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(陜西理工大學(xué),陜西省資源生物重點實驗室,生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西漢中 723000)

沙門氏菌(Salmonella)是一種全球性極為嚴重的人畜共患致病菌,是引起食物污染的主要病原菌[1]。在我國細菌性食物中毒有將近80%是由于沙門氏菌感染引起的,多數(shù)是來源于肉制品。自1885年到現(xiàn)在人們已經(jīng)確定了傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等多與人類食源性疾病有關(guān)系,可以引起人和動物敗血癥和腸胃炎,并能引起人類食物中毒,如水樣腹瀉、腹部絞痛、發(fā)熱痛、惡心和嘔吐,甚至死亡[2]。由于抗生素的不規(guī)范使用、濫用使得沙門氏菌對于大多抗生素,如β-內(nèi)酰胺類抗生素、氨基糖苷類抗菌藥物、氟喹諾酮類、磺胺類等藥物產(chǎn)生了多重耐藥性[3]。這種現(xiàn)象出現(xiàn)的主要原因是沙門氏菌獲得了耐藥基因[4-6]。Figueroa等[7]研究發(fā)現(xiàn)沙門氏菌對6類常用抗生素的耐藥率已經(jīng)超過了70%。因此,中藥防治沙門氏菌不失為一個可行的方法。中藥具有副作用小、效果好等特點,能有效治愈由沙門氏菌引起的各種疾病,這樣不僅可以很大程度上減少抗生素的大量使用,而且也避免沙門氏菌產(chǎn)生耐藥性[8]。

蒲公英最早記載于《唐本草》，已有數(shù)千年的研究歷史[9]。蒲公英為菊科多年生草本植物,又別名黃花地丁、婆婆丁和奶汁草等,是一種藥食兩用的多年生草本植物,臨床應(yīng)用廣泛,為常用的清熱解毒中藥[10-11]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明蒲公英具有抗菌、消炎、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、祛色斑和對心臟有保護作用等功能[12-17]。蒲公英中含有多種功能性成分,蒲公英多糖具有一定的抗氧化作用,蒲公英黃酮對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、糞腸球菌、黑曲霉等多種致病菌都有很好抑菌功效[18-21]。蒲公英脂溶性成分大多為烷類、烷酸類、烯酸類、醇類等物質(zhì),其中9,12,15-十八烷三烯酸、9,12-十八烷二烯酸、十六酸、3,7,11,15-四甲基-2-十六烷烯-1-醇、菜油甾醇、十八酸為主要組成成分,這些成分不僅具有一定的抗氧化活性,且對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏菌及白色念珠菌都有良好的抑菌效果[22-23]。但是,蒲公英脂溶性成分對沙門氏菌抑菌及其機理研究鮮有報道,近期對蒲公英脂溶性成分研究主要集中在抗氧化活性和菌種抑菌等初步分析研究,很少深入到對其菌種抑菌機理方面。

本實驗主要通過簡單易行的索氏提取法提取蒲公英脂溶性成分[22],并利用該成分對沙門氏菌抑菌活性及抑菌機理進行了初步研究,從而為中藥蒲公英治療由沙門氏菌引起的疾病提供了基礎(chǔ)理論依據(jù),也為蒲公英資源的藥物開發(fā)和利用做出有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蒲公英(干品) 于陜西省漢中市中藥材市場購買,經(jīng)陜西理工大學(xué)李新生教授鑒定為蒲公英;鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium,ATCC14028) 由陜西理工大學(xué)陜西省資源生物重點實驗室菌種保藏中心提供,-80 ℃低溫冰箱凍存?zhèn)溆?碘化丙啶(PI) Sigma公司;瓊脂粉、蛋白胨、酵母浸粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;氯化鈉 天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司;石油醚 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;無水乙醇 天津市富宇精細化工有限公司;二甲基亞砜(DMSO) 分析純,天津市博迪化工有限公司。

HC-250型搖擺式粉碎機 永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司;DHG-9203A型真空干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;2XZ型旋片式真空泵 臨海市譚氏真空設(shè)備有限公司;HH-S4型電熱恒溫水浴鍋;THZ-82型數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器 常州市國立實驗設(shè)備研究所;FA2204B型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;TGL-20型臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;UV2550型分光光度計 日本島津公司;DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SW-CJ-1D型單人超凈工作臺 上海蘇凈實業(yè)有限公司;LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;MF53型倒置熒光顯微鏡 日本Nikon公司;VEGA3-XMU型掃描電子顯微鏡 廣州高測儀器有限公司;LGJ-18C型真空冷凍干燥機 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蒲公英脂溶性成分的提取 蒲公英于70 ℃下干燥至恒重,粉碎機粉碎后過60目篩;取一定量的蒲公英粉末用濾紙包住置于索氏提取儀中,以石油醚為提取溶劑，在60 ℃恒溫水浴鍋下回流提取10 h,得到黃綠色的蒲公英脂溶性成分[23]。初步濃縮干燥石油醚溶劑得到浸膏,與水1∶1混合于分液漏斗中靜置分層并棄去水層及水溶性色素,重復(fù)5次。然后于真空干燥箱中40 ℃揮發(fā)多余石油醚干燥得蒲公英脂溶性成分。

1.2.2 脂溶性成分的抑菌活性(紙片抑菌法) 將沙門氏菌菌種從-20 ℃冰箱中取出復(fù)蘇達到室溫,轉(zhuǎn)涂于LB固體培養(yǎng)平板上,于培養(yǎng)箱37 ℃過夜活化培養(yǎng)。再挑單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、170 r/min培養(yǎng)5～6 h。當(dāng)OD600為0.6時,將其涂布于LB固體培養(yǎng)基上。吸取15 μL用二甲基亞砜(DMSO)溶解的蒲公英脂溶性成分滴加到直徑6 mm的無菌濾紙片上,用鑷子將其貼于涂布有沙門氏菌的LB平板上。對照紙片為含15 μL DMSO的溶劑。然后于37 ℃倒置培養(yǎng)18～24 h,觀察實驗結(jié)果,測定抑菌圈直徑大小[24-25]。

1.2.3 最小抑菌濃度的測定 按照1.2.2方法活化沙門氏菌,將活化好的沙門氏菌單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。用LB液體培養(yǎng)基將沙門氏菌濃度調(diào)到107cfu/mL,備用。先于10 mL試管中加入2 mL LB液體培養(yǎng)基,再加入蒲公英脂溶性成分使最終濃度分別為0、1、2、4、6、8、10 mg/mL。按5%(V/V)接入已調(diào)好濃度的沙門氏菌菌液,然后于37 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)24 h,600 nm下測定吸光度。在OD600紫外測定菌體濃度時,與空白對照組作比較吸收值下降50%時的樣品濃度確定為最小抑菌濃度(MIC)[26]。

1.2.4 沙門氏菌細胞膜滲透性的測定 沙門氏菌細胞膜滲透性采用菌懸液中核酸含量進行表征,采用OD260法[27]。按照1.2.3方法培養(yǎng)沙門氏菌,將培養(yǎng)好的菌液于6000 r/min離心10 min,收集菌體,PBS(pH5.8)洗三次。用含0.01% Tween80的PBS懸浮菌體,調(diào)整為109cfu/mL。配制濃度為60 mg/mL蒲公英脂溶性提取物母液備用。分別向裝有2.5 mL菌懸液的10 mL試管中加入蒲公英脂溶性提取物,使溶液中蒲公英脂溶性成分最終濃度分別為0、0.5、1、2×MIC;然后于37 ℃、200 r/min下培養(yǎng),0、1、2、4、6 h后分別取樣200 μL,于8000 r/min條件下離心10 min,260 nm下測上清液OD值。

1.2.5 沙門氏菌的電鏡掃描分析(SEM) 按照1.2.3方法培養(yǎng)沙門氏菌,將培養(yǎng)的沙門氏菌菌液濃度調(diào)整為107cfu/mL,取2 mL菌懸液,分別加入蒲公英脂溶性成分,使其最終濃度為0、1、2×MIC,于氣浴恒溫振蕩器37 ℃、200 r/min下培養(yǎng)。5 h后,取1.5 mL菌液,8000 r/min離心6 min,PBS(pH5.8)洗滌2次,然后加入2.5%戊二醛(以25%戊二醛、去離子水和PBS以1∶4∶5的比例配置濃度為2.5%的戊二醛溶液)固定4 h,用乙醇梯度脫水(用50%、60%、70%、80%、90%乙醇重懸浸泡10 min,8000 r/min離心6 min),無水乙醇重懸浸泡10 min,8000 r/min離心2次,每次6 min,在真空冷凍干燥機上冷凍24 h成干粉后噴金粉于SEM上觀察[28]。

1.2.6 沙門氏菌的PI熒光染色分析 按照1.2.3方法培養(yǎng)沙門氏菌,用液體培養(yǎng)基將菌液OD600調(diào)至0.4。取0.5 mL菌液于放有直徑15 mm無菌蓋玻片的24孔細胞培養(yǎng)皿中,在每孔加入1.5 mL LB液體培養(yǎng)基,于37 ℃培養(yǎng)24 h,更換培養(yǎng)基后再分別加入蒲公英脂溶性成分,使溶液中蒲公英脂溶性成分最終濃度分別為0、0.25、0.5、1×MIC,以0×MIC作為對照。培養(yǎng)5 h后,取出細胞培養(yǎng)皿,用PBS洗2次,去除表面浮游細菌。然后在黑暗條件下用PI染色5 min,PBS洗玻片2次,熒光顯微鏡下觀察[29]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 22.0、Origin 8.0等軟件進行數(shù)據(jù)的分析、圖表的制作等,實驗結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲公英脂溶性成分提取物的抑菌能力

如圖1,1、2處DMSO紙片周圍無抑菌圈,表明二甲亞砜對沙門氏菌無抑菌效果。3、4處蒲公英脂溶性成分紙片周圍有明顯抑菌圈,此時蒲公英脂溶性成分濃度為10 mg/mL,對沙門氏菌的抑菌圈直徑為11.3 mm。結(jié)果表明蒲公英脂溶性成分對沙門氏菌也具有一定的抑菌活性。蒲公英脂溶性成分對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌以及白色念珠菌也具有良好的抑菌效果,證明蒲公英脂溶性成分具有良好的抑菌活性,可以進一步作為對其他菌種抑菌的研究對象[22]。

圖1 蒲公英脂溶性成分對沙門氏菌的抑菌作用Fig.1 Bacteriostatic effect of dandelion liposoluble to Salmonella注:1,2均表示未加入蒲公英脂溶性成分, 只添加DMSO的對照組;3,4均表示 添加了蒲公英脂溶性成分的實驗組。

2.2 最小抑菌濃度的測定

如表1,隨著蒲公英脂溶性提取物質(zhì)量濃度的增加,其對沙門氏菌的生長抑制能力也逐漸增大,當(dāng)蒲公英脂溶性提取物的濃度分別為8、10 mg/mL時,沙門氏菌的OD600值下降≥50%,可見,蒲公英脂溶性提取物對沙門氏菌的MIC為8 mg/mL。

表1 沙門氏菌的最小抑菌濃度Table 1 Minimum inhibitory concentration of Salmonella

2.3 蒲公英脂溶性成分對沙門氏菌細胞膜滲透性影響

沙門氏菌細胞膜可以起到一定的抗抑菌作用,即能夠防止外源物質(zhì)進入,也可阻止菌體內(nèi)部物質(zhì)流出。細菌的細胞膜一旦受到損壞,胞內(nèi)的物質(zhì),如大分子(DNA或RNA)就會釋放出來,而大分子物質(zhì)在260 nm處有吸收峰,因此可以通過測定260 nm處菌懸液的吸光值來判斷細胞膜的完整性[30]。由圖2可知,對照組沙門氏菌在整個過程中的OD260紫外吸光度值差別比較小,沒有明顯變化,基本保持平穩(wěn)狀態(tài),表明對照組無細胞內(nèi)容物溢出。實驗組隨著時間的推移,OD260值呈現(xiàn)上升趨勢,而且隨著加入蒲公英脂溶性成分濃度的逐漸增大其菌懸液OD260值也增大,這說明細胞內(nèi)的大分子物質(zhì)流出,菌體細胞膜的通透性和完整性發(fā)生改變。另外,Moosavy等[31]提出嚴重的細胞形態(tài)損傷和膜破壞會增加菌體對細胞內(nèi)溶物的通透性。本實驗說明了蒲公英脂溶性成分是破壞了沙門氏菌細胞膜增加其通透性,導(dǎo)致胞內(nèi)核酸物質(zhì)流出,OD260值出現(xiàn)明顯增加趨勢。

圖2 蒲公英脂溶性成分對沙門氏菌膜通透性的影響Fig.2 Effect of dandelion liposoluble to Salmonella membrane permeability

2.4 蒲公英脂溶性成分對沙門氏菌細胞結(jié)構(gòu)的影響

不同濃度蒲公英脂溶性成分作用5 h后(圖3)，對照組(圖3A)沙門氏菌表面光滑,細胞膜細胞呈現(xiàn)短桿狀,細胞膜無褶皺現(xiàn)象。加入濃度為1×MIC(圖3B)蒲公英脂溶性成分的沙門氏菌表面極度不光滑,多數(shù)細胞呈短桿狀,細胞表面褶皺加劇,有些細胞表面有撕裂和凹陷現(xiàn)象(圖3B-a/b)。當(dāng)加入濃度為2×MIC(圖3C)的蒲公英脂溶性成分后,大量沙門氏菌細胞破裂,并有膜殘片出現(xiàn),細胞破損嚴重(圖3C-a/b/c)。

圖3 不同濃度蒲公英脂溶性成分 對沙門氏菌的影響(10000×)Fig.3 Effects of liposoluble constituents from different concentrations of dandelion on Salmonella(10000×)

2.5 PI熒光染色結(jié)果分析

注:A為0×MIC對照組;B、C實驗組脂溶性成分濃度依次分別是1×MIC、2×MIC。a表示菌體細胞膜粗糙、不平整;b表示菌體細胞變形、形態(tài)不規(guī)則;c表示菌體細胞破損、膜褶皺凹凸不平、有膜殘片。

由圖4A可見,對照組在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)黑色無紅色激發(fā)熒光,表明未加任何蒲公英脂溶性成分時,沙門氏菌沒有出現(xiàn)凋亡。當(dāng)加入0.25×MIC脂溶性成分時,出現(xiàn)少量紅色激發(fā)熒光,PI進入細胞內(nèi),細胞的完整性破壞,沙門氏菌出現(xiàn)死亡現(xiàn)象(圖4B)。當(dāng)蒲公英脂溶性成分濃度為0.5×MIC時,激發(fā)紅色熒光密度比0.25×MIC有所增加(如圖4C),細胞凋亡加劇;當(dāng)蒲公英脂溶性成分濃度為1.0×MIC時(圖4D),紅色熒光數(shù)量明顯增加,表明凋亡數(shù)量迅速增加,蒲公英脂溶性成分對沙門氏菌的抑制能力增強。結(jié)果表明,隨著蒲公英脂溶性成分濃度的增加,沙門氏菌細胞膜受到破壞的數(shù)量增加,使得紅色熒光密度隨之增加。蒲公英脂溶性成分對沙門氏菌的菌體細胞膜具有一定的破壞作用,PI熒光染色結(jié)果與2.3和2.4實驗結(jié)果是一致的。

圖4 不同濃度蒲公英脂溶性成分對沙門氏菌的影響(40×)Fig.4 Effects of liposoluble constituents from different concentrations of dandelion on Salmonella(40×)注:圖A為0×MIC對照組;圖B、C、D實驗組脂溶性成分濃度依次為0.25×MIC、0.5×MIC、1×MIC。圖B、C、D是蒲公英脂溶性成分作用5 h分別用PI處理在倒置熒光顯微鏡下的曝光照片形態(tài)。

3 結(jié)論

蒲公英脂溶性成分對沙門氏菌具有一定的抑菌能力,當(dāng)濃度為10 mg/mL時對沙門氏菌的抑菌直徑為11.3 mm,其最小抑菌濃度為8 mg/mL。蒲公英脂溶性成分對沙門氏菌的抑菌作用主要是通過破壞了細菌膜的通透性,導(dǎo)致細胞內(nèi)溶物流出。在不同濃度蒲公英脂溶性成分的作用下沙門氏菌細胞形態(tài)發(fā)生變化,菌體細胞膜有明顯的褶皺且有破損,濃度增大后,破損現(xiàn)象加劇。PI染色進一步證明蒲公英脂溶性成分是通過改變沙門氏細胞膜的通透性而導(dǎo)致細菌死亡的。蒲公英脂溶性成分對沙門氏菌的抑菌效果顯著,但其作為一種防治沙門氏菌藥物開發(fā)的相關(guān)安全性評價還需更多的研究和補充分析,以確定蒲公英脂溶性成分對人和動物安全性,為蒲公英資源利用和藥物開發(fā)方面提供可靠理論依據(jù)。