對白及花脂溶性成分得率的影響Fig.2 Effect of frequencies on the yield of liposoluble constituents of B. striata flower

2.2.3 料液比對脂溶性成分得率的影響 由圖3可見,隨著溶劑用量的逐漸增大,白及花脂溶性成分得率也隨著上升,料液比達到1∶30 g/mL后,白及花脂溶性成分得率上升速度漸趨緩慢。這主要是由于隨著溶劑用量增加,傳質(zhì)動力增加,白及花脂溶性成分更容易溶出。但在實際實驗過程中,溶劑用量過小時,提取液過少,不利于后續(xù)的過濾分離工作;而溶劑用量過大時,會使后續(xù)的濃縮工藝耗時長、耗能多。故選取料液比1∶30 g/mL為宜。

圖3 料液比對白及花脂溶性成分得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of liposoluble constituents of B. striata flower

2.3 響應面試驗數(shù)據(jù)分析

2.3.1 試驗設(shè)計方案及結(jié)果 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,由Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件設(shè)計出的實驗方案及實驗結(jié)果如表2所示,以脂溶性成分得率為響應值(Y),以提取時間(A)、提取次數(shù)(B)、料液比(C)為自變量,建立3因素3水平中心組合實驗設(shè)計共包括15個實驗方案,其中有3個中心實驗點,用以計算實驗誤差。

表2 響應面分析試驗方案及結(jié)果Table 2 Response surface analysis design and result data

2.3.2 回歸方程擬合及方差分析 采用Design-Expert8.0.6軟件對所得數(shù)據(jù)進行二次回歸分析,分析結(jié)果見表3,對各因素回歸擬合后,得到二次回歸方程如下:

Y=1.35+0.17A+0.15B-0.055C+0.22AB-0.18AC-0.052BC-0.10A2-0.27B2-0.21C2

2.3.3 響應面圖分析 根據(jù)回歸方程繪制白及花脂溶性成分得率隨各因素變化的響應曲面圖[19]。每個響應曲面分別代表著兩個獨立因素間的相互作用,另一個因素保持在編碼水平的0水平[20]。等高線的形狀可以反映出各因素間交互作用的強弱,若等高線為鞍型或橢圓形,表示兩者交互作用顯著;若等高線為圓形,表示兩者交互作用不顯著。

圖4結(jié)果顯示,交互項提取時間和提取次數(shù)的等高線為橢圓形說明兩者交互作用對白及花脂溶性成分得率影響顯著(p<0.05),這與表3方差分析中回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果一致。提取時間的曲面相對于提取次數(shù)較陡,說明提取時間對白及花脂溶性成分得率的影響比提取時間大。

圖4 Y=f(AB)響應面Fig.4 Response surface of Y=f(AB)

表3 回歸方程的方差分析結(jié)果Table 3 Regression analysis data

圖5結(jié)果顯示,交互項提取時間和料液比的等高線為鞍形說明兩者交互作用對白及花脂溶性成分得率影響顯著(p<0.05),這與表3方差分析中回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果一致。提取時間的曲面相對于料液比較陡,說明提取時間對白及花脂溶性成分得率的影響比料液比大。

圖5 Y=f(AC)響應面Fig.5 Response surface of Y=f(AC)

圖6結(jié)果顯示,交互項提取次數(shù)和料液比的等高線為圓形說明兩者交互作用對白及花脂溶性成分得率影響不顯著(p>0.05),這與表3方差分析中回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果一致。提取次數(shù)的曲面相對于料液比較陡,說明提取次數(shù)對白及花脂溶性成分得率的影響比料液比大。

圖6 Y=f(BC)響應面Fig.6 Response surface of Y=f(BC)

圖4～圖6直觀地反映了各因素對響應值的影響,在選取的各因素范圍內(nèi),通過Design-Expert 8.0.6對回歸模型分析得出,白及花脂溶性成分的最佳提取工藝條件為:提取時間2.94 h,提取次數(shù)2次,料液比為1∶40 g/mL。

2.3.4 驗證試驗 在響應面分析得到最佳工藝此條件下,白及花脂溶性成分得率的理論值可達到1.416%。為了驗證響應面分析的可靠性,采用上述最佳工藝參數(shù)進行驗證試驗,用該參數(shù)對樣品進行3次平行實驗,優(yōu)化后白及花脂溶性成分得率的平均值為1.401%±0.112%,相對于初始提取條件下得率提高了28.49%,表明響應回歸方程擬合出的理論值與實際值相吻合,證明了該回歸方程的可靠性,為后續(xù)的實驗提供了優(yōu)化條件。

2.4 白及花脂溶性成分生物活性研究結(jié)果分析

2.4.1 白及花脂溶性成分抗菌活性分析 白及花脂溶性成分對Bacillussubtilis、Staphyloccocusaureus、Escherichiacoli和Candidaalbicans均有抑制作用,抑菌圈的大小為13～20 mm(見表4)。上述研究表明,白及花脂溶性成分對大腸埃希菌的抑制作用最強,其次為枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌,對銅綠假單胞菌無抑制作用,說明白及花脂溶性成分具有潛在的藥用價值。

表4 白及花脂溶性成分抗菌活性分析Table 4 Antibacterial activity analysis of liposoluble constituents of B. striata flower

2.4.2 白及花脂溶性成分的抗腫瘤活性分析 如圖7所示,當LCBS的濃度小于1.0 mg/mL時,細胞抑制率小于5%,而當大于1.0 mg/mL時,抑制率迅速變大,當濃度為5 mg/mL時,最高抑制率為32.115%,且隨著時間的延長抑制率也在變大?？梢娫诩尤氩煌瑵舛萀CBS溶液后,A549細胞抑制率均隨著LCBS濃度增大而逐漸變大,而在同一濃度水平隨著給藥時間的延長,抑制率也隨著增加?？梢奓CBS對A549細胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量效應和時間效應關(guān)系。

圖7 白及花脂溶性成分對A549細胞增殖的抑制率Fig.7 Inhibitory effects of liposoluble constituents of B. striata flower on proliferation of A549 cells

2.4.3 白及花脂溶性成分的抗氧化活性分析

2.4.3.1 還原能力測定 由圖8可知,白及花脂溶性成分具有一定的還原能力,且隨質(zhì)量濃度的升高而逐漸增大,但整體數(shù)值變化范圍較小,濃度為1.0 mg/mL時,OD700吸光值為0.15,這可能是因為所提取的白及花脂溶性成分為混合物,純度低,雜質(zhì)較多,影響了其活性。

圖8 白及花脂溶性成分的還原能力Fig.8 Reducing power of liposoluble constituents of B. striata flower

2.4.3.2 DPPH自由基清除能力的測定 由圖9可知,白及花脂溶性成分具有一定的DPPH自由基清除能力,0.1～1.0 mg/mL內(nèi),隨著質(zhì)量濃度的增加,DPPH自由基清除能力不斷增強,呈現(xiàn)良好的劑量效應關(guān)系。白及花脂溶性成分的DPPH自由基清除率回歸方程為y=29.679x+1.5061(R2=0.9973),EC50為1.63 mg/mL,一般認為某種物質(zhì)的EC50值低于10 mg/mL,表明其具有較好的抗氧化性[21],因此白及花中的脂溶性成分具有較強的DPPH自由基清除能力。

圖9 白及花脂溶性成分對DPPH自由基的清除率Fig.9 Scavenging rate of liposoluble constituents of B. striata flower on DPPH free radical

2.4.3.3 ABTS自由基清除能力的測定 由圖10可知,白及花脂溶性成分具有較強的ABTS自由基清除能力,脂溶性成分對ABTS 自由基清除率隨著其質(zhì)量濃度的增加而隨之增加,成正比例關(guān)系。白及花脂溶性成分的ABTS自由基清除率回歸方程為y=78.493x+12.846(R2=0.9965),EC50為0.47 mg/mL說明白及花脂溶性成分具有較強的ABTS自由基清除能力。

圖10 白及花脂溶性成分對ABTS自由基在清除作用 Fig.10 Scavenging rate of liposoluble constituents of B. striata flower on ABTS free radical

2.4.3.4 羥自由基清除作用 由圖11可知,白及花脂溶性成分具有明顯的清除羥自由基作用且隨著質(zhì)量濃度的增加,對羥自由基的清除能力也逐漸增強。當濃度小于0.2 mg/mL時,白及花脂溶性成分羥自由基清除能力較小,當大于0.2 mg/mL時表現(xiàn)出較強的羥自由基清除能力,羥自由基清除率回歸方程為y=41.76x-2.4184(R2=0.9922),EC50為1.25 mg/mL,表明低濃度的白及花脂溶性成分羥自由基清除作用較小,而高濃度的脂溶性成分對羥自由基有較強的清除作用,在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)具有劑量效應關(guān)系。

圖11 白及花脂溶性成分對羥自由基的清除率Fig.11 Scavenging activity against hydroxyl free radical of liposoluble constituents of flower of B. striata

3 結(jié)論

采用Box-Behnken設(shè)計對白及花脂溶性成分得率的提取工藝進行優(yōu)化,建立了脂溶性成分得率回歸模型,由該模型優(yōu)化的提取條件為:提取時間2.94 h,提取次數(shù)2次,料液比為1∶40 (g/mL),脂溶性成分得率的理論值可達到1.416%。在此條件下,通過驗證試驗測得最佳提取工藝條件下脂溶性成分得率為1.401%±0.112%,相對于初始提取條件下得率提高了28.49%,與模型預測結(jié)果相近,進一步驗證了模型的可靠性,證明本實驗優(yōu)化的結(jié)果,具有實際意義。

對白及花脂溶性成分生物活性的研究結(jié)果表明,白及花脂溶性成分對Bacillussubtilis、Staphyloccocusaureus、Escherichiacoli和Candidaalbicans均有明顯抑制作用,并且對A549細胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量效應和時間效應關(guān)系。白及花脂溶性成分具有一定的還原能力和DPPH、ABTS、羥自由基清除能力,EC50分別為1.63、0.47和1.25 mg/mL,且隨質(zhì)量濃度的升高而逐漸增大,說明白及花脂溶性成分對ABTS自由基的清除率大于對DPPH自由基和羥自由基的清除率。由此可見,白及花脂溶性成分具有抑菌、抗腫瘤和抗氧化活性,證明其具有潛在的藥用價值。