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(寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞工程技術(shù)研究所,寧夏銀川 750002)

枸杞(LyciumbarbarumL.)是傳統(tǒng)的藥食兩用植物,傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認為枸杞具有“滋肝明目,清肺補腎”之功效,現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)證明枸杞具有“抗氧化、抗腫瘤、延緩衰老、增強免疫力、軟化血管、降低血脂”等功效[1-3]。類胡蘿卜素是枸杞中主要的功效成分之一,枸杞中約含有十種,除少量的玉米黃素和β胡蘿卜素外,97%以上的類胡蘿卜素都是以酯化形式存在[2],其中僅玉米黃素雙棕櫚酸酯的含量就達到80%[4]。

玉米黃素雙棕櫚酸酯(zeaxanthin dipalmitate,以下簡稱ZDP),玉米黃素的脂肪酸形式,脂溶性的聚異戊二烯類化合物。研究發(fā)現(xiàn),ZDP具有很強的肝臟保護作用,可以緩解由CCl4引起的Kupffer細胞炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷和繼發(fā)性膽汁淤積性肝纖維化損傷[4-7]。但是,人體自身無法合成此類功效物質(zhì),必須通過膳食進行補充,并且需要輔以油脂或脂肪代謝提高吸收率,再加上ZDP不溶于水,造成人體細胞很難吸收,生物利用度低。

納米脂質(zhì)體(liposome)是兩親分子在水中自發(fā)形成的、由雙分子膜包裹的球狀小囊,粒徑在幾十到幾千毫米之間[8]。報道指出,番茄紅素脂質(zhì)體的相對生物利用率顯著高于油溶番茄紅素[9]。葉黃素和玉米黃素制成納米脂質(zhì)體,不僅其結(jié)構(gòu)性能大大改善,熱穩(wěn)定性以及抗氧化活性都有顯著的提高[10-11]。食品級脂質(zhì)體用于營養(yǎng)因子及功能成分的包埋和運載具有無毒、雙親性和生物可降解等特點,能提高功能性營養(yǎng)物質(zhì)在貯藏和消化過程中的穩(wěn)定性和生物利用度;控制被包埋物質(zhì)的定點、定時釋放以及改善食品質(zhì)構(gòu)[12-13]。構(gòu)建合適的輸送載體,即納米脂質(zhì)體,是解決玉米黃素雙棕櫚酸酯溶解性、穩(wěn)定性和生物利用度的有效途徑之一。因此,本文采用超聲法制備枸杞玉米黃素雙棕櫚酸酯納米脂質(zhì)體,并通過其對DPPH自由基清除力、還原力和抗脂質(zhì)過氧化能力的影響研究了其體外抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞子 寧夏農(nóng)林科學(xué)院園林場基地;甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚 色譜純,Fisher chemical有限公司;二氯甲烷 色譜純,Mreda technology有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) Sigma-Aldrich有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

TU-1810型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;HH·SY21-Ni型電熱恒溫水浴鍋 北京長源實驗設(shè)備廠;SHZ-D(III)型循環(huán)水式多用真空泵 天津華鑫儀器廠;BS224S型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;HA220-40-48型超臨界萃取裝置 南通儀創(chuàng)實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米黃素雙棕櫚酸酯的制備 將枸杞子去除壞果、雜質(zhì),取約6～8倍體積的50 ℃水浸泡1 h并瀝水,再重復(fù)浸泡2次后將枸杞用45 ℃熱風(fēng)烘干,超微粉碎并進行超臨界萃取,萃取溫度(40±5) ℃、壓力為(27±1) MPa、CO2流量(335±35) L/h,萃取開始0.5 h后收集萃取物,萃取時長3 h,所得的提取物用二氯甲烷溶解后經(jīng)HPLC分析,HPLC分析方法同參考文獻[14]。

1.2.2 ZDP納米脂質(zhì)體的制備 采用譚晨[15]的方法,稱取一定量的卵磷脂、吐溫80、ZDP及膽固醇至圓底燒瓶中,加入6 mL CHCl3,50 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至形成均勻的薄膜,加入0.2 mol/L PBS緩沖液旋轉(zhuǎn)水化至完全溶解后超聲處理2 min即制成了ZDP脂質(zhì)體。

1.2.3 單因素實驗 采用1.2.2方法制備ZDP納米脂質(zhì)體,制備方法為:固定膽固醇∶卵磷脂=1∶4,吐溫80∶卵磷脂=3∶10,PBS pH=7.0。考察不同ZDP∶卵磷脂(1∶2、1∶4、1∶5、1∶6、1∶8)對包封率的影響;固定ZDP∶卵磷脂=1∶5,吐溫80∶卵磷脂=3∶10,PBS pH=7.0,考察不同膽固醇∶卵磷脂(1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6)對包封率的影響;固定膽固醇∶卵磷脂=1∶4,ZDP∶卵磷脂=1∶5,PBS pH=7.0,考察不同吐溫80∶卵磷脂(1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10)對包封率的影響;固定膽固醇∶卵磷脂=1∶4,ZDP∶卵磷脂=1∶5,吐溫80∶卵磷脂=3∶10,考察不同PBS緩沖液pH(6.6、6.8、7.0、7.2、7.4)對包封率的影響。進行單因素實驗,考察各因素變量對ZDP脂質(zhì)體包封率的影響。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取200.00 mg ZDP,用石油醚溶解配制成不同濃度的ZDP標(biāo)準(zhǔn)液,測A450 nm,制作線性方程為y=0.1027x+0.029,(x為濃度,y為A450 nm)R2=0.9992,濃度范圍:0.5～5.0 mg/mL。

1.2.5 包封率的測定 1 mL ZDP納米脂質(zhì)體中加3 mL石油醚,混勻后離心并收集上清液(3000 r/min,3 min),重復(fù)2次后合并上清液并用石油醚定容至9 mL,測量A450 nm,并根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計算上清液中ZDP的濃度C(mg/mL),再根據(jù)下式計算包封率[16]。

其中,M為ZDP的添加量,mg;V為脂質(zhì)體懸浮液的總體積,mL。

1.2.6 正交試驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上,選用四因素三水平設(shè)計正交試驗,考察包封率,所采用的因素和水平見表1。

表1 L9(34)正交實驗設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of L9(34)orthogonal experiment list

1.2.7 脂質(zhì)體抗氧化活性評價

包封率是評價納米脂質(zhì)體質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，為了考察ZDP脂質(zhì)體的包封率對抗氧化活性的影響，固定膽固醇、ZDP和卵磷脂的用量，改變PBS的pH(6.6、6.8、7.0、7.2、7.4)制成不同包封率的脂質(zhì)體，并測定其抗氧化活性。

1.2.7.1 DPPH自由基清除力 參考文獻[17]方法略作改進,準(zhǔn)確吸1 mL 樣品(類胡蘿卜素脂質(zhì)體、ZDP-空白脂質(zhì)體混懸液)加入3 mL DPPH乙醇溶液(0.14 mmol/L)均勻混合,在暗處反應(yīng)40 min后離心(3000 r/min,40 min),取上清液測其吸光值A(chǔ)t(λ=525 nm)?？瞻讟游庵礎(chǔ)c以PBS緩沖液代替樣品測得,以乙醇代替 DPPH測得對照吸光值A(chǔ)b。

1.2.7.2 還原力 參考文獻[18]方法略作改進。取1 mL樣品(ZDP脂質(zhì)體、ZDP-空白脂質(zhì)體混懸液),加1 mL K3[Fe(CN)6](2.5% w/v),混合后于50 ℃水浴反應(yīng)20 min。快速冷卻后加入5 mL TCA(10% w/v),充分混勻并過濾。取濾出液2 mL,加入2 mL 蒸餾水和0.5 mL FeCl3(0.1% w/v),混勻后靜置反應(yīng)15 min測A700 nm。

1.2.7.3 抗脂質(zhì)過氧化能力 采用硫代巴比妥酸法(TBARS),通過測定體系中與硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)的底物丙二醛(MDA)的變化可以反映測試物的抗脂質(zhì)過氧化能力[19-20]。TBA-TCA-HCl溶液的配制:取三氯乙酸(TCA)37.5 g、硫代巴比妥酸(TBA)0.925 g、濃HCl 4.45 mL溶于去離子水,80 ℃水浴并不斷攪拌使其充分溶解,冷卻后用去離子水定容至250 mL,過濾備用。ZDP脂質(zhì)體抗 Fe3+/VC誘導(dǎo)的脂質(zhì)體過氧化能力的評價:在樣品管中依次加入 1.5 mL樣品(ZDP脂質(zhì)體、類胡蘿卜素-空白納米脂質(zhì)體混懸液)、0.5 mL三氯化鐵溶液(400 μmol/L)和0.5 mL抗壞血酸(400 μmol/L),混勻。于 37 ℃避光水浴 60 min,隨后加入1 mL TCA-TBA-HCl混合液,100 ℃沸水浴10 min,迅速冰浴冷卻,離心過濾(10000 r/min,3 min),取上清液在535 nm測吸光值A(chǔ)s。空白管則以0.5 mL去離子水分別代替三氯化鐵溶液和抗壞血酸,操作方法同樣品管,測得吸光值A(chǔ)c。計算公式如下:

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,對3次平行實驗的結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZDP的HPLC分析結(jié)果

圖1為ZDP的HPLC分析結(jié)果,其中ZDP的峰面積含量占比>80%,說明ZDP具有較高的純度。

圖1 ZDP的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of ZDP

2.2 單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1 ZDP與卵磷脂的質(zhì)量比對脂質(zhì)體包封率的影響 ZDP與卵磷脂的不同質(zhì)量比對脂質(zhì)體包封率的影響如圖2所示。

圖2 ZDP與卵磷脂的質(zhì)量比對脂質(zhì)體包封率的影響Fig.2 Effect of the mass ratio of ZDP to lecithin on the entrapment efficiency of liposomes注:圖中不同的小寫字母表示數(shù)值間的 顯著性差異(p<0.05);圖2～圖8同。

如圖2,隨著ZDP與卵磷脂的比例從1∶2增至1∶6時,包封率呈現(xiàn)增大的趨勢,包封率最大為99.40%。當(dāng)ZDP與卵磷脂的比例繼續(xù)增大為1∶8時,包封率急劇下降,僅為75%,這可能是因為一定的磷脂用量形成的脂質(zhì)體數(shù)量有限,對ZDP的包埋具有飽和性。一旦ZDP量超過脂質(zhì)膜飽和限度,部分ZDP就有可能進入外面膠團中,無法形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體[21]。因此,該因素選擇1∶5,1∶6,1∶7三個水平進行正交試驗。

2.2.2 膽固醇與卵磷脂的質(zhì)量比對脂質(zhì)體包封率的影響 膽固醇與卵磷脂的不同質(zhì)量比對脂質(zhì)體包封率的影響如圖3所示。

圖3 膽固醇與卵磷脂的質(zhì)量比對脂質(zhì)體包封率的影響Fig.3 Effect of mass ratio of cholesterol to lecithin on the entrapment efficiencyof liposomes

由圖3可知,隨著膽固醇與卵磷脂的比例從1∶2增至1∶5時,包封率呈現(xiàn)增長的趨勢,當(dāng)膽固醇與卵磷脂的比例為1∶5時,包封率最大為95.21%。但當(dāng)膽固醇與卵磷脂的比例繼續(xù)增大為1∶6時,包封率顯著降低(p<0.05)。這可能是因為膽固醇比例過大時,脂質(zhì)體雙分子層結(jié)構(gòu)剛性增強,形成的脂質(zhì)體雙分子層膜的總表面積減小,破壞了雙分子組成,使包封率下降[22]。因此該因素選擇1∶4,1∶5,1∶6三個水平進行正交試驗考察。

2.2.3 吐溫80與卵磷脂的質(zhì)量比對脂質(zhì)體包封率的影響 吐溫80與卵磷脂的不同質(zhì)量比對脂質(zhì)體包封率的影響如圖4所示。

圖4 吐溫80與卵磷脂的質(zhì)量比對脂質(zhì)體包封率的影響Fig.4 Effect of mass ratio of tween-80 to cholesterol on the entrapment efficiency of liposomes

由圖4可知,當(dāng)吐溫80的使用量占卵磷脂的比例為1∶10時,包封率最低,隨著吐溫80 用量的增大,包封率也隨著升高,但2∶10,3∶10和4∶10的用量對包封率的影響不大,當(dāng)繼續(xù)提高吐溫80用量為5∶10時,脂質(zhì)體的包封率有所下降。因此該因素選擇2∶10,3∶10,4∶10三個水平進行正交試驗考察。

2.2.4 磷酸鹽緩沖溶液pH對脂質(zhì)體包封率的影響 不同緩沖溶液pH對脂質(zhì)體包封率的影響如圖5所示。

圖5 緩沖液pH對脂質(zhì)體包封率的影響Fig.5 Effect of buffer pH on entrapment efficiency of liposomes

如圖5,隨著PBS緩沖液pH的增大,包封率呈下降趨勢,當(dāng)緩沖液pH為6.6時,包封率最大為91.81%,當(dāng)pH增大為7.4時,包封率僅為63.74%,這可能是因為pH改變了脂質(zhì)體膜表面的電荷性質(zhì),進而改變脂質(zhì)體膜通透性,影響ZDP被包埋的數(shù)量[23]。當(dāng)pH為6.6時包封率最高，因此以pH為6.6時為中點，選擇6.4,6.6,6.8三個水平進行正交試驗考察。

2.3 正交實驗結(jié)果分析

結(jié)果表明,在本實驗方案所取的因素和水平下,最佳工藝組合為A1B2C1D2,各因素的重要指標(biāo)程度依次為A>D>C>B。即膽固醇∶卵磷脂>緩沖液pH>吐溫80∶卵磷脂>ZDP∶卵磷脂。

將推測的最佳工藝組合A1B2C1D2與表2中的包封率最高組合A1B2C2D2最對比分析,實驗重復(fù)3次,得出方案A1B2C2D2包封率為96.83%±2.76%,方案A1B2C1D2包封率為97.99%±3.29%。結(jié)果表明A1B2C1D2為最佳工藝條件。即膽固醇∶卵磷脂為1∶4,ZDP∶卵磷脂為1∶6,吐溫80∶卵磷脂為2∶10,PBS緩沖液pH為6.6時,ZDP脂質(zhì)體的制備工藝條件最為合適。

表2 L9(34)正交實驗結(jié)果Table 2 Results of L9(34)orthogonal experiments

2.4 脂質(zhì)體體外抗氧化活性評價

2.4.1 DPPH自由基清除能力 DPPH·的單電子對可與自由基清除劑配對,使其吸收逐漸消失,吸光度減小,顏色由紫色轉(zhuǎn)變成黃色[24]。因此對 DPPH·的清除能力可以有效評價抗氧化劑的活性,如圖6所示,當(dāng)脂質(zhì)體包封率低時,隨著包封率的增大脂質(zhì)體清除DPPH自由基的能力變化較小,約為5∶10左右,當(dāng)包封率>98%時,DPPH自由基清除力顯著提高(p<0.05),可達75%。

圖6 不同脂質(zhì)體的包封率及DPPH自由基清除力Fig.6 Encapsulation rate and DPPH radical scavenging power of different liposomes

2.4.2 還原能力 還原力大的樣品可以提供電子作為還原性物質(zhì),使自由基成為較穩(wěn)定的物質(zhì),從而中斷自由基的連鎖反應(yīng),因此,物質(zhì)的還原能力可以反映其清除活性氧等自由基或發(fā)揮抗氧化作用的能力[13]。ZDP脂質(zhì)體的還原能力如圖7所示,隨著包封率的增大,還原力沒有明顯的變化,可見還原能力對包封率沒有明顯的依賴性。

圖7 不同脂質(zhì)體的包封率及還原力Fig.7 Encapsulation rate and reducing power of different liposomes

2.4.3 抗脂質(zhì)過氧化能力 ZDP等類胡蘿卜素類物質(zhì),因為分子結(jié)構(gòu)中含有多烯烴或酚氧基結(jié)構(gòu),能淬滅單線態(tài)氧,避免了單線態(tài)氧對不飽和脂質(zhì)的損傷,清除脂質(zhì)過氧化自由基,從而有效地抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[25]。枸杞ZDP脂質(zhì)體抗脂質(zhì)過氧化能力如圖8所示,當(dāng)脂質(zhì)體具有較高的包封率時,抗脂質(zhì)過氧化作用也隨之增高,不同包封率的脂質(zhì)體對TBARS的抑制率從30%～90%,抗脂質(zhì)過氧化能力差別較大,可見ZDP的抗脂質(zhì)過氧化作用與脂質(zhì)體對其的包埋能力有一定的關(guān)聯(lián)性。

圖8 不同脂質(zhì)體的包封率及對過氧化物TBARS的抑制率Fig.8 Encapsulation rate and TBARS inhibition ratio of different liposomes

3 討論與結(jié)論

使用超聲波法制備枸杞ZDP脂質(zhì)體,當(dāng)ZDP、膽固醇、吐溫80和卵磷脂的比例分別為1∶6,1∶4和2∶10,PBS pH為6.6時,ZDP脂質(zhì)體的包封率較其他因素水平的脂質(zhì)體包封率最高。脂質(zhì)體包封率低,清除DPPH自由基的能力也較小,當(dāng)包封率>98%時,DPPH自由基清除率可達75%;而還原能力對包封率沒有明顯的依賴性,即還原力不會隨著包封率的增大而提高,還原力與共軛雙鍵的數(shù)量以及類胡蘿卜素和三價鐵di-TPTZ復(fù)合物之間的空間位阻有關(guān)[26],因此不同包封率的相同脂質(zhì)體對Fe3+的還原力沒有明顯的差異。較高的包封率的ZDP脂質(zhì)體具有較高的抗脂質(zhì)過氧化作用,說明ZDP的抗脂質(zhì)過氧化作用與脂質(zhì)體對其的包埋能力有一定的關(guān)聯(lián)性,脂質(zhì)體的過氧化常伴隨雙分子層的破壞,其對包埋芯材的保護作用也降低,而ZDP對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制作用保持了脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的完整性,進而脂質(zhì)雙分子層又對被包埋的ZDP產(chǎn)生了良好的保護作用[27],因此高包封率的脂質(zhì)體其抗脂質(zhì)過氧化能力也較高。