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(1.陜西理工大學(xué),陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心,陜西漢中 723001; 2.陜西理工大學(xué),生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西漢中 723001)

白及(Bletillastriata),蘭科白及屬,是多年生草本,主產(chǎn)于貴州、四川、湖南、湖北等省?！度杖A子本草》中記載,“白及止驚邪、血邪,刀箭瘡撲損,溫?zé)岑懠?血痢,湯火瘡,生肌止痛,風(fēng)痹”[1]。研究表明,白及中含有甾類、萜類、多糖、聯(lián)菲、聯(lián)芐類以及酯類等上百種活性化合物[2]。

目前對(duì)白及的研究主要集中于其組培技術(shù)[3]、中藥配伍與炮制[4]、塊莖中多糖膠的活性和藥物開(kāi)發(fā)[5],而對(duì)白及花的研究主要集中于其花青素、多糖、黃酮類等活性物質(zhì),而對(duì)其脂溶性成分的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。黃進(jìn)等[6]研究了6種不同干燥方法對(duì)白及花中花青素、多糖、總黃酮和總酚的含量和抗氧化活性的影響。呂婉婉等[7]研究了白及花中花青素的含量及其抗氧化活性,為制作白及花飲品奠定了基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)多種藥用植物中脂溶性成分具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化和降血糖等生物活性。Liang[8]研究發(fā)現(xiàn)巨大蒲公英根中脂溶性成分具有抑菌和體外抗氧活性,Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)從無(wú)花果脂溶性成分中分離的β-谷甾醇具有較高的抗腫瘤活性。脂溶性成分作為白及花中一類重要化合物,優(yōu)化其提取工藝,研究其生物活性對(duì)充分開(kāi)發(fā)利用其藥用資源有重要意義。

本研究采用索氏提取法對(duì)白及花中脂溶性成分進(jìn)行提取,采用Box-Behnken設(shè)計(jì)分析對(duì)脂溶性成分提取工藝影響較大的三個(gè)因素即提取時(shí)間、提取次數(shù)和料液比進(jìn)行優(yōu)化,確定最優(yōu)方案并驗(yàn)證,擬獲得經(jīng)濟(jì)、科學(xué)的提取條件。采用濾紙片擴(kuò)散法對(duì)脂溶性成分抑菌活性進(jìn)行研究,采用CCK-8法對(duì)脂溶性成分抗腫瘤活性進(jìn)行研究,并采用DPPH法、ABTS法和Fenton法考察其抗氧化活性,以期通過(guò)本研究為白及花的深入研究和綜合開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白及(Bletillastriata)花 采自陜西省漢中市漢臺(tái)區(qū)漢王鎮(zhèn)(北緯N33°04′10″ 東經(jīng)E107°01′38″),將其曬干后備用;人肺腺癌細(xì)胞株A549中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所;枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,批號(hào)CMCC63501)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus,批號(hào)ATCC25925)、大腸埃希菌(Escherichiacoli,批號(hào)ATCC25922)、白色念珠菌(Candidaalbicans,批號(hào)CMCC85021) 以上菌株由陜西理工大學(xué)陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心提供,-80 ℃低溫冰箱凍存;DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基) Sigma公司;ABTS(2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽) 上海生物工程有限公司;正己烷、石油醚(60～90 ℃)等 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

EYELA N100 O型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛(ài)郎儀器有限公司;SW-CJ-1D型單人超凈工作臺(tái) 上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司;YXQ-LS-50S型高壓滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;UV2550型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 初始提取條件下白及花脂溶性成分的提取 將白及花在烘箱中40 ℃恒溫干燥48 h,干燥至恒重,研磨過(guò)40目篩,稱取8 g(M)白及花粉末,用石油醚80 ℃索氏提取,初始提取條件為2.5 h,連續(xù)提取3次,料液比為1∶20 g/mL,減壓回收石油醚,得脂溶性成分樣品,烘箱中40 ℃恒溫干燥至恒重后稱重,記作m,加入正己烷溶解后配成5 mg/mL的白及花脂溶性成分母液(LCBS)備用。利用下列公式計(jì)算脂溶性成分得率。

脂溶性成分得率(%)=m×100/M

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 提取時(shí)間對(duì)脂溶性成分得率的影響 固定反應(yīng)條件為料液比為1∶20 g/mL,提取次數(shù)為3次,考察不同提取時(shí)間(1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 h)對(duì)得率的影響。

1.2.2.2 提取次數(shù)對(duì)脂溶性成分得率的影響 固定反應(yīng)條件為料液比為1∶20 g/mL,提取時(shí)間為3.5 h,考察不同提取次數(shù)(1、2、3、4、5次)對(duì)得率的影響。

1.2.2.3 料液比對(duì)脂溶性成分得率的影響 固定反應(yīng)條件為提取時(shí)間為3.5 h,提取次數(shù)為3次,考察不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)對(duì)得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面法試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[10],選取提取時(shí)間(A)、提取次數(shù)(B)、料液比(C)為變量,以脂溶性成分得率為響應(yīng)值,每個(gè)變量按低、中、高3個(gè)水平分別以-1、0、+1進(jìn)行編碼[11]。試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.4 白及花脂溶性成分的抗菌活性研究 采用濾紙片擴(kuò)散法[12]研究白及花脂溶性成分對(duì)致病菌的抑菌效果,以含20%二甲基亞砜100 μL的紙片作為溶劑陰性對(duì)照,以含25 μg/mL青霉素100 μL的紙片作為陽(yáng)性對(duì)照,以0.96%生理鹽水100 μL的紙片為空白對(duì)照。利用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑D,抑菌效果(E)按下列公式計(jì)算:

E=(D樣品組-D陰性對(duì)照組)/(D陽(yáng)性對(duì)照組-D空白對(duì)照組)

1.2.5 白及花脂溶性成分的抗腫瘤活性研究 實(shí)驗(yàn)分成陰性對(duì)照組、空白組和給藥組,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔[13];陰性對(duì)照組、給藥組加入濃度為5×104cfu/mL人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞懸液于96孔板中,每孔90 μL細(xì)胞懸液;空白組不加細(xì)胞加等量培養(yǎng)基;以上各組置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取10 μL用正己烷配制的1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的LCBS溶液加在各給藥組孔板內(nèi),對(duì)照組孔板內(nèi)加入正己烷,空白組內(nèi)加入培養(yǎng)基,于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng),分別于24、48、72 h時(shí)測(cè)定1次[14]。測(cè)定時(shí)向每孔加入10 μL CCK-8試劑和90 μL無(wú)血清培養(yǎng)基,于37 ℃培養(yǎng)1 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD450值。利用公式計(jì)算抑制率:

抑制率(%)=[1-(OD給藥組-OD空白組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)]×100

1.2.6 白及花脂溶性成分的抗氧化活性分析

1.2.6.1 還原能力測(cè)定 參考文獻(xiàn)[15],稍作修改,用DMSO將白及花樣品配成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同濃度的樣品溶液,取1 mL樣品,加入1 mL pH6.6磷酸緩沖液,1 mL 1%鐵氰化鉀溶液,混勻后于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min然后加入1 mL 10%三氯乙酸,混勻后取上清液2 mL,加超純水2 mL與200 μL 0.1%三氯化鐵,靜置10 min后,測(cè)定OD700,同時(shí)將樣品替換成1 mL二甲基亞砜作為空白組,將鐵氰化鉀溶液替換成1 mL去離子水作為對(duì)照組,重復(fù)3次,取平均值。

1.2.6.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[16],稍作修改,用DMSO將白及花樣品配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同濃度的樣品溶液,取2 mL樣品溶液加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH-99.9%乙醇溶液,混勻,放置在室溫暗處10 min后測(cè)定517 nm處吸光值,每樣重復(fù)3次,取平均值,并按下列公式計(jì)算DPPH自由基去除率。

清除率(%)=[1-(AS-ASB)/(AC-ACB)]×100

式中:AS為2 mL樣品液+1 mL DPPH-乙醇溶液的樣品吸光值;ASB為2 mL樣品液+1 mL 99.9%乙醇溶液的樣品對(duì)照組吸光值;AC為2 mL二甲基亞砜+1 mL DPPH-99.9%乙醇溶液的空白組吸光值;ACB為2 mL二甲基亞砜+1 mL 99.9%乙醇溶液的空白對(duì)照組吸光值。

1.2.6.3 ABTS自由基清除能力的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[17],稍作修改,將7 mmol/L的ABTS溶液和2.45 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液等體積混合,在室溫、避光條件下靜置過(guò)夜,形成ABTS儲(chǔ)備液。使用前將ABTS儲(chǔ)備液用99.9%乙醇稀釋(約稀釋50倍),即OD734為0.7±0.02。用DMSO將白及花樣品配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同濃度的樣品溶液,取50 μL樣品溶入1000 μL ABTS工作液,振蕩混合,放置于暗處5 min后測(cè)定OD734,每樣重復(fù)3次,取平均值,并按下列公式計(jì)算 ABTS自由基清除率:

式中:AS為1 mL樣品液+2 mL ABTS工作液的樣品吸光值;ASB為1 mL樣品+2 mL 99.9%乙醇溶液的樣品對(duì)照組吸收值;AC為1 mL二甲基亞砜+2 mL ABTS工作液的空白組吸光值;ACB為1 mL二甲基亞砜+2 mL 99.9%乙醇溶液的空白對(duì)照組吸光值。

1.2.6.4 羥自由基清除作用 參考文獻(xiàn)[18],稍作修改,用DMSO將白及花樣品配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL溶液,分別加入9 mmol/L FeSO4和9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液各2 mL,最后加1.2 mmol/L H2O22 mL啟動(dòng)反應(yīng),于37 ℃反應(yīng)30 min,以去離子水調(diào)零在波長(zhǎng)510 nm測(cè)定樣品濃度吸光度A1;另外,去離子水代替H2O2重復(fù)上述操作,測(cè)白及樣品本身的吸光值A(chǔ)2,同時(shí)以水代替白及花樣品溶液,測(cè)定吸光度A0。

羥自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)計(jì)算和繪圖用Origin 8.5軟件進(jìn)行,方差分析和數(shù)據(jù)變異采用Design-Expert 8.0.6、SPSS 21.0軟件進(jìn)行,比較不同處理間差異采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始提取條件下白及花脂溶性成分得率

由脂溶性成分得率公式可得,在初始提取條件下,白及花脂溶性成分得率為1.102%±0.105%。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取時(shí)間對(duì)脂溶性成分得率的影響 由圖1可知,白及花脂溶性成分得率隨提取時(shí)間的增加而增加,提取時(shí)間較短時(shí),脂溶性物質(zhì)無(wú)法完全溶解出來(lái),得率較低。當(dāng)提取時(shí)間到3.5 h時(shí)脂溶性成分得率迅速增加,得率為1.232%,3.5 h后脂溶性成分得率上升趨勢(shì)趨于平緩,說(shuō)明脂溶性物質(zhì)基本溶解完全,故選取最佳提取時(shí)間為3.5 h。

圖1 提取時(shí)間對(duì)白及花脂溶性成分得率的影響Fig.1 Effect of extract time on the yield of liposoluble constituents of B. striata flower

2.2.2 提取次數(shù)對(duì)脂溶性成分得率的影響 由圖2可見(jiàn),白及花的脂溶性成分得率隨次數(shù)的增加呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì),當(dāng)提取次數(shù)少于3次時(shí),脂溶性成分得率增加較為明顯,當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到第3次時(shí)得率為1.458%,第3次提取后的得率已經(jīng)基本平穩(wěn),這可能是脂溶性物質(zhì)以充分溶解與溶劑中的緣故,繼續(xù)增加次數(shù)也不會(huì)增加得率,故提取次數(shù)選擇最佳為3次。

給夏小凡拍的這張相片，是高志明的最后一張流動(dòng)攝影作品。1981年初秋，因?yàn)槲椿槠薷赣H的關(guān)系，高志明終于成為城區(qū)春風(fēng)照相館的一名正式職工。那些活潑的湖村姑娘，以及他悄悄注目過(guò)的少女，夏小凡，如醉湖上的波光，在之后的日子里，隨嶄新的生活和忙碌的工作，漸漸淡去。

圖2 提取次數(shù)對(duì)白及花脂溶性成分得率的影響Fig.2 Effect of frequencies on the yield of liposoluble constituents of B. striata flower

2.2.3 料液比對(duì)脂溶性成分得率的影響 由圖3可見(jiàn),隨著溶劑用量的逐漸增大,白及花脂溶性成分得率也隨著上升,料液比達(dá)到1∶30 g/mL后,白及花脂溶性成分得率上升速度漸趨緩慢。這主要是由于隨著溶劑用量增加,傳質(zhì)動(dòng)力增加,白及花脂溶性成分更容易溶出。但在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,溶劑用量過(guò)小時(shí),提取液過(guò)少,不利于后續(xù)的過(guò)濾分離工作;而溶劑用量過(guò)大時(shí),會(huì)使后續(xù)的濃縮工藝耗時(shí)長(zhǎng)、耗能多。故選取料液比1∶30 g/mL為宜。

圖3 料液比對(duì)白及花脂溶性成分得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of liposoluble constituents of B. striata flower

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,由Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件設(shè)計(jì)出的實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示,以脂溶性成分得率為響應(yīng)值(Y),以提取時(shí)間(A)、提取次數(shù)(B)、料液比(C)為自變量,建立3因素3水平中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)共包括15個(gè)實(shí)驗(yàn)方案,其中有3個(gè)中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn),用以計(jì)算實(shí)驗(yàn)誤差。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Response surface analysis design and result data

2.3.2 回歸方程擬合及方差分析 采用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析,分析結(jié)果見(jiàn)表3,對(duì)各因素回歸擬合后,得到二次回歸方程如下:

Y=1.35+0.17A+0.15B-0.055C+0.22AB-0.18AC-0.052BC-0.10A2-0.27B2-0.21C2

2.3.3 響應(yīng)面圖分析 根據(jù)回歸方程繪制白及花脂溶性成分得率隨各因素變化的響應(yīng)曲面圖[19]。每個(gè)響應(yīng)曲面分別代表著兩個(gè)獨(dú)立因素間的相互作用,另一個(gè)因素保持在編碼水平的0水平[20]。等高線的形狀可以反映出各因素間交互作用的強(qiáng)弱,若等高線為鞍型或橢圓形,表示兩者交互作用顯著;若等高線為圓形,表示兩者交互作用不顯著。

圖4結(jié)果顯示,交互項(xiàng)提取時(shí)間和提取次數(shù)的等高線為橢圓形說(shuō)明兩者交互作用對(duì)白及花脂溶性成分得率影響顯著(p<0.05),這與表3方差分析中回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致。提取時(shí)間的曲面相對(duì)于提取次數(shù)較陡,說(shuō)明提取時(shí)間對(duì)白及花脂溶性成分得率的影響比提取時(shí)間大。

圖4 Y=f(AB)響應(yīng)面Fig.4 Response surface of Y=f(AB)

表3 回歸方程的方差分析結(jié)果Table 3 Regression analysis data

圖5結(jié)果顯示,交互項(xiàng)提取時(shí)間和料液比的等高線為鞍形說(shuō)明兩者交互作用對(duì)白及花脂溶性成分得率影響顯著(p<0.05),這與表3方差分析中回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致。提取時(shí)間的曲面相對(duì)于料液比較陡,說(shuō)明提取時(shí)間對(duì)白及花脂溶性成分得率的影響比料液比大。

圖5 Y=f(AC)響應(yīng)面Fig.5 Response surface of Y=f(AC)

圖6結(jié)果顯示,交互項(xiàng)提取次數(shù)和料液比的等高線為圓形說(shuō)明兩者交互作用對(duì)白及花脂溶性成分得率影響不顯著(p>0.05),這與表3方差分析中回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致。提取次數(shù)的曲面相對(duì)于料液比較陡,說(shuō)明提取次數(shù)對(duì)白及花脂溶性成分得率的影響比料液比大。

圖6 Y=f(BC)響應(yīng)面Fig.6 Response surface of Y=f(BC)

圖4～圖6直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響,在選取的各因素范圍內(nèi),通過(guò)Design-Expert 8.0.6對(duì)回歸模型分析得出,白及花脂溶性成分的最佳提取工藝條件為:提取時(shí)間2.94 h,提取次數(shù)2次,料液比為1∶40 g/mL。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 在響應(yīng)面分析得到最佳工藝此條件下,白及花脂溶性成分得率的理論值可達(dá)到1.416%。為了驗(yàn)證響應(yīng)面分析的可靠性,采用上述最佳工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),用該參數(shù)對(duì)樣品進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),優(yōu)化后白及花脂溶性成分得率的平均值為1.401%±0.112%,相對(duì)于初始提取條件下得率提高了28.49%,表明響應(yīng)回歸方程擬合出的理論值與實(shí)際值相吻合,證明了該回歸方程的可靠性,為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供了優(yōu)化條件。

2.4 白及花脂溶性成分生物活性研究結(jié)果分析

2.4.1 白及花脂溶性成分抗菌活性分析 白及花脂溶性成分對(duì)Bacillussubtilis、Staphyloccocusaureus、Escherichiacoli和Candidaalbicans均有抑制作用,抑菌圈的大小為13～20 mm(見(jiàn)表4)。上述研究表明,白及花脂溶性成分對(duì)大腸埃希菌的抑制作用最強(qiáng),其次為枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌,對(duì)銅綠假單胞菌無(wú)抑制作用,說(shuō)明白及花脂溶性成分具有潛在的藥用價(jià)值。

表4 白及花脂溶性成分抗菌活性分析Table 4 Antibacterial activity analysis of liposoluble constituents of B. striata flower

2.4.2 白及花脂溶性成分的抗腫瘤活性分析 如圖7所示,當(dāng)LCBS的濃度小于1.0 mg/mL時(shí),細(xì)胞抑制率小于5%,而當(dāng)大于1.0 mg/mL時(shí),抑制率迅速變大,當(dāng)濃度為5 mg/mL時(shí),最高抑制率為32.115%,且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)抑制率也在變大?？梢?jiàn)在加入不同濃度LCBS溶液后,A549細(xì)胞抑制率均隨著LCBS濃度增大而逐漸變大,而在同一濃度水平隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng),抑制率也隨著增加?？梢?jiàn)LCBS對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。

圖7 白及花脂溶性成分對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制率Fig.7 Inhibitory effects of liposoluble constituents of B. striata flower on proliferation of A549 cells

2.4.3 白及花脂溶性成分的抗氧化活性分析

2.4.3.1 還原能力測(cè)定 由圖8可知,白及花脂溶性成分具有一定的還原能力,且隨質(zhì)量濃度的升高而逐漸增大,但整體數(shù)值變化范圍較小,濃度為1.0 mg/mL時(shí),OD700吸光值為0.15,這可能是因?yàn)樗崛〉陌准盎ㄖ苄猿煞譃榛旌衔?純度低,雜質(zhì)較多,影響了其活性。

圖8 白及花脂溶性成分的還原能力Fig.8 Reducing power of liposoluble constituents of B. striata flower

2.4.3.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 由圖9可知,白及花脂溶性成分具有一定的DPPH自由基清除能力,0.1～1.0 mg/mL內(nèi),隨著質(zhì)量濃度的增加,DPPH自由基清除能力不斷增強(qiáng),呈現(xiàn)良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。白及花脂溶性成分的DPPH自由基清除率回歸方程為y=29.679x+1.5061(R2=0.9973),EC50為1.63 mg/mL,一般認(rèn)為某種物質(zhì)的EC50值低于10 mg/mL,表明其具有較好的抗氧化性[21],因此白及花中的脂溶性成分具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

圖9 白及花脂溶性成分對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.9 Scavenging rate of liposoluble constituents of B. striata flower on DPPH free radical

2.4.3.3 ABTS自由基清除能力的測(cè)定 由圖10可知,白及花脂溶性成分具有較強(qiáng)的ABTS自由基清除能力,脂溶性成分對(duì)ABTS 自由基清除率隨著其質(zhì)量濃度的增加而隨之增加,成正比例關(guān)系。白及花脂溶性成分的ABTS自由基清除率回歸方程為y=78.493x+12.846(R2=0.9965),EC50為0.47 mg/mL說(shuō)明白及花脂溶性成分具有較強(qiáng)的ABTS自由基清除能力。

圖10 白及花脂溶性成分對(duì)ABTS自由基在清除作用 Fig.10 Scavenging rate of liposoluble constituents of B. striata flower on ABTS free radical

2.4.3.4 羥自由基清除作用 由圖11可知,白及花脂溶性成分具有明顯的清除羥自由基作用且隨著質(zhì)量濃度的增加,對(duì)羥自由基的清除能力也逐漸增強(qiáng)。當(dāng)濃度小于0.2 mg/mL時(shí),白及花脂溶性成分羥自由基清除能力較小,當(dāng)大于0.2 mg/mL時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的羥自由基清除能力,羥自由基清除率回歸方程為y=41.76x-2.4184(R2=0.9922),EC50為1.25 mg/mL,表明低濃度的白及花脂溶性成分羥自由基清除作用較小,而高濃度的脂溶性成分對(duì)羥自由基有較強(qiáng)的清除作用,在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)具有劑量效應(yīng)關(guān)系。

圖11 白及花脂溶性成分對(duì)羥自由基的清除率Fig.11 Scavenging activity against hydroxyl free radical of liposoluble constituents of flower of B. striata

3 結(jié)論

采用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)白及花脂溶性成分得率的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,建立了脂溶性成分得率回歸模型,由該模型優(yōu)化的提取條件為:提取時(shí)間2.94 h,提取次數(shù)2次,料液比為1∶40 (g/mL),脂溶性成分得率的理論值可達(dá)到1.416%。在此條件下,通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得最佳提取工藝條件下脂溶性成分得率為1.401%±0.112%,相對(duì)于初始提取條件下得率提高了28.49%,與模型預(yù)測(cè)結(jié)果相近,進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的可靠性,證明本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的結(jié)果,具有實(shí)際意義。

對(duì)白及花脂溶性成分生物活性的研究結(jié)果表明,白及花脂溶性成分對(duì)Bacillussubtilis、Staphyloccocusaureus、Escherichiacoli和Candidaalbicans均有明顯抑制作用,并且對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。白及花脂溶性成分具有一定的還原能力和DPPH、ABTS、羥自由基清除能力,EC50分別為1.63、0.47和1.25 mg/mL,且隨質(zhì)量濃度的升高而逐漸增大,說(shuō)明白及花脂溶性成分對(duì)ABTS自由基的清除率大于對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除率。由此可見(jiàn),白及花脂溶性成分具有抑菌、抗腫瘤和抗氧化活性,證明其具有潛在的藥用價(jià)值。