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(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧省食品安全重點實驗室, 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013; 2.大連中超食品有限公司,遼寧大連 116400; 3.遼寧新大地實業(yè)發(fā)展集團有限公司,遼寧沈陽 110168)

紅樹莓屬薔薇科懸鉤子屬多年生灌木植物,又稱覆盆子、托盤和馬林等,果實營養(yǎng)豐富,有“水果中的阿司匹林”美譽[1]。紅樹莓極不耐儲運,多加工成果汁、果酒及果醬等產(chǎn)品。紅樹莓加工副產(chǎn)物紅樹莓籽中富含黃酮、鞣花酸和原花青素等活性物質(zhì),但對其開發(fā)利用較少,造成資源浪費[2]。紅樹莓籽中原花青素是由黃烷-3-醇單體縮合成的聚多酚類物質(zhì),聚合度在2～4間為低聚體,聚合度高于4為高聚體[3],具有抗氧化、降血糖及降血脂等功能,但其生物活性隨聚合度升高逐漸下降[4]。隨著人們生活水平提高,糖尿病患病率逐漸升高,現(xiàn)降糖藥物多為人工合成,工藝復雜,造價昂貴[5]。研究發(fā)現(xiàn)低聚原花青素對α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,α-Glu)和α-淀粉酶(α-amylase,α-Amy)活性具有抑制作用,避免蔗糖、麥芽糖及淀粉等分解為單糖,減緩餐后血糖升高[6-7],故將高聚原花青素降解具有一定必要性。

目前,高聚原花青素降解主要有酸、堿、氫化及生物酶等降解法。吳迪[8]通過酸法降解原花青素高聚體,平均聚合度由5.51降至2.6。施雅等[9]通過氫化降解將金蕎麥高聚原花青素平均聚合度由6.3降為2.2。蘇惠娟[10]采用N-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶降解高聚原花青素,得到大量單體及二聚體。綜合比較,酸降解產(chǎn)量低,氫化降解安全性要求高,生物酶解菌種選取復雜。而堿法降解相對其它方法具有產(chǎn)量高、成本低及操作便捷等優(yōu)點[11],但其降解條件還需進一步探索。本文通過單因素和響應面試驗優(yōu)化堿降解紅樹莓籽高聚原花青素工藝條件;其次,對紅樹莓籽高聚原花青素及其降解后的低聚原花青素進行α-Amy和α-Glu酶活性抑制試驗,探究對兩種酶活性抑制作用,為其降血糖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅樹莓籽 大連中超食品有限公司;兒茶素標準品(≥98%) 如吉生物科技公司;阿卡波糖(≥98%) 北京索萊寶科技有限公司;氫氧化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、淀粉、香草醛、無水乙醇、冰乙酸、甲醇、石油醚 天津市天力化學試劑有限公司;HPD100大孔樹脂、3,5-二硝基水楊酸、α-Glu(酶活30000 U/g)、α-Amy(酶活2000 U/g)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷 天津市光夏精細化工研究；以上試劑 均為分析純。

ALPHAI-2LDP plus真空冷凍干燥機 北京奧創(chuàng)興業(yè)有限公司;VICTOR X3酶標儀 美國 PerkinElmer公司;MicBio-II酶標板恒溫振蕩器 合肥艾本森科學儀器有限公司;RE-52旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;GT-100高通量研磨儀 北京格瑞德曼有限公司;UV-2700紫外可見分光光度計 日本島津有限公司;BT-100恒流泵 上海青浦滬江西儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅樹莓籽原花青素提取及分級 紅樹莓籽研磨成粉過60目篩后,與石油醚以1∶10 (g/mL)混合,水浴50 ℃下脫脂4 h,抽濾后得紅樹莓籽脫脂粉。將此粉在乙醇濃度80%、料液比1∶15 (g/mL)、溫度50 ℃下提取1 h,抽濾取上清液,55 ℃旋轉蒸發(fā)至無醇味,真空冷凍干燥得原花青素粗提物。紅樹莓籽原花青素粗提物經(jīng)HPD100大孔樹脂吸附飽和后,40%乙醇初次洗脫得到低聚原花青素,再經(jīng)70%乙醇二次洗脫得到平均聚合度為5.44的高聚原花青素[8],冷凍干燥成粉備用。

1.2.2 高聚原花青素堿降解 參照蘇惠娟[10]方法略有更改,準確稱取一定量1.2.1方法制備的紅樹莓籽高聚原花青素粉于試管中,按一定料液比分別加入一定濃度堿液,置于水浴中,在一定溫度及時間下降解后,0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至7.0,終止反應。

1.2.3 堿降解單因素試驗

1.2.3.1 堿液種類選擇 分別以氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉為降解液,在反應溫度60 ℃、反應時間40 min、堿液濃度3%、料液比1∶10 g/mL下,根據(jù)原花青素平均聚合度確定降解堿液。

1.2.3.2 料液比選擇 以亞硫酸鈉為降解液,在反應溫度60 ℃、反應時間25 min、堿液濃度3%下,考察料液比為1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20 (g/mL)時高聚原花青素降解效果,根據(jù)原花青素平均聚合度確定料液比。

1.2.3.3 堿液濃度選擇 以亞硫酸鈉為降解液,在料液比1∶10 (g/mL)、反應溫度60 ℃、反應時間25 min下,考察堿液濃度為1%、2%、3%、4%、5%時高聚原花青素降解效果,根據(jù)原花青素平均聚合度確定堿液濃度。

1.2.3.4 反應溫度選擇 以亞硫酸鈉為降解液,在料液比為1∶10 (g/mL),堿液濃度3%,反應時間25 min下,考察反應溫度為30、40、50、60、70 ℃時高聚原花青素降解效果,根據(jù)原花青素平均聚合度確定反應溫度。

1.2.3.5 反應時間選擇 以亞硫酸鈉為降解液,在料液比1∶10 (g/mL)、堿液濃度3%、反應溫度60 ℃下,考察反應時間為20、30、40、50、60 min時高聚原花青素降解效果,根據(jù)原花青素平均聚合度確定反應時間。

1.2.4 響應面優(yōu)化堿降解試驗 在單因素試驗基礎上,以料液比(A)、堿液濃度(B)、反應溫度(C)、反應時間(D)為因素,原花青素平均聚合度為響應值,采用Design-Expert8.0.6軟件Box-Behnken進行試驗設計,見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.5 原花青素平均聚合度測定

1.2.5.1 原花青素質(zhì)量濃度標準曲線 稱取兒茶素標準品5 mg,甲醇定容至25 mL,分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中,甲醇分別定容至1 mL,分別加入5 mg/mL香草醛-甲醇溶液6 mL和濃鹽酸3 mL,搖勻,30 ℃水浴避光1 h,以甲醇為空白,測定500 nm處吸光值[12],以兒茶素質(zhì)量濃度x(μg/mL)為橫坐標,吸光值y為縱坐標,繪制的標準曲線為y=0.0012x-0.0028,R2=0.9993。

1.2.5.2 原花青素物質(zhì)的量標準曲線 稱取兒茶素標準品2.5 mg,冰乙酸定容至25 mL,分別移取以上溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中,冰乙酸分別定容至1 mL,各加入5 mg/mL香草醛-乙酸溶液6 mL和濃鹽酸3 mL,30 ℃水浴避光反應1 h,以冰乙酸為空白,測定500 nm處吸光值[8,10],以兒茶素物質(zhì)的量濃度x(μmol/mL)為橫坐標,吸光值y為縱坐標,繪制的標準曲線為:y=2.4899x-0.0063,R2=0.9995。

1.2.5.3 原花青素平均聚合度測定 堿降解得到的不同聚合度原花青素配制成1 mg/mL樣液,根據(jù)1.2.5.1和1.2.5.2方法得到原花青素質(zhì)量濃度及物質(zhì)的量,計算原花青素平均聚合度[12],見公式(1)。

式(1)

式中:m-原花青素質(zhì)量,μg;M-兒茶素相對分子質(zhì)量,290.27;n-原花青素物質(zhì)的量,μmol。

1.2.6 原花青素對α-Glu和α-Amy活性抑制試驗

1.2.6.1α-Glu活性抑制測定 分別準確稱取一定質(zhì)量高聚原花青素及其降解后的低聚原花青素粉末,配制成濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL的溶液,同時以阿卡波糖作為陽性參照物,分別取上述不同濃度的溶液60 μL于96孔酶標板中,各加入50 μL 0.2 U/mL的α-Glu,于酶標板恒溫振蕩器中振蕩均勻后37 ℃下保溫10 min。再加入50 μL的5.0 mmol/L 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷振蕩均勻后37 ℃下保溫20 min。最后,在405 nm波長處測吸光度。以緩沖溶液作空白,其它條件不變,測吸光度。每個樣品重復3次取平均值[13-14],抑制率計算見公式(2)。

式(2)

式中:AS-樣品在405 nm波長處吸光度;A0-空白在405 nm波長處吸光度。

1.2.6.2α-Amy活性抑制測定 分別取40 μL 1.2.6.1中配制的各濃度高聚原花青素、降解后的低聚原花青素及阿卡波糖溶液于25 mL試管中,并以等量磷酸鈉緩沖溶液做空白,加入200 μL 1.0 U/mL的α-Amy溶液,在37 ℃水浴中保溫10 min,加入400 μL 1.0 g/100 mL的可溶性淀粉于25 ℃反應10 min。加入1.0 mL DNS試劑終止反應。在沸水浴中加熱5 min后冷卻至室溫,加10 mL蒸餾水稀釋,在540 nm波長處測吸光度,抑制率計算同公式(2)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Word 2003軟件對數(shù)據(jù)進行整理繪圖,SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析(p=0.05)。

2 結果與分析

2.1 堿降解單因素試驗結果與分析

2.1.1 堿液種類對降解效果影響分析 堿液種類對紅樹莓籽高聚原花青素降解效果如圖1所示,氫氧化鈉、碳酸氫鈉及亞硫酸氫鈉降解高聚原花青素,其平均聚合度差異不顯著(p>0.05);但與碳酸鈉和亞硫酸鈉平均聚合度差異顯著(p<0.05)。高聚原花青素降解后平均聚合度由低到高依次為亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉和碳酸鈉,亞硫酸鈉降解效果最佳,是因亞硫酸鈉溶液與其它堿液相比,水解后pH適中,促進高聚原花青素末端C-C鍵斷裂,達到降解目的[11]。因此,選亞硫酸鈉為降解劑。

圖1 堿液種類對降解效果影響Fig.1 Effects of alkali types on degradation注：不同小寫字母表示組內(nèi)差異顯著, p<0.05;圖2～圖5,圖7～圖8同。

2.1.2 料液比對降解效果影響分析 料液比對紅樹莓籽高聚原花青素降解效果影響如圖2所示,料液比在1∶1～1∶10 (g/mL)內(nèi),原花青素平均聚合度顯著下降(p<0.05);料液比為1∶10 (g/mL)時,降解效果最佳;隨后原花青素平均聚合度顯著升高(p<0.05),可能因高聚原花青素降解體系中隨堿液比例增大,體系中pH發(fā)生變化,當料液比為1∶10 (g/mL)時,體系pH適于高聚原花青素的降解[10]。因此,選取料液比為1∶10 (g/mL)。

圖2 料液比對降解效果影響Fig.2 Effects of ratio-liquid ratio on degradation

2.1.3 堿液濃度對降解效果影響分析 堿液濃度對紅樹莓籽高聚原花青素降解效果影響如圖3所示,堿液濃度1%～2%時平均聚合度顯著下降(p<0.05);堿液濃度為2%時,高聚原花青素降解效果達最佳;堿液濃度2%～3%時差異不顯著(p>0.05);3%～5%時平均聚合度顯著升高(p<0.05),說明亞硫酸鈉溶液濃度過大,不利于高聚原花青素降解。因此,選用堿液濃度為2%。

圖3 堿液濃度對降解效果影響Fig.3 Effects of liquor concentration on degradation

2.1.4 反應溫度對降解效果影響分析 反應溫度對紅樹莓籽高聚原花青素降解效果影響如圖4所示,溫度在30～50 ℃時平均聚合度略有降低,但差異不顯著(p>0.05)。溫度在50～60 ℃時平均聚合度顯著下降(p<0.05),可能此溫度下,亞硫酸鈉溶解度較大,與底物反應更加充分。溫度在60～70 ℃時平均聚合度顯著升高(p<0.05),是因裂解的原花青素單體在過高溫下發(fā)生氧化聚合反應[10]。故選取反應溫度為60 ℃。

圖4 反應溫度對降解效果影響Fig.4 Effects of reaction temperature on degradation

2.1.5 反應時間對降解效果影響分析 反應時間對紅樹莓籽高聚原花青素降解效果影響如圖5所示,降解20～30 min時平均聚合度降低趨勢不顯著(p>0.05),降解30～40 min時平均聚合度顯著下降(p<0.05),隨后平均聚合度逐漸升高,是因降解劑與底物反應需要一定時間,且時間過長對反應不利。故選擇反應時間為40 min。

圖5 反應時間對降解效果影響Fig.5 Effects of reaction time on degradation

2.2 堿降解工藝優(yōu)化

2.2.1 模型建立與顯著性分析 根據(jù)表1確定的響應面因素與水平,利用Design Expert-8.0.6軟件,通過Box-Behnken設計得到29組堿降解試驗,中心點試驗重復5次,結果見表2。利用響應面軟件對表2數(shù)據(jù)進行分析,得到響應面試驗模型回歸系數(shù)及顯著性檢驗結果,見表3。

表2 響應面試驗設計方案及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗結果Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

2.2.2 響應面交互作用分析 根據(jù)回歸方程得到圖6中各因素交互作用的等高線和響應面圖,響應面圖較直觀地反映了各自變量對原花青素平均聚合度的影響,如響應曲面坡度越陡峭,等高線圖中橢圓越扁,表明因素對平均聚合度影響較大,即影響顯著,反之不顯著[15]。根據(jù)等高線圖和響應面圖形狀,可分析兩兩因素對紅樹莓籽原花青素平均聚合度交互作用的影響。圖6a1和6a3中響應面圖坡度陡峭,圖6b1和6b3等高線圖均略扁,故交互項AB和AD對高聚原花青素降解效果影響顯著;圖6a2中響應面圖坡度陡峭,但圖6b2中等高線較橢且較密集,圖6a4、6a5和6a6中響應面圖坡度較陡峭,圖6b2、6b4、6b5和6b6等高線圖均呈橢圓,且等高線密集,故交互項AC、BC、BD和CD對高聚原花青素降解效果影響均極顯著,與模型系數(shù)顯著性檢驗結果一致。由圖6a1、6a2、6a3、6a4、6a5和6a6可知,當其它因素取零水平時,隨料液比、堿液濃度、反應溫度及反應時間單一變量的增大,原花青素平均聚合度均呈先升高后降低趨勢,故在所選因素參數(shù)范圍內(nèi)均存在極值,可對紅樹莓籽高聚原花青素降解最佳工藝進行預測。由圖6的響應面圖和等高線圖及F值可知兩因素對高聚原花青素降解效果影響大小依次為:BC>AC>BD>CD>AB>AD。

圖6 各因素交互作用響應面圖及等高線圖Fig.6 Responese surface and contour plots注：a1～a6是各因素響應面圖；b1～b6是各因素等高線圖。

2.2.3 驗證試驗結果分析 通過響應面模型確定原花青素降解最佳條件:亞硫酸鈉濃度2.13%、料液比1∶10.25 g/mL、降解時間41.44 min、反應溫度60.12 ℃,原花青素平均聚合度理論值為2.12?？紤]實際操作條件,將降解工藝條件修正為:亞硫酸鈉濃度2.13%、料液比1∶10.25 g/mL、反應時間42 min、反應溫度60 ℃,此條件下進行3組驗證試驗,原花青素平均聚合度為(2.14±0.11)<4,即為低聚原花青素,相對誤差1.43%<5%,說明經(jīng)過該響應面優(yōu)化得到的高聚原花青素降解工藝參數(shù)準確可靠,具有實際應用價值。

2.3 原花青素對α-Glu和α-Amy活性抑制結果分析

2.3.1 對α-Glu活性抑制結果分析 如圖7所示,隨阿卡波糖、低聚及高聚原花青素質(zhì)量濃度增大,α-Glu抑制率均顯著升高(p<0.05),質(zhì)量濃度越高,酶活抑制性越好,可能是因阿卡波糖、低聚及高聚原花青素降低了α-Glu活性,使其水解硝基苯-β-D-葡萄糖醛酸苷為對硝基苯酚能力降低[16];阿卡波糖、低聚及高聚原花青素對α-Glu的IC50分別為0.338、0.291和0.730 mg/mL。低聚原花青素對α-Glu活性抑制效果遠強于高聚原花青素,略高于阿卡波糖,說明高聚原花青素降解后得到的低聚原花青素對α-Glu活性抑制效果明顯提高,且與阿卡波糖抑制效果相似,具有一定降糖功效。

圖7 紅樹莓籽原花青素對α-Glu活性抑制Fig.7 Inhibitory effect of red raspberry seeds proanthocyanidins on the activity of α-Glu

2.3.2 對α-amy活性抑制作用結果分析 圖8所示,隨阿卡波糖、低聚及原花青素濃度增大,對α-Amy活性抑制效果顯著升高(p<0.05),是因α-Amy活性被抑制,進而抑制淀粉水解為還原糖[17-18]。阿卡波糖、低聚及高聚原花青素對α-Amy的IC50分別為0.354、0.342和0.578 mg/mL。高聚原花青素對α-Amy活性抑制效果較低,低聚原花青素及阿卡波糖濃度低于0.4 mg/mL時,低聚原花青素抑制效果高于阿卡波糖,但濃度高于0.4 mg/mL后,抑制效果低于阿卡波糖,整體抑制效果與阿卡波糖效果相近,說明降解得到的低聚原花青素活性更高,可通過抑制α-Amy活性,減少淀粉被人體消化吸收,抑制餐后血糖水平的升高。

圖8 紅樹莓籽原花青素對α-Amy活性抑制作用Fig.8 Inhibitory effect of red raspberry seeds proanthocyanidins on the activity of α-Amy

3 結論

紅樹莓籽脫脂后,經(jīng)提取和分級純化得到高聚原花青素,通過單因素試驗確定高聚原花青素降解劑為亞硫酸鈉,并在此基礎上進行響應面優(yōu)化,確定最佳降解條件:堿液濃度2.13%、料液比1∶10.25 g/mL、反應時間42 min、反應溫度60 ℃,此條件下原花青素平均聚合度為2.14±0.11,屬低聚原花青素。高聚原花青素降解前后體外降血糖活性比較表明,降解后的低聚原花青素對α-Glu和α-Amy活性抑制效果更強,阿卡波糖、低聚及高聚原花青素對α-Glu的

IC50分別為0.338、0.291和0.730 mg/mL,對α-Amy的IC50分別為0.354、0.342和0.578 mg/mL,高聚原花青素降解提高了其利用率,對α-Glu和α-Amy抑制效果大幅度增強,且低聚原花青素抑制效果與阿卡波糖相近,為新型降血糖藥物開發(fā)提供理論基礎。