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(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院,陜西楊凌 712100; 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院,陜西楊凌 712100)

湖北花楸(SorbushupehensisC. K. Schneid.)為花楸屬植物,為落葉喬木或灌木。我國有 50 余種花楸屬植物,產(chǎn)于西南、西北以及東北地區(qū)。該屬植物具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,密集的花序可使其作園林觀賞植物,其中部分種類植物是果樹育種和砧木的重要原料,種子油用于肥皂及醫(yī)藥工業(yè),樹皮用于鞣皮工業(yè)中[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),該屬植物中含有較豐富的黃酮、花青素、雙聯(lián)苯酚、類山梨酸苷、生氰苷等成分,并在藥理作用上具有強(qiáng)抗氧化、抗癌、抗輻射和止咳平喘等作用,引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注[3-6]。關(guān)于湖北花楸葉中所含的多糖的研究目前尚未見報(bào)道。

植物多糖具有一定的生物活性,具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗菌抗病毒、保護(hù)肝臟等保健作用[7]。植物中多糖提取方法包括水提法、酸堿提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、等多種方法[8-10],這些提取方法所提多糖都需要進(jìn)一步的純化。多糖的純化方法有鹽析法、乙醇沉淀法、柱層析法、超濾法,其中乙醇沉淀法運(yùn)用最為廣泛[11]。乙醇沉淀法利用多糖能溶于乙醇而雜質(zhì)不溶于乙醇的特性,在加入乙醇后,有效成分轉(zhuǎn)溶于乙醇中,而雜質(zhì)則被沉淀出來。此法雖能提取出大量的多糖,但是往往存在醇沉不徹底的缺點(diǎn),致使原料利用率低下,其次,醇沉的過程大多需要過夜,存在耗時(shí)較長(zhǎng)的問題。在水和有機(jī)溶劑的混合溶液中,加入一定量的無機(jī)鹽可改變水相的極性,提高兩相中的化合物分離效果,這一過程與鹽析的原理相似。如果這一原理運(yùn)用于多糖的醇沉過程,將大大提升其提取效率[12]。針對(duì)在提取多糖的醇沉過程中存在的以上問題,本文以湖北花楸葉多糖為對(duì)象,研究添加無機(jī)鹽對(duì)其醇沉特性的影響,通過探索其醇沉規(guī)律來縮短醇沉?xí)r間,提高提取效率,同時(shí)為其他植物多糖提取的醇沉過程提供參考思路。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

湖北花楸葉 采集于秦嶺火地塘,風(fēng)干,-20 ℃保存;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 北京中生瑞泰科技有限公司;抗壞血酸 美國Sigma公司;無水乙醇、Na2SO4、(NH3)2SO4、NaCl、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、K3[Fe(CN)6]、三氯乙酸、FeCl3、FeSO4、水楊酸 均購于科密歐化學(xué)試劑公司。

TU-19紫外光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;FA1204B電子分析天平 上海天平儀器廠;R213B旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司;FX超聲波清洗儀 濟(jì)寧豐鑫超聲設(shè)備有限公司;SHB-3循環(huán)真空泵 上海申生可以有限公司;索氏提取器 蜀牛玻璃儀器有限公司;C-MAG MS4磁力攪拌器 上海精密儀器儀表有限公司;TGL-16M冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司;WJX-200高速多功能粉碎機(jī) 上海緣沃工貿(mào)公司;FD8-3T立式冷凍干燥機(jī) GOLD-SIM公司;TENSOR II傅里葉變換近紅外光譜儀 德國Bruker Optics公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花楸葉的預(yù)處理 將湖北花楸葉烘干(55 ℃,72 h),粉碎,過60目篩,然后用石油醚(沸程60～90 ℃)脫脂8 h,得脫脂花楸葉粉末,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 花楸葉多糖提取液的制備 精準(zhǔn)1.00 g脫脂的花楸葉粉末于錐形瓶中,超聲波輔助水熱提取,提取條件為:料液比1∶30 (g/mL),超聲時(shí)間40 min,超聲功率350 W,提取溫度60 ℃[13]。抽濾提取液,上清液于40 ℃,0.1 MPa下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積五分之一,濃縮液于4 ℃下可經(jīng)過醇沉后得到多糖。

1.2.3 花楸葉多糖含量的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法測(cè)定花楸葉中多糖含量[14],以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,于490 nm處測(cè)定吸光值,以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x(mg/mL),吸光值Y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=16.64x-0.0124(R2=0.9992)。

多糖得率的計(jì)算公式如下:

多糖得率(%)=花楸葉提取液中多糖質(zhì)量×100/原料質(zhì)量

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 無機(jī)鹽種類及濃度對(duì)多糖醇沉特性的影響 選取三種不同種類的無機(jī)鹽(NH3)2SO4、Na2SO4、NaCl)在其濃度(1.2%、1.6%、2.0%、2.4%、2.8%),加入4倍體積無水乙醇,醇沉24 h,過濾得所提多糖,測(cè)定多糖得率。

1.2.4.2 乙醇體積倍數(shù)對(duì)加鹽后醇沉特性的影響 取所制備的提取濃縮液,添加2、3、4、5、6倍體積的乙醇和2.4%的Na2SO4,醇沉24 h,過濾得所提多糖,測(cè)定多糖得率。

1.2.4.3 醇沉?xí)r間對(duì)加鹽后醇沉特性的影響 取所制備的提取濃縮液,添加4倍體積的乙醇和2.4%的Na2SO4,分別醇沉2、6、12、24 h,過濾得所提多糖,測(cè)定多糖得率。

1.2.5 正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,考察Na2SO4濃度A、醇沉?xí)r間B、醇沉體積C對(duì)多糖得率的影響,并采用三因素三水平L9(33)正交試驗(yàn),來確定提高多糖得率的最佳條件,并在最佳條件下進(jìn)行多糖得率驗(yàn)證試驗(yàn)。

表1 正交試驗(yàn)的因素水平表Table 1 Factors and levelsTable of orthogonal array test

1.2.6 紅外表征 將超聲提取醇沉的多糖溶液與加入2% Na2SO4醇沉的所得多糖溶液倒入分子量為5000和10000 Da半透膜中,透析出無機(jī)鹽,截留得到不同分子量大小的多糖,純化后將溶液冷凍干燥[15]。采用KBr壓片法,在4000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描,檢測(cè)無機(jī)鹽的加入對(duì)醇沉多糖的結(jié)構(gòu)是否有影響。

1.2.7 抗氧活性的測(cè)定

1.2.7.1 總抗氧化能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[16]將2 mL不同濃度多糖溶液與1 mL PBS(pH=7.0)、1 mL 1% K3[Fe(CN)6]溶液置于50 ℃中水浴20 min,加入2.5 mL三氯乙酸均勻混合,6000 r/min離心15 min,取上清液2.5 mL,加入0.5 mL新配制的0.1% FeCl3溶液,混合均勻,于700 nm處測(cè)定吸光值。蒸餾水為空白對(duì)照,同等濃度維生素C為陽性對(duì)照。每個(gè)樣品三組重復(fù),取平均值。

1.2.7.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[17]的方法,將2 mL不同濃度的多糖溶液與2 mL 0.25 mmol/L DPPH-乙醇溶液混合,混勻后靜置30 min,以無水乙醇為參比,于517 nm處測(cè)定吸光值分別為A,維生素C為陽性對(duì)照。每個(gè)樣品三組重復(fù),取平均值。樣品對(duì)DPPH自由基的清除率則為:

DPPH自由基清除率(%)=(A1-A2)×100/A1

其中:A1為加入多糖溶液反應(yīng)后的A值,A2為蒸餾水代替多糖樣品液后的A值。

1.2.7.3 羥自由基清除能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[18]的方法,將2 mL不同濃度多糖溶液,2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液與2 mL 6 mmol/L H2O2溶液加入試管中,搖勻后靜置15 min,再加入2 mL 6 mmol/L水楊酸溶液,搖勻后靜置30 min,于510 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ),蒸餾水為空白對(duì)照,維生素C為陽性對(duì)照。每個(gè)樣品做三組重復(fù),取平均值。樣品對(duì)羥自由基的清除率為:

羥自由基清除率(%)=[A0-(A1-A2)]×100/A0

其中:A0為不加多糖溶液的空白值,A1為加入多糖液反應(yīng)后的A值,A2為不加水楊酸時(shí)溶液的A值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

上述方法中多糖得率實(shí)驗(yàn)每組重復(fù)三次,取平均值,采用Excel軟件作圖,多糖的紅外表征采用Origin8軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 無機(jī)鹽種類及濃度對(duì)多糖得率的影響 不同的無機(jī)鹽會(huì)對(duì)醇沉體系的相平衡造成不同的影響[12],因此添加不同種類無機(jī)鹽后多糖的醇沉效果定會(huì)存在差異。不同濃度的Na2SO4、NaCl、(NH3)2SO4進(jìn)對(duì)多糖得率的影響如圖1所示。

圖1 無機(jī)鹽種類對(duì)醇沉過程的多糖得率的影響Fig.1 Effects of different kinds of inorganic salts on the yield of polysaccharide in the process of alcohol precipitation

多糖的提取液采用傳統(tǒng)的醇沉方法純化,其多糖得率為2.54%。由圖1看出,加入一定濃度范圍的三種無機(jī)鹽,均能夠一定程度上提高多糖的得率,其中,添加Na2SO4時(shí)多糖的得率提高最為明顯。當(dāng)Na2SO4濃度為2.4%時(shí),多糖的得率趨于穩(wěn)定;當(dāng)濃度過高時(shí),多糖得率反而緩慢下降。當(dāng)(NH4)2SO4濃度大于2%,NaCl濃度大于1.6%時(shí),多糖的得率反而有較大幅度的減少。無機(jī)鹽濃度不同,對(duì)多糖得率影響也不相同,在一定的濃度內(nèi),多糖得率隨著無機(jī)鹽濃度的升高而升高,當(dāng)無機(jī)鹽濃度達(dá)到一定數(shù)值時(shí),多糖得率基本維持穩(wěn)定。無機(jī)鹽濃度較低時(shí),可能會(huì)與水結(jié)合形成鹽溶液,從而降低多糖與水結(jié)合的可能性,從而使得多糖醇沉效率提高,當(dāng)無機(jī)鹽濃度達(dá)到一定數(shù)值時(shí)到飽和狀態(tài),其對(duì)多糖醇沉影響不再明顯[12]。此外,過高的添加量會(huì)導(dǎo)致過高的成本,因此,本實(shí)驗(yàn)選擇的無機(jī)鹽為Na2SO4,濃度為2.4%。

2.1.2 乙醇體積倍數(shù)對(duì)多糖得率的影響 乙醇體積倍數(shù)在醇沉過程中有重要的影響。適量的乙醇體積倍數(shù)可以使多糖在較低的成本下盡可能多地醇沉出來。不同體積倍數(shù)的無水乙醇對(duì)多糖醇沉效率影響很大。當(dāng)無水乙醇的體積倍數(shù)為多糖溶液的2～4倍時(shí),多糖得率呈升高趨勢(shì);當(dāng)無水乙醇的體積倍數(shù)為多糖溶液的4倍以上時(shí),多糖得率基本穩(wěn)定。原因可能為:當(dāng)乙醇體積倍數(shù)過低時(shí),果膠和其他水溶性色素溶解性好,從而影響了多糖在溶劑中的溶解,提取液中多糖含量低,提取效果差;當(dāng)乙醇體積倍數(shù)過高時(shí),溶液極性過低,不利于多糖溶解[12]。因此選擇無水乙醇添加倍數(shù)為多糖溶液的4倍進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 乙醇體積倍數(shù)對(duì)醇沉過程的多糖得率的影響Fig.2 Effect of different ethanol volume multiple on the yield of polysaccharide in alcohol precipitation process

2.1.3 醇沉?xí)r間對(duì)多糖得率的影響 醇沉?xí)r間對(duì)多糖醇沉過程影響極為重要,由于醇沉過程過長(zhǎng)是醇沉法的一大弊端,也是影響醇沉效率的重要原因。優(yōu)化醇沉?xí)r間將大大提升醇沉效率。

醇沉?xí)r間是影響多糖得率的另一個(gè)重要因素。當(dāng)醇沉?xí)r間較短時(shí),醇沉不徹底,多糖得率較低,延長(zhǎng)醇沉?xí)r間可提升多糖得率[11]。圖3可以看出,隨著醇沉?xí)r間的增加,多糖得率有所提高;當(dāng)超過12 h時(shí),多糖得率基本穩(wěn)定為7.00%。這表明,添加無機(jī)鹽后醇沉過程在12 h基本趨于平衡,因此醇沉?xí)r間選擇為12 h。

圖3 醇沉?xí)r間對(duì)醇沉過程的多糖得率的影響Fig.3 Effect of alcohol precipitation time on the yield of polysaccharide in alcohol precipitation process

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知,不同處理?xiàng)l件對(duì)多糖提取得率的影響為:醇沉?xí)r間>乙醇體積倍數(shù)>Na2SO4濃度,說明醇沉?xí)r間對(duì)多糖得率的影響最為重要。同時(shí),通過正交試驗(yàn)得到多糖醇沉最佳處理體系為A1B2C3,即Na2SO4濃度為2.0%,醇沉?xí)r間12 h,加入無水乙醇體積為5倍。在該條件下進(jìn)行多次驗(yàn)證試驗(yàn),多糖得率為7.2%±0.12%,而相同提取條件下不添加Na2SO4多糖得率僅有2.54%,說明該條件能夠有效提高多糖得率。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal test

2.3 紅外表征

花楸葉多糖冷凍干燥后得到淺褐色粉末,將粉末采用KBr壓片法制作紅外光譜,多糖的結(jié)構(gòu)特征可以通過FT-IR光譜鑒定。IR圖譜顯示,在3420 cm-1附近的吸收峰是糖類分子間或分子內(nèi)的O-H鍵伸縮振動(dòng),2928 cm-1附近的吸收峰為烷基的C-H鍵伸縮振動(dòng),這兩組峰均屬于多糖的特征吸收峰[20],四種花楸多糖均出現(xiàn)了典型的多糖特征峰,且各紅外光譜很相似,說明四種多糖的碳鏈骨架基本一致[21]。在光譜圖中,四種多糖均在3400 cm-1附近出現(xiàn)了較寬的吸收峰,是O-H伸縮振動(dòng)的結(jié)果,表明多糖分子內(nèi)和多糖分子間均存在氫鍵。在2930 cm-1附近的吸收峰為C-H的振動(dòng)。1724 cm-1的吸收峰處為酯鍵羰基(-COOR)形成的伸縮振動(dòng),1612 cm-1附近為羧基的羰基C=O伸縮振動(dòng),1400～1200 cm-1處的吸收峰為C-H的變形振動(dòng),這些特征吸收峰均表明樣品為多聚糖組分,根據(jù)文獻(xiàn)初步判斷為低酯多糖[22]。1417 cm-1的峰是C-H變角振動(dòng)峰。在1017 cm-1的吸收峰是糖苷鍵C-O-C非對(duì)稱伸縮振動(dòng),說明了多糖中都存在吡喃環(huán)構(gòu)象。在895 cm-1處的吸收峰表明多糖中存在β-構(gòu)型糖[20]。1530 cm-1附近處出現(xiàn)的峰是N-H變角振動(dòng)的信號(hào),表明這四種多糖的紅外光譜圖還具有酰胺結(jié)構(gòu)的特征吸收峰,由此推斷透析得到的四種多糖很可能為氨基多糖[20];四種糖在1450～1200 cm-1之間出現(xiàn)的一些不太尖的峰是羧基伸縮振動(dòng)引起的,是糖類化合物的特征峰;1073 cm-1附近處出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰是由C-O形成的伸縮振動(dòng)區(qū),該吸收峰是C-OH和吡喃環(huán)上的醚鍵C-O-C特征吸收峰,說明四種組分中都存在吡喃糖苷鍵;在916和785 cm-1處出現(xiàn)的微弱吸收峰表明β-型糖苷鍵的存在,表明多糖是吡喃型多糖[20]。

圖4 不同醇沉條件下的多糖紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of polysaccharides under different alcohol precipitation conditions 注:1:過5000分子量膜多糖;2:加Na2SO4過5000 分子量膜多糖;3:過10000分子量膜多糖; 4:加Na2SO4過10000分子量膜多糖。

2.4 抗氧化活性

2.4.1 總抗氧化性 Fe3+-TPTZ可被樣品中的多糖還原成Fe2+的形式,溶液顏色由無色變?yōu)闇\藍(lán)色,在593 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,根據(jù)吸光值的大小可以計(jì)算出樣品的總抗氧化活性[23]。由圖5可知,在一定的濃度范圍內(nèi),多糖溶液的活性與VC相近,說明花楸多糖具有較好的抗氧化性,其抗氧化能力的不同與多糖的單糖組成、分子質(zhì)量分布和結(jié)構(gòu)等多種因素有關(guān)[20]。這說明醇沉中加入無機(jī)鹽后,所提多糖并沒有失去抗氧化活性。

圖5 多糖的總抗氧化能力Fig.5 Total antioxidant capacity of polysaccharides

2.4.2 DPPH自由基清除活性 DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基,甲醇溶液顯紫色,自由基清除劑能夠與DPPH的單電子被配對(duì),在最大吸收波長(zhǎng)處顏色變淺,吸光度也隨之變小[24]。DPPH自由基清除率越高,說明其抗氧化能力越大,以VC為對(duì)照,其抗氧化性如圖6所示。多糖濃度與DPPH自由基清除率基本呈線性關(guān)系,當(dāng)多糖濃度到達(dá)2.0 mg/mL時(shí),其DPPH自由基清除率達(dá)到了72.87%,這與文獻(xiàn)中報(bào)道的同濃度黃秋葵花多糖的DPPH自由基清除能力相似[22]。這說明醇沉加入無機(jī)鹽后,所提多糖具有較好的DPPH自由基清除能力。

圖6 多糖的DPPH自由基清除能力Fig.6 DPPH free radical scavenging ability of polysaccharide

2.4.3 羥自由基清除活性 羥基自由基的清除率能力也是多糖的抗氧化活性指標(biāo)之一。由圖7可以看出,隨著多糖濃度的增加,其羥自由基清除率也隨之增高,當(dāng)加入無機(jī)鹽的醇沉多糖濃度到達(dá)2 mg/mL時(shí),其羥基自由基清除率達(dá)到了68.39%。與文獻(xiàn)報(bào)道的藜麥葉片多糖相比,花楸葉所提多糖的羥自由基清除能力較低[7,25],但這一結(jié)果仍能表明所提花楸葉多糖具有一定的抗氧化活性。

圖7 多糖的羥自由基清除能力Fig.7 Hydroxyl radical scavenging ability of polysaccharid

3 結(jié)論

利用超聲復(fù)合無機(jī)鹽提取的方法從湖北花楸葉中提取多糖,通過正交試驗(yàn)的方法獲得最優(yōu)工藝為:Na2SO4濃度為2.0%,醇沉?xí)r間為12 h,加入無水乙醇體積倍數(shù)為5倍。在該條件下進(jìn)行多次驗(yàn)證試驗(yàn),多糖得率為7.2%±0.12%,而不添加無機(jī)鹽的多糖得率2.54%,這說明添加無機(jī)鹽可以有效提高醇沉過程中的多糖得率。紅外光譜顯示,將提取的多糖經(jīng)過不同分子量半透膜進(jìn)行純化后,無機(jī)鹽的添加并沒有破壞多糖結(jié)構(gòu)。且抗氧化活性實(shí)驗(yàn)也表明,其抗氧化活性依舊很高。這種方法作為一種高效的醇沉方法,可以廣泛用于從植物材料中提取多糖,有較大的應(yīng)用前景。