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(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430070; 2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏銀川 750021)

柚子(CitrusgrandisOsbeck),別名拋、文旦、朱欒、氣柑、雷柚等,屬蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus)果實(shí)。柚子起源于東南亞、印度北部或中國(guó)南部一帶,在我國(guó)已有三千多年的栽培歷史[1]。琯溪蜜柚(Citrusgrandis(L.)Osbeck cv. Guanximiyu)原產(chǎn)于我國(guó)福建省漳州市平和縣,因果大無(wú)核、皮薄多汁、口味香甜,稱為“柚中之冠”,是我國(guó)主栽品種之一。我國(guó)柚子年產(chǎn)量在200萬(wàn)噸以上[1],琯溪蜜柚的產(chǎn)量占五分之二,消費(fèi)后產(chǎn)生大量的柚皮不能被利用而污染環(huán)境?，g溪蜜柚皮的質(zhì)量占整個(gè)果實(shí)的20%左右,含有水分、脂肪、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分以及類(lèi)黃酮、類(lèi)檸檬苦素、類(lèi)胡蘿卜素、香精油和果膠、纖維素等活性成分[2],目前因尚無(wú)有效途徑利用而造成資源浪費(fèi)。

近年來(lái),柚皮作為吸附劑處理廢水的研究較多[3-4],主要是白皮層富含纖維素,可用于吸附染料和重金屬。但目前沒(méi)有解決處理廢水后柚皮的辦法,丟棄又會(huì)造成環(huán)境的二次污染,在實(shí)踐中柚皮用于廢水處理任重而道遠(yuǎn)。一些學(xué)者研究從柚皮中提取活性成分,如提取果膠、柚皮苷、膳食纖維、香精油等[5-7],這些方法需要大量的有機(jī)溶劑,提取后殘?jiān)荒鼙焕?造成其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的浪費(fèi)。尋找對(duì)環(huán)境友好、能有效利用柚皮的生物方法顯得極為緊迫,曹銘[8]用酶法制糖、發(fā)酵燃料乙醇,對(duì)加酶量、固液比等酶解條件進(jìn)行優(yōu)化,但未確定最佳的酶解溫度和酶解時(shí)間,沒(méi)有對(duì)柚皮酶解條件進(jìn)行系統(tǒng)研究。

柚皮的主要成分是果膠和纖維素[9],還有一些半纖維素和木質(zhì)素。纖維素和半纖維素中的羥基和多酚基團(tuán)通過(guò)各種方式(靜電吸附、絡(luò)合、氫鍵等)緊密連接并形成了多孔的海綿層[10];果膠物質(zhì)構(gòu)成了相鄰細(xì)胞中間層的粘結(jié)物,使組織細(xì)胞緊密粘結(jié)在一起,保持果實(shí)的水分[9],主要存在于外皮層。柚皮中其它成分如類(lèi)黃酮、類(lèi)胡蘿卜素等,被包裹在這些多糖物質(zhì)形成的特殊結(jié)構(gòu)中,為了充分利用柚皮中營(yíng)養(yǎng)成分,首先將柚皮中多糖分解成微生物可利用的單糖,通過(guò)酵母菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化成酒精,乙醇將柚皮中類(lèi)黃酮、芳香物質(zhì)等活性成分溶解出來(lái),制成色香味俱佳的果酒,或?qū)⒁掖颊麴s后用作燃料,發(fā)酵后殘?jiān)€可用于動(dòng)物飼料。因此,本文用果膠酶水解柚皮,以果膠酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度和料液比為單因素,通過(guò)單因素試驗(yàn)確定合適的水平,根據(jù)Box-Behnken方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)并建立模型,優(yōu)化柚皮酶解條件,將柚皮多糖最大程度地水解成還原糖,并分析各因素間的交互作用,為有效利用柚皮奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

果膠酶(酶活10000 U/g) Biosharp公司;3,5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、丙三醇、葡萄糖、鹽酸、甲基紅 分析純,購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;琯溪蜜柚 市售(產(chǎn)自福建省漳州市平和縣),新鮮柚子剝皮后得柚皮,包括黃色的外皮層(flavedo)和白色的海綿層(albedo),占整個(gè)柚子質(zhì)量的20.742%±3.667%。

Joyoung料理機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司;電子萬(wàn)用爐 北京市光明醫(yī)療儀器有限公司;AL240電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠;GZX-9240 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州恒巖儀器有限公司;722型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;MJ33水分快速測(cè)定儀 梅特勒-托利多儀器有限公司;K9840自動(dòng)凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 柚皮中營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定方法 水分及揮發(fā)物的測(cè)定:直接干燥法[11];脂肪的測(cè)定:索氏抽提法[12];蛋白質(zhì)的測(cè)定:凱氏定氮法[13];灰分的測(cè)定:總灰分的測(cè)定[14];果膠的測(cè)定:果膠酸鈣重量法;粗纖維的測(cè)定:重量法[15]。

1.2.2 還原糖及總糖的測(cè)定方法 還原糖和總糖的測(cè)定采用二硝基水楊酸比色法[15]。樣品預(yù)處理:稱取適量的新鮮柚子皮,加一定量的水打漿后,取20～25 g漿液,精確至0.0001 g。用70%～80%的乙醇溶液作提取劑,50 ℃回流提取1 h后,用水定容至250 mL,搖勻后靜置30 min。用濾紙過(guò)濾,棄去初濾液,收集濾液備用。此樣液用于測(cè)定還原糖含量。

取上述濾液50 mL于小燒杯中,加入5 mL 6 mol/L鹽酸混勻,68～70 ℃水浴15 min,取出迅速冷卻至室溫,加入2滴甲基紅指示劑,用20%的氫氧化鈉溶液中和至紅色褪去,定容100 mL。此樣液用于測(cè)定總糖含量(總糖是指具有還原性的糖和在測(cè)定條件下能水解成還原糖的低聚糖的總和,不包括淀粉)。

測(cè)定方法:取0、1、2、3、4、5、6、7 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL,分別置于干燥的25 mL比色管中,各加入3,5-二硝基水楊酸溶液2 mL,置沸水浴中2 min,顯色,然后以流水迅速冷卻,用水定容25 mL,搖勻。以零號(hào)管作參比,在540 nm處測(cè)定其吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為y=0.1478x-0.0166,R2=0.9985,其中x為葡萄糖的濃度(mg/mL),y為吸光度。取樣品1 mL(含糖3～4 mg)測(cè)含量糖量，其余步驟相同，然后根據(jù)回歸方程,分別計(jì)算出樣品中還原糖和總糖的含量。

還原糖增長(zhǎng)倍數(shù)(Y)=(酶解后還原糖含量-酶解前還原糖含量)/酶解前還原糖含量

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 果膠酶添加量的確定 稱取適量柚皮,料液比1∶4 (g/mL)打漿,稱取20～25 g漿液,精確至0.0001 g,以新鮮柚皮為干物基準(zhǔn),分別添加0、50、100、150、200 U/g的果膠酶,在50 ℃水浴中酶解2 h,然后測(cè)定樣液中還原糖含量。

1.2.3.2 酶解時(shí)間的確定 稱取適量柚皮,料液比1∶4 (g/mL)打漿,稱取20～25 g漿液,精確至0.0001 g,添加100 U/g的果膠酶,酶解溫度為50 ℃,酶解時(shí)間分別為0、1、2、3、4 h,然后測(cè)定樣液中還原糖含量。

1.2.3.3 酶解溫度的確定 稱取適量柚皮,料液比1∶4 (g/mL)打漿,稱取20～25 g漿液,精確至0.0001 g,添加100 U/g的果膠酶,酶解時(shí)間為2 h,酶解溫度分別在20、30、40、50、60 ℃,然后測(cè)定樣液中還原糖含量。

1.2.3.4 料液比的確定 稱取適量柚皮,按料液比1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 (g/mL)制成漿液,稱取20～25 g漿液,精確至0.0001 g,添加100 U/g的果膠酶,50 ℃酶解2 h,測(cè)定還原糖含量。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 為進(jìn)一步優(yōu)化柚皮的酶解條件,本試驗(yàn)應(yīng)用軟件Design Expert 8.0設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。以果膠酶添加量(A)、酶解時(shí)間(B)、酶解溫度(C)、料液比(D)為自變量,以酶解后漿液中還原糖含量與酶解前漿液中還原糖含量相比的增長(zhǎng)倍數(shù)Y為響應(yīng)值,試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3次取平均值,用Oringin 8.0作圖,SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 柚皮的營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定結(jié)果

從表2可以看出,柚皮中含量最多的是水分及揮發(fā)物,固形物中含量較多的是糖類(lèi)物質(zhì),除還原糖等可溶性糖以外,含量較高的是果膠和纖維素。果膠含量在6%以上,比蘋(píng)果渣中的果膠含量高[16],其它營(yíng)養(yǎng)成分如蛋白質(zhì)、脂肪、灰分的含量較少。因此,將柚皮中的果膠和纖維素水解成單糖是利用柚皮的前提條件。

表2 琯溪蜜柚皮的營(yíng)養(yǎng)成分Table 2 Nutrient contents in the peel of Guanximiyu

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 果膠酶添加量的確定 從圖1可以看出,隨著果膠酶添加量的增加,樣液中還原糖含量先增加后趨于平穩(wěn),這與曹銘[8]的研究結(jié)果一致。當(dāng)果膠酶添加量從0～150 U/g時(shí),樣液中還原糖含量急劇增加;當(dāng)果膠酶添加量大于150 U/g時(shí),還原糖含量趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)榧尤牍z酶后,果膠被水解為半乳糖醛酸和少量的單糖[17],而且一般商業(yè)果膠酶中都含有纖維素酶,可將纖維素水解成纖維二糖和葡萄糖[18],使得樣液中還原糖含量增加。但是隨著酶添加量的增加,產(chǎn)物濃度增大,當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡以后,酶的作用受到抑制[19]。因此,選擇150 U/g為果膠酶的最適添加量,隨著果膠酶添加量的增加,生產(chǎn)成本增大,響應(yīng)面試驗(yàn)中選50、100、150 U/g為3個(gè)水平。

圖1 果膠酶添加量對(duì)還原糖含量的影響Fig.1 Effect of pectinase dosage on the reducing sugar content

2.2.2 酶解時(shí)間的確定 從圖2可以看出,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),樣液中還原糖含量先增加后減少,當(dāng)酶解2 h時(shí)還原糖含量最多。這是因?yàn)閯傞_(kāi)始隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),果膠酶的作用更充分[20],果膠和纖維素被水解,還原糖含量增加;當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)2 h時(shí),可能還原糖暴露在空氣中的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而被氧化,或者被其它大分子物質(zhì)吸附,使得還原糖含量下降。因此,選擇2 h為柚皮酶解的最佳時(shí)間，響應(yīng)面試驗(yàn)1、2、3 h。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)還原糖含量的影響Fig.2 Effect of enzymatic time on the reducing sugar content

2.2.3 酶解溫度的確定 由圖3可知,在20～30 ℃的酶解溫度范圍內(nèi),還原糖含量上升明顯;30～50 ℃的溫度范圍內(nèi),還原糖含量增加緩慢;當(dāng)溫度大于50 ℃時(shí),還原糖含量下降。這可能是因?yàn)楫?dāng)溫度升高時(shí)酶解反應(yīng)速率加快[19],樣液中還原糖含量增加;當(dāng)溫度超過(guò)50 ℃時(shí),果膠酶可能被鈍化使水解受到抑制[20]。因此,選擇50 ℃為酶解的最佳溫度，響應(yīng)面試驗(yàn)選40、50、60 ℃三個(gè)水平。。

圖3 酶解溫度對(duì)還原糖含量的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the reducing sugar content

2.2.4 料液比的確定 由于加水量不同,比較不同料液比中還原糖含量,不能以酶解液中還原糖含量進(jìn)行比較,按照柚皮質(zhì)量換算成產(chǎn)生的還原糖含量。

從圖4可以看出,隨著加水量的增多,樣液中的還原糖含量先增加后減少,料液比為1∶4時(shí)產(chǎn)生的還原糖最多。這可能是因?yàn)殡S著加水量的增多,樣液中傳質(zhì)阻力減小[8],酶解效率提高,還原糖含量增加;當(dāng)加水量繼續(xù)增多,可能還原糖暴露在空氣中的比表面積增大而更容易被氧化,當(dāng)加水量超過(guò)4倍以上時(shí),還原糖含量反而下降。因此,選擇1∶4為料液比的最佳水平，響應(yīng)面試驗(yàn)選料液比1∶3、1∶4、1∶5 (g/mL)三個(gè)水平。。

圖4 料液比對(duì)還原糖含量的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the reducing sugar content

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 回歸模型的建立與分析 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,運(yùn)用Design-expert 8.0中Box-Behnken試驗(yàn)方法,對(duì)果膠酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度、料液比4個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),每個(gè)編號(hào)的試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取平均值,試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 3 Experimental design and corresponding results for the Box-Behnken method

應(yīng)用軟件Design Expert 8.0對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,建立四元二次響應(yīng)面回歸方程:Y=-1.62527-0.03156A+0.62798B+0.22978C-1.35002D+2.90E-04AB+8.18E-05AC+5.04E-03AD-5.98E-03BC+0.0608BD-0.01586CD+7.97E-05A2-0.10719B2-1.80E-03C2+0.21123D2。

由表4可知,回歸模型極顯著(p<0.001),說(shuō)明回歸方程是可用的;失擬項(xiàng)僅為0.067,并且對(duì)應(yīng)的p>0.05,說(shuō)明所得方程與實(shí)際擬合中非正常誤差所占比例非常小;R2=0.9848說(shuō)明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間有高度的相關(guān)性。綜上所述,該回歸方程可用于柚皮酶解工藝的優(yōu)化。由F值可以看出,影響柚皮酶解效果的各因素主效關(guān)系為果膠酶添加量(A)>酶解溫度(C)>料液比(D)>酶解時(shí)間(B),并且4個(gè)因素的影響均極顯著。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 ANOVA for regression model

由回歸模型數(shù)據(jù)分析得到,柚皮酶解的最佳工藝條件為:果膠酶添加量150.00 U/g,料液比1∶5 (g/mL),40.30 ℃溫度下酶解3.00 h,酶解后漿液中還原糖含量比酶解前增長(zhǎng)的預(yù)測(cè)倍數(shù)為2.62。考慮到實(shí)際試驗(yàn)操作條件,將酶解工藝修正為果膠酶添加量150 U/g,酶解溫度40 ℃,酶解時(shí)間3 h,料液比1∶5。在此條件下,酶解后樣液中還原糖含量為21.76 mg/g,比酶解前增長(zhǎng)了2.54倍,與預(yù)測(cè)值2.62倍接近,說(shuō)明此試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂尚小?/p>

2.3.2 各因素間交互作用分析 由表4可知,果膠酶添加量與酶解時(shí)間、果膠酶添加量與酶解溫度、酶解時(shí)間與酶解溫度、酶解時(shí)間與料液比對(duì)響應(yīng)值交互作用不顯著(p>0.05),果膠酶添加量與料液比、酶解溫度與料液比對(duì)響應(yīng)值交互作用極顯著(p<0.01)。根據(jù)二次回歸模型方程可以得到任意兩個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值作用的響應(yīng)面圖,通過(guò)考察響應(yīng)面的形狀分析各因素間交互作用對(duì)柚皮酶解效果的影響,圖5為果膠酶添加量(A)和料液比(D)、酶解溫度(C)和料液比(D)的曲面圖。

圖5 各因素之間交互作用的曲面圖Fig.5 Surface diagrams for interaction of two different factors

由圖5a可以看出,果膠酶添加量和料液比的響應(yīng)面坡度比較陡峭,等高線排列較緊密且呈橢圓形,說(shuō)明果膠酶添加量和料液比之間的交互作用明顯。由圖5b可以看出,酶解溫度和料液比的響應(yīng)面坡度較平緩,等高線較密集但呈不規(guī)則形狀,說(shuō)明酶解溫度和料液比之間的交互作用不如果膠酶添加量和料液比的交互作用明顯,這與p值相一致。

3 結(jié)論

本文系統(tǒng)研究了果膠酶水解柚皮的條件,以果膠酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度和料液比為單因素,通過(guò)試驗(yàn)確定合適的水平,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)方法優(yōu)化酶解條件,并根據(jù)實(shí)際可操作性,得到柚皮酶解的最佳工藝參數(shù):料液比為1∶5,果膠酶添加量150 U/g,酶解溫度40 ℃,酶解時(shí)間3 h。在此條件下,酶解后樣液中還原糖含量為21.76 mg/g,比酶解前增長(zhǎng)了2.54倍,將柚皮多糖水解成還原糖,為酵母菌發(fā)酵并利用柚皮創(chuàng)造條件。