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(1.云南省供銷(xiāo)合作社科學(xué)研究所,云南昆明 650221; 2.云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院,云南昆明 650091)

金耳(Tremellaaurantialba),是異擔(dān)子菌綱(Heterobasi-diomycetes),銀耳目(Tremellales),銀耳科(Tremellaceae)的名貴食藥用真菌[1],又稱(chēng)黃木耳、茂若色爾布(藏語(yǔ))、黃耳、腦耳,自然分布于我國(guó)西藏、云南等地。金耳性甘、溫,具有清肺生津、化痰止咳、調(diào)氣定喘、平肝陽(yáng)、補(bǔ)心養(yǎng)氣的功效[2]。金耳主要活性成分為金耳多糖,子實(shí)體多糖的主鏈為木糖和甘露糖,具有免疫增強(qiáng)、保肝、促進(jìn)造血功能、抑制炎癥及潰瘍、抗輻射、抗衰老等作用[3]。

金耳子實(shí)體多糖的分子量較大,約300～500 kD[3],常規(guī)提取工序中易產(chǎn)生大量泡沫,提取分離困難,不利于云南地區(qū)豐富金耳資源的開(kāi)發(fā)。目前金耳多糖提取方法主要有水提取[4]、超聲波提取[5-7]、微波提取[8]、酶法提取[9]等,其中利用酶法輔助提取金耳多糖的方法具有節(jié)能環(huán)保、可減少高溫及超聲對(duì)活性成分的影響、更高得率等優(yōu)勢(shì)。纖維素酶、果膠酶為最為常用提取用酶,溫和的酶處理?xiàng)l件在提高提取物的品質(zhì)、提取率以及提高副產(chǎn)物質(zhì)量等方面存在優(yōu)勢(shì)[10-15],水酶法在植物油提取方面的研究和應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。

水酶法提取金耳多糖相關(guān)工藝研究報(bào)道較少,影響多糖得率的主要因素有酶添加量、提取溫度、提取液料比、提取時(shí)間、粒徑等[4,14],本試驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法研究纖維素酶及果膠復(fù)合酶添加量、提取溫度、提取液料比、提取時(shí)間及粒徑因素對(duì)提取金耳多糖得率的影響,擬獲得水酶法提取金耳子實(shí)體多糖最佳提取工藝,為金耳多糖提取開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金耳子實(shí)體干品 由昆明食用菌研究所提供;濃硫酸、苯酚 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;D-無(wú)水葡萄糖 純度99.9%,中國(guó)食品藥品檢定研究院;纖維素酶,臺(tái)州海松化工產(chǎn)品有限公司;果膠酶 食品級(jí),酶活105U/g,蘇柯漢(澳資)生物工程有限公司。

J-301型低溫超速離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司;SPECORD? 200 PLUS型分光光度計(jì) 德國(guó)耶拿分析儀器股份公司;ME204/02型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DGF-80型粉碎機(jī) 滄州方圓公路建筑儀器廠(chǎng);HH.S21-8型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋 杭州科曉化工儀器設(shè)備有限公司;OKP-S0標(biāo)準(zhǔn)通用型超純水機(jī) 上海淶科儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金耳多糖的制備 將金耳子實(shí)體切碎后于60 ℃烘干,冷卻至室溫后用粉碎機(jī)粉碎,過(guò)一定目數(shù)的樣品篩得到金耳粉。稱(chēng)取一定質(zhì)量的金耳粉,加5倍體積的80%乙醇在80 ℃水浴條件下進(jìn)行回流去脂2 h,然后抽濾、烘干得到脫脂金耳粉。準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的脫脂金耳粉,加入蒸餾水和一定比例的纖維素酶及果膠酶后進(jìn)行提取。提取完成后10000 r/min離心10 min取上清液,將上清液濃縮至一定體積后加入4倍體積的無(wú)水乙醇靜置過(guò)夜。10000 r/min離心10 min后得到沉淀,再用適量丙酮洗滌后-80 ℃冰箱預(yù)冷凍24 h,冷凍干燥24 h即為金耳粗多糖[16]。

1.2.2 多糖得率的計(jì)算 以D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn),采用苯酚-硫酸法[17]測(cè)定金耳多糖的濃度。

1.2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)方程的建立 苯酚-硫酸法建立標(biāo)準(zhǔn)方程:準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg干燥的D-無(wú)水葡萄糖溶解,在250 mL的容量瓶中定容。分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液,以蒸餾水補(bǔ)充至2 mL,加入1 mL 6%的苯酚及5 mL濃硫酸,冷卻至室溫后在490 nm處測(cè)吸光度。取2 mL的蒸餾水按同樣的步驟作為空白對(duì)照。以葡萄糖溶液的質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.2.2 金耳多糖得率的計(jì)算 將冷凍干燥之后獲得的金耳多糖40 mg用200 mL蒸餾水溶解后,量取2 mL金耳多糖溶液按照1.2.2.1的苯酚-硫酸法在490 nm處測(cè)定金耳多糖溶液的吸光度,參照標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算金耳多糖的濃度,依據(jù)式(1)計(jì)算金耳多糖的得率(W)。

式(1)

式中:w-金耳多糖的得率(%);c-檢測(cè)樣品溶液的濃度(mg/mL);v-檢測(cè)樣品溶液的體積(mL);m-金耳粉的質(zhì)量(mg)。

1.2.3 復(fù)合酶比例的確定 稱(chēng)取粉碎至60目的金耳粉1 g,液料比為100∶1 (mL/g),提取溫度為50 ℃,提取時(shí)間為30 min的條件下探究果膠酶與纖維素酶不同比例(2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2)對(duì)金耳多糖得率的影響,通過(guò)復(fù)合酶添加量預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)選果膠酶與纖維素酶添加量為20 mg。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 分別以不同的復(fù)合酶添加量、提取時(shí)間、提取溫度、液料比、粒徑為單因素[4,14]進(jìn)行試驗(yàn),探究各因素對(duì)金耳多糖得率的影響。

1.2.4.1 復(fù)合酶添加量 稱(chēng)取粉碎至60目的金耳粉1 g,液料比為100∶1 (mL/g),提取溫度為50 ℃,提取時(shí)間為30 min的條件下探究不同果膠酶與纖維素酶復(fù)合酶添加量(5、10、15、20、25、30 mg)對(duì)金耳多糖得率的影響。

1.2.4.2 提取時(shí)間 稱(chēng)取粉碎至60目的金耳粉1 g,液料比為100∶1 (mL/g),提取溫度為50 ℃,復(fù)合酶添加量為20 mg的條件下探究不同提取時(shí)間(10、20、30、40、50、60 min)對(duì)金耳多糖得率的影響。

1.2.4.3 提取溫度 稱(chēng)取粉碎至60目的金耳粉1 g,液料比為100∶1 (mL/g),復(fù)合酶添加量為20 mg,提取時(shí)間為30 min的條件下探究不同提取溫度(40、45、50、55、60、65 ℃)對(duì)金耳多糖得率的影響。

1.2.4.4 液料比 稱(chēng)取粉碎至60目的金耳粉1 g,復(fù)合酶添加量為20 mg,提取溫度為50 ℃,提取時(shí)間為30 min的條件下探究不同液料比(100∶1、200∶1、300∶1、400∶1、500∶1 mL/g)對(duì)金耳多糖得率的影響。

1.2.4.5 粒徑 分別稱(chēng)取不同粒徑(40、60、80、100、120、140目)的金耳粉1 g,在液料比為100∶1 (mL/g),提取溫度為50 ℃,提取時(shí)間為30 min的條件下探究粒徑對(duì)金耳多糖得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,選取液料比、提取時(shí)間、提取溫度、復(fù)合酶的添加量4因素為自變量,以金耳多糖的得率為響應(yīng)值。采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels in response surface design

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用Excel 2010軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)及作圖,應(yīng)用軟件Design Expert 8.0.5中Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。并進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程:y=6.2328x+0.0232,R2=0.9914。其中y為490 nm處的吸光度,x為葡萄糖的質(zhì)量濃度(mg/mL)。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 復(fù)合酶比例的確定

果膠酶與纖維素酶的不同復(fù)配比例(共20 mg/g)對(duì)金耳多糖得率的影響如圖2所示,隨著果膠酶與纖維素酶比例由2∶8升高至6∶4,金耳多糖得率隨之增加,但當(dāng)果膠酶與纖維素酶比例由6∶4升高至8∶2,金耳多糖得率呈明顯下降趨勢(shì),表明果膠酶與纖維素酶配比為6∶4時(shí)金耳多糖的得率最高,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,優(yōu)選復(fù)合酶中果膠酶與纖維素酶復(fù)配比例為6∶4。

圖2 果膠酶與纖維素酶的配比對(duì)金耳多糖得率的影響Fig.2 Effect of the ratio of pectinase to cellulase on extraction rate of polysaccharide from Tremella aurantialba

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 復(fù)合酶添加量對(duì)金耳多糖得率的影響 在復(fù)合酶添加量為20 mg/g時(shí)金耳多糖得率最高(圖3)。當(dāng)復(fù)合酶添加量少于20 mg/g時(shí),金耳多糖得率隨復(fù)合酶添加量增大而增大,但復(fù)合酶添加量多于20 mg/g時(shí),金耳多糖得率基本恒定。分析其原因可能為復(fù)合酶添加量較少,金耳細(xì)胞壁在一定時(shí)間和一定接觸面條件下分解不完全,無(wú)法促進(jìn)胞內(nèi)多糖從細(xì)胞中全部釋放出來(lái)與溶劑直接接觸;隨著酶濃度的增加,相同時(shí)間內(nèi)底物與酶充分作用,使反應(yīng)速度加快,金耳多糖的得率從而迅速增加;而隨著酶濃度的繼續(xù)加大,酶開(kāi)始處于飽和狀態(tài),底物已經(jīng)最大限度的與酶結(jié)合,導(dǎo)致酶的利用率降低,金耳多糖的得率不再明顯增加[16]。因此選擇的最適復(fù)合酶添加量為20 mg/g。

圖3 復(fù)合酶添加量對(duì)金耳多糖得率的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on extraction rate of polysaccharide from Tremella aurantialba

2.3.2 提取時(shí)間對(duì)金耳多糖得率的影響 如圖4所示,當(dāng)提取時(shí)間小于50 min時(shí),隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),金耳多糖的得率迅速增加,當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)50 min時(shí)得率增加趨于平緩,隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng),得率不再升高。分析原因可能是提取時(shí)間在50 min之前,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)金耳多糖可以更充分的溶出,提高金耳多糖的得率,但提取時(shí)間超過(guò)50 min后無(wú)法繼續(xù)溶出更多的多糖導(dǎo)致金耳多糖的得率不再升高。因此選擇最適的提取時(shí)間為50 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)金耳多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharide from Tremella aurantialba

2.3.3 提取溫度對(duì)金耳多糖得率的影響 如圖5所示,在溫度為50 ℃時(shí)金耳多糖的得率達(dá)到最高,可能由于此溫度是果膠酶與纖維素酶在提取條件下的最適溫度[18]。因此當(dāng)溫度高于或低于50 ℃時(shí)均對(duì)復(fù)合酶產(chǎn)生抑制作用導(dǎo)致金耳多糖的得率降低。因此,選擇金耳多糖提取的最佳溫度為50 ℃。

圖5 提取溫度對(duì)金耳多糖得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharide from Tremella aurantialba

2.3.4 提取液料比對(duì)金耳多糖得率的影響 如圖6所示,在液料比為100∶1～300∶1 (mL/g)時(shí)多糖得率上升隨著液體體積的增加而明顯增加,在液料比為300∶1 (mL/g)時(shí)多糖得率達(dá)到最高,當(dāng)液料比繼續(xù)增加時(shí),多糖得率變化并不明顯。分析原因可能是當(dāng)液體比較少時(shí),不利于多糖的溶出,使得得率較低,而當(dāng)液體體積過(guò)大時(shí),酶濃度降低導(dǎo)致酶的作用下降,且多糖成分已溶出充分,因此得率會(huì)趨于恒定甚至下降[16]。因此選取最適液料比300∶1 (mL/g)。

圖6 液料比對(duì)金耳多糖得率的影響Fig.6 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polysaccharide from Tremella aurantialba

2.3.5 粒徑對(duì)金耳多糖得率的影響 如圖7所示,隨著粒徑的減小,多糖的得率逐步提高,在120目時(shí)達(dá)到最大值,120目多糖得率較40目?jī)H提高1.38%,即粒徑對(duì)得率的影響不明顯。綜合考慮,后續(xù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)不以粒徑為自變量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖7 粒徑對(duì)金耳多糖得率的影響Fig.7 Effect of grain size on extraction rate of polysaccharide from Tremella aurantialba

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

2.4.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,由Design Expert 8.0.5統(tǒng)計(jì)分析軟件設(shè)計(jì)出的實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示,以金耳多糖的得率為響應(yīng)值,以液料比(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)、復(fù)合酶的添加量(D)為自變量,建立四因素三水平中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)共計(jì)包括29個(gè)實(shí)驗(yàn)方案,其中24個(gè)析因?qū)嶒?yàn)點(diǎn),5個(gè)中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn),用以計(jì)算實(shí)驗(yàn)誤差。

表2 Box-Benhnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of Box-Benhnken experiment

由表3可知,模型項(xiàng)極顯著(p<0.0001),失擬項(xiàng)不顯著,表明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合情況好,試驗(yàn)誤差小?；貧w方程較好地描述了各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。因此,可以用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

結(jié)果表明,液料比(A)、提取時(shí)間(B)、液料比二次項(xiàng)(A2)、提取時(shí)間二次項(xiàng)(B2)、提取溫度二次項(xiàng)(C2)對(duì)響應(yīng)值影響極顯著(p<0.01),提取溫度(C)、液料比提取時(shí)間(AB)、復(fù)合酶的添加量二次方(D2)對(duì)響應(yīng)值影響顯著(p<0.05);各因素對(duì)響應(yīng)值顯著性的排序?yàn)锳>B>C>D。由該回歸方程確定出最佳提取工藝條件為:液料比為347.38∶1 (mL/g),提取時(shí)間為52.71 min,提取溫度為52.32 ℃,復(fù)合酶添加量為20.79 mg/g,此時(shí)金耳多糖得率理論值12.78%。

2.4.3 響應(yīng)面圖分析 根據(jù)軟件Design-Expert獲得響應(yīng)值的3D曲面,分析各因素對(duì)金耳多糖得率的影響及各因素間的交互作用,當(dāng)固定液料比、提取時(shí)間、提取溫度、復(fù)合酶的添加量中任意兩個(gè)因素為零水平時(shí),其余兩個(gè)因素間的交互作用對(duì)多糖得率的影響。如圖8,多糖得率隨其中任意兩個(gè)變量的增加均呈上升趨勢(shì),

圖8 各因素的交互作用對(duì)多糖得率的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface plots of variable parameters on the yield of polysaccharides from Tremella aurantialba

達(dá)到一定值時(shí),曲面稍下降或趨于平緩。由圖8a、圖8b、圖8d可以看出液料比相對(duì)于浸提時(shí)間、提取溫度而言復(fù)合酶添加量對(duì)多糖得率的影響較大,與方差分析結(jié)果相符。

2.4.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 由回歸方程確定出最佳提取工藝條件為:液料比為347.38∶1 (mL/g),提取時(shí)間為52.71 min,提取溫度為52.32 ℃,復(fù)合酶添加量為20.79 mg/g,此時(shí)金耳多糖得率理論值12.78%。為方便試驗(yàn)的實(shí)際操作,將最佳提取條件調(diào)整為液料比為347∶1 (mL/g),提取時(shí)間52 min,提取溫度為52 ℃,復(fù)合酶添加量為20.50 mg/g,進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),在此條件下金耳多糖的得率平均值為12.69%±0.52%。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)相應(yīng)面回歸方程擬合出的理論值與實(shí)際值相吻合,驗(yàn)證了方程的可靠性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用酶法輔助提取技術(shù)提取金耳中的多糖,以液料比、提取時(shí)間、提取溫度、復(fù)合酶添加量為單因素,以金耳多糖得率為響應(yīng)值,采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì),得到酶法輔助提取金耳多糖的最佳工藝條件為液料比為347∶1 (mL/g),提取時(shí)間52 min,提取溫度為52 ℃,復(fù)合酶添加量為20.50 mg/g,在此條件下金耳多糖的得率為12.69%±0.52%。

通過(guò)研究可知,酶輔助法提取[9]較水提取法、超聲波提取法、微波提取法有較大的優(yōu)勢(shì),提取溫度較低,提取時(shí)間短,且得率較高,節(jié)能環(huán)保、可減少高溫及超聲對(duì)活性成分的影響[10-15]。故該方法為金耳多糖的一種較理想的提取方法,研究結(jié)果可為金耳多糖的提取及開(kāi)發(fā)研究提供依據(jù),具有一定的實(shí)際應(yīng)用前景。