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(永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖南永州 425100)

金銀花含有有機酸類、黃酮類、三萜及三萜皂苷類、環(huán)烯醚萜類、揮發(fā)油類、醇類、糖類、微量元素等化學(xué)成分[1],其中,綠原酸和黃酮類化合物是金銀花的主要活性成分[2]。綠原酸有顯著的抗菌消炎、清熱解毒的作用,并且對腫瘤有一定的抑制效果;黃酮類化合物具有降血糖、降血脂、增進(jìn)傷口愈合和止痛、增加機體免疫力等功能,同時二者還有抗衰老、抗氧化之功效[3],常應(yīng)用于醫(yī)藥[4]、食品[5]、保健品及日化用品等,作為其優(yōu)質(zhì)安全的基料或功能性添加劑[6-7]。

從金銀花中提取總黃酮和綠原酸的方法主要有溶劑提取法(水提法[8]、乙醇回流法[9]等)、超臨界提取法[10]、輔助提取法(酶解法[11]、微波法[12]、超聲法[13]及超高壓法[14])等。超臨界提取法、超聲波提取法、微波提取法、酶解法、超高壓提取法對金銀花活性成分的提取效率較高[15-16],曹淵等[17]將超聲波法與傳統(tǒng)的水提法和乙醇回流法進(jìn)行了對比,認(rèn)為超聲波法明顯優(yōu)于水提法和乙醇回流法。加壓提取技術(shù)是近年來新推出的中草藥提取工藝,具有節(jié)約提取溶劑、縮短提取時間,且能提高活性成分得率等優(yōu)點[18]。宋文斌等[19]通過加壓提取人參中的人參皂甙,與其他常規(guī)方法(如浸漬法、超聲波法、勻質(zhì)法、機械振蕩法)相比,人參皂甙的提取率要高出25.88%～58.68%。目前在中草藥提取方面,涉及到的研究對象還有婆羅子、三七、赤芍、牛膝、紅豆杉、紅三葉草、艾葉等[20-22]。

上述方法大多側(cè)重于某一類成分的提取,存在原料利用率低、生產(chǎn)周期長、能耗高等問題。為此,本研究應(yīng)用加壓提取技術(shù),同步提取出金銀花中總黃酮和綠原酸并加以分離,對加壓提取的一些影響因素進(jìn)行考察,確定加壓同步提取金銀花中總黃酮和綠原酸的優(yōu)化工藝,為金銀花功能性成分的高效開發(fā)與利用,提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金銀花(50 ℃下干燥，粉碎，60目篩下物) 永州老百姓大藥房提供，經(jīng)永州職院孫興力副教授鑒定為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾；蘆丁對照品 中國藥品生物制品檢定所；綠原酸對照品 中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁和磷酸等 均為分析純。

GSH高溫高壓反應(yīng)釜 威海朝陽化工機械有限公司；FWl77型中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；RE-201D-2L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海達(dá)豐玻璃儀器廠；TGL-18C高速臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-2400紫外可見分光光度計 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；EC2000高效液相色譜儀(色譜柱：Betasil-18C，5 μm，4.6 mm×200 mm) 大連依利特分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取工藝 精密稱取金銀花粉末,置于高溫高壓反應(yīng)裝置內(nèi),一定條件下加壓提取;提取液過濾,濾液在室溫下,以6000 r/min離心15 min得上層清液。黃酮類苷易溶于乙酸乙酯,而綠原酸極微溶于乙酸乙酯,熱水中溶解度大。因此,加入與清液等體積的乙酸乙酯萃取分離黃酮和綠原酸,50 ℃時,振蕩萃取5次,每次萃取時間為5 min,合并萃取液,分別得到含有綠原酸的萃余物和含有總黃酮的萃取物,兩者分別通過大孔吸附樹脂純化[23-24]，冷凍干燥后備用。工藝流程如圖1所示。

圖1 金銀花總黃酮和綠原酸的提取工藝流程圖Fig.1 Process flow diagram on total flavonoids and chlorogenic extraction from Lonicerae japonicae

1.2.2 單因素實驗 參照預(yù)試驗,考慮規(guī)?；a(chǎn)的實際,溶劑選擇對綠原酸和黃酮均有較好溶解能力、且易于回收的甲醇水溶液。通過動力學(xué)和熱力學(xué)兩方面分析,加壓提取的影響因素主要有溶劑(配比)、料液比、提取壓力、提取溫度以及提取時間。

1.2.2.1 甲醇濃度對總黃酮和綠原酸得率的影響 稱取一定質(zhì)量的金銀花樣品,置于高溫高壓反應(yīng)裝置內(nèi),按料液比1∶20 (g/mL)加入濃度為40%、50%、60%、70%、80%的甲醇水溶液,浸潤30 min后,提取溫度為70 ℃,提取壓力為2 MPa,加壓提取30 min后取出,依照1.2.1所述處理后,計算總黃酮和綠原酸的得率。

1.2.2.2 料液比對總黃酮和綠原酸得率的影響 稱取一定質(zhì)量的金銀花樣品,置于高溫高壓反應(yīng)裝置內(nèi),分別按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 (g/mL)加入60%甲醇浸潤30 min,提取溫度為70 ℃,提取壓力為2 MPa,加壓提取30 min后取出,依照1.2.1所述處理后,計算總黃酮和綠原酸的得率。

1.2.2.3 提取壓力對總黃酮和綠原酸得率的影響 稱取一定質(zhì)量的金銀花樣品,置于高溫高壓反應(yīng)裝置內(nèi),按料液比為1∶20 (g/mL)加入60%甲醇浸潤30 min,提取溫度為70 ℃,分別在0.1、1、2、3、4 MPa壓力下提取30 min,依照1.2.1所述處理后,計算總黃酮和綠原酸的得率。

1.2.2.4 提取溫度對總黃酮和綠原酸得率的影響 稱取一定質(zhì)量的金銀花樣品,置于高溫高壓反應(yīng)裝置內(nèi),按料液比為1∶20 (g/mL)加入60%甲醇浸潤30 min,提取溫度分別為50、60、70、80、90 ℃,體系內(nèi)壓力為2 MPa,提取30 min后取出,依照1.2.1所述處理后,計算總黃酮和綠原酸的得率。

1.2.2.5 提取時間對總黃酮和綠原酸得率的影響 稱取一定質(zhì)量的金銀花樣品,置于高溫高壓反應(yīng)裝置內(nèi),依料液比為1∶20 (g/mL)加入60%甲醇浸潤30 min后,提取溫度為70 ℃,提取壓力為2 MPa的條件下,分別提取10、20、30、40、50 min,依照1.2.1所述處理后,計算總黃酮和綠原酸的得率。

1.2.3 正交試驗 基于單因素分析,各因素分別選擇三個水平進(jìn)行正交試驗,試驗設(shè)計如表1所示。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 對比試驗 參照2015版藥典[2],采用超聲波輔助提取金銀花中總黃酮和綠原酸,與本工藝進(jìn)行對比。稱取一定質(zhì)量的金銀花樣品置具塞錐形瓶中,按料液比1∶100 (g/mL)加入50%甲醇,功率250 W,頻率35 kHz,超聲處理30 min,過濾,得綠原酸粗提液。稱取一定質(zhì)量的金銀花樣品置具塞錐形瓶中,按料液比1∶25 (g/mL)加入70%乙醇,功率250 W,頻率35 kHz,超聲處理1 h,過濾得總黃酮粗提液。二者的粗提液經(jīng)本工藝相同的純化方法提純后,計算得率。

加壓同步提取后的金銀花殘渣,可能是內(nèi)部結(jié)構(gòu)已趨于密實,繼續(xù)采用加壓輔助提取,效果欠佳,而采用超聲輔助提取,一定程度上可改善濾渣的內(nèi)部結(jié)構(gòu),實現(xiàn)其殘余成分的提取。因此,采用上述相同的超聲提取參數(shù),考察加壓輔助同步提取工藝,總黃酮和綠原酸二類成分的損失率。損失率的計算方法:損失率(%)=(提取成分的質(zhì)量/原金銀花粉末質(zhì)量)×100。

1.3 檢測方法及得率計算方式

1.3.1 黃酮的測定 黃酮類化合物含有鄰苯二羥基基團,在NaNO2-Al(NO3)3系統(tǒng)中能于510 nm波長處產(chǎn)生特征性吸收,且其吸光強度與該化合物含量成一定比例關(guān)系,因此,本實驗采用NaNO2-Al(NO3)3比色法對金銀花總黃酮進(jìn)行定量[25]。精密稱取蘆丁對照品20.0 mg,75%乙醇(v/v)溶解、定容至100 mL。準(zhǔn)確吸取0.2 mg/mL 的蘆丁對照品溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL分別置于50 mL的容量瓶中,先后加入5% NaNO22 mL、10% Al(NO3)32 mL、4.5% NaOH 20 mL,最后以75%的乙醇定容至50 mL,搖勻。以75%的乙醇為對照,于510 nm波長下測定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的吸光值,以濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以濃度對吸光度進(jìn)行擬合,得線性回歸方程為y=0.0114x+0.0066,R2=0.9996,黃酮濃度在0～48 μg/mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

精密稱量純化后的總黃酮干燥樣品適量,加75%乙醇溶解定容至100 mL,制成約25 μg/mL總黃酮供試溶液。采用標(biāo)準(zhǔn)對照法進(jìn)行檢測,計算出供試總黃酮的濃度,繼而求出純化后總黃酮的含量。

1.3.2 綠原酸的測定 綠原酸的含量參照2015版藥典[2]進(jìn)行檢測。精密稱取綠原酸對照品適量,置于棕色瓶中,加50%甲醇溶解定容至25 mL,制成40 μg/mL的綠原酸對照品溶液。分別精密移取綠原酸對照液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中,50%甲醇溶液定容。流動相為乙腈-0.4%磷酸溶液(13∶87),流速1.0 mL/min,柱溫25 ℃,檢測波長為327 nm,進(jìn)樣量為10 μL,理論板數(shù)以綠原酸峰計算大于1000。在此色譜條件下,依次進(jìn)樣,分別記錄峰面積。以吸收峰面積y為縱坐標(biāo),綠原酸濃度x(μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以濃度對峰面積進(jìn)行擬合,得線性回歸方程為y=43.0396x-56.7253,R2=0.9992,綠原酸濃度在1.6～9.6 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密稱量純化后的綠原酸干燥樣品適量,加50%甲醇溶解定容至25 mL,制成約5 μg/mL的綠原酸供試品溶液。采用外標(biāo)法進(jìn)行檢測,計算出供試品綠原酸的濃度,繼而求出純化后綠原酸的含量。

1.3.3 得率的計算 各提取成分的得率計算方法:得率(%)=(提取成分的質(zhì)量/金銀花粉末質(zhì)量)×100。

提取成分依據(jù)1.3.1和1.3.2的方法分析后,根據(jù)純化后提取成分的含量計算出其質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均平行進(jìn)行三次,單因素實驗數(shù)據(jù)以置信度95%時平均值的置信區(qū)間表示。實驗數(shù)據(jù)以Excel 2013進(jìn)行統(tǒng)計分析,并通過Origin 8.0作圖;正交試驗以正交設(shè)計助手II V3.1進(jìn)行實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 甲醇濃度對總黃酮和綠原酸得率的影響 由圖2可知,總黃酮的得率在60%甲醇中最高;綠原酸的得率隨甲醇濃度的增加呈上升趨勢,甲醇濃度超過60%以后,綠原酸的得率略有降低。表明金銀花中總黃酮和綠原酸在60%的甲醇水溶液中已基本溶出;對于總黃酮,可能是60%的甲醇水溶液與其極性最接近,總黃酮更易溶解出來。綜合來看,甲醇濃度為60%時較合適。

圖2 甲醇濃度對總黃酮和綠原酸得率的影響Fig.2 Effect of methanol concentration on extraction rate of total flavonoids and chlorogenic from Lonicerae japonicae

2.1.2 提取料液比對總黃酮和綠原酸得率的影響 由圖3可知,料液比對總黃酮和綠原酸的得率影響較大。隨著料液比的增大,總黃酮和綠原酸的得率呈先升后降的趨勢,料液比小于1∶20 (g/mL)時,增加提取液的體積,總黃酮和綠原酸的得率顯著增加(p<0.05)。當(dāng)提取料液比超過1∶20 (g/mL)時,提取溶劑增多,傳質(zhì)效果下降,導(dǎo)致得率略有下降;同時,溶劑用量增加,會給溶劑回收帶來麻煩,造成浪費。綜合考慮,選擇較佳的料液比為1∶20 (g/mL)。

圖3 料液比對總黃酮和綠原酸得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids and chlorogenic from Lonicerae japonicae

2.1.3 提取壓力對總黃酮和綠原酸得率的影響 由圖4可知,當(dāng)壓力在2 MPa以下時,隨著壓力的升高,總黃酮和綠原酸的得率呈快速上升趨勢;總黃酮得率在高于2 MPa后,得率的變化幅度緩慢,略有下降。一定程度上,加壓可改變?nèi)軇┑娜芙饽芰瓦x擇性;同時,提取體系的壓力加大,可能會破壞金銀花內(nèi)部的某些細(xì)胞壁,有利于溶劑的滲透,液體溶劑可以快速充入金銀花的毛細(xì)孔內(nèi),提高總黃酮和綠原酸的浸出速度,從而得率明顯升高。但當(dāng)提取壓力增大到一定值時,過高的壓力可能使金銀花緊密壓縮在一起,影響溶劑的滲透浸潤作用,導(dǎo)致得率略有下降[21]。綜合考慮,本試驗選取提取壓力為2 MPa。

圖4 壓力對總黃酮和綠原酸得率的影響Fig.4 Effect of pressure on extraction rate of total flavonoids and chlorogenic from Lonicerae japonicae

2.1.4 提取溫度對總黃酮和綠原酸得率的影響 由圖5可知,當(dāng)提取溫度在60 ℃以下時,隨著溫度的升高,總黃酮和綠原酸的得率呈較快的上升趨勢。因溫度升高,溶劑的黏度和表面張力下降,相應(yīng)地溶劑的滲透性和浸潤能力得到提升;另一方面,升溫使分子的動能增加,促進(jìn)分子運動與物質(zhì)交換。當(dāng)提取溫度超過60 ℃后,總黃酮和綠原酸的得率變化不大。其中,綠原酸的得率稍呈下降趨勢,可能是高溫造成綠原酸出現(xiàn)部分分解狀況,使得率下降;而總黃酮的得率略有提高,綜合考慮提取溫度對總黃酮和綠原酸的得率的影響,提取溫度選取70 ℃。

圖5 溫度對總黃酮和綠原酸得率的影響Fig.5 Effect of temperature on extraction rate of total flavonoids and chlorogenic from Lonicerae japonicae

2.1.5 提取時間對總黃酮和綠原酸得率的影響 由圖6可知,在10～30 min提取時間內(nèi),隨著提取時問的延長,總黃酮和綠原酸的得率逐漸提高;30 min以后,總黃酮和綠原酸的得率呈下降趨勢。提取開始階段隨時間的延長,溶劑浸入物料的量逐漸增多,總黃酮和綠原酸的得率也相應(yīng)增大。隨著提取時間延長,一方面長時間處于高溫高壓狀態(tài),會使金銀花有效成分出現(xiàn)分解,同時其他雜質(zhì)也會被溶出,影響總黃酮和綠原酸的得率。因此,本試驗選取加壓溶劑提取時間為30 min。

圖6 時間對總黃酮和綠原酸得率的影響Fig.6 Effect of time on extraction rate of total flavonoids and chlorogenic from Lonicerae japonicae

2.2 正交試驗結(jié)果

基于單因素實驗結(jié)果,根據(jù)表1設(shè)計選擇L18(35)正交表,按照設(shè)定條件進(jìn)行實驗和數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析,詳見表2。

由表2可知，對金銀花總黃酮得率的影響,由大到小依次為:提取壓力、料液比、提取時間、甲醇濃度和提取溫度,提取總黃酮以A2B2C2D2E2組合最好;影響金銀花綠原酸得率的主次順序為:提取壓力、料液比、提取時間、提取溫度和甲醇濃度,提取綠原酸以A3B2(B3)C2D2E2組合最佳。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

綜合比較二種最佳組合,提取壓力、提取時間和提取溫度相同,即提取壓力為2 MPa,提取時間為30 min,提取溫度為70 ℃。對于甲醇濃度和料液比,A2和A3、B2和B3,相對應(yīng)的二種水平影響差異較小,考慮到成本方面的因素,選擇A2和B2,即甲醇溶液的濃度為60%,料液比為1∶20。綜上分析,金銀花總黃酮和綠原酸的最佳提取條件為甲醇濃度60%,料液比1∶20,提取壓力2 MPa,提取溫度70 ℃,提取時間30 min。

從表3、表4可以看出,同步提取金銀花中總黃酮和綠原酸,壓力對提取總黃酮的影響顯著(p<0.05),而對綠原酸的提取有極顯著(p<0.01)的影響。

表3 總黃酮得率的方差分析Table 3 Variance Analysis of extraction rate of total flavonoids

表4 綠原酸得率的方差分析Table 4 Variance Analysis of extraction rate of chlorogenic acid

2.3 驗證實驗結(jié)果

基于正交試驗分析得到的最佳工藝條件,考察加壓同步提取工藝的穩(wěn)定性。以最優(yōu)工藝對金銀花樣品平行提取3次,總黃酮的得率為15.66%±0.18%,綠原酸的得率為3.89%±0.07%。因此,通過加壓同步提取金銀花總黃酮和綠原酸的工藝具有較好的穩(wěn)定性,兩種成分的得率相對平均偏差均小于2%。

該工藝所有濾渣收集后,參照1.2.4中的方法,提取綠原酸按料液比1∶100加入50%甲醇,功率250 W,頻率35 kHz,超聲處理30 min;提取總黃酮按料液比1∶25加入70%乙醇,功率250 W,頻率35 kHz,超聲處理1 h,二者分別提取三次。經(jīng)分析檢測,綠原酸含量為0.22%,占綠原酸總量的5.35%;總黃酮含量為0.74%,占總黃酮的4.51%。因此,采用加壓輔助同步提取金銀花總黃酮和綠原酸,二種成分的損失率分別為5.35%和4.51%。

根據(jù)文獻(xiàn)[2],采用相同的金銀花樣品和檢測方法,通過超聲波法分別提取綠原酸和黃酮,得率分別為2.92%和13.17%,均比該法總黃酮和綠原酸的得率要低。因此,采用加壓輔助同步提取金銀花總黃酮和綠原酸的工藝可行,二種成分的得率均比較理想。

3 結(jié)論

加壓輔助同步提取金銀花中總黃酮和綠原酸的工藝切實可行。與其它提取方法對比,提取溶劑用量少,同步提取效率高,有效降低單個活性成分的提取成本,且有利于減少提取物的熱降解損失。研究結(jié)果表明,體系的壓力對金銀花中綠原酸和總黃酮的提取有顯著的影響(p<0.05);加壓輔助同步提取金銀花中總黃酮和綠原酸的最佳工藝條件為:溶劑為甲醇水溶液,濃度為60%、料液比1∶20 (g/mL)、提取壓力2 MPa、提取時間30 min、提取溫度70 ℃，此時金銀花中總黃酮和綠原酸的得率分別為15.66%和3.89%,與正交試驗的結(jié)果相吻合,說明該工藝穩(wěn)定、可行。本研究為金銀花產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了理論依據(jù),同時,也為廣泛開發(fā)和利用金銀花資源提供了很好的參考價值。