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(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410128; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410128)

植物內(nèi)生菌是存在于健康植物各種組織器官或植物間隙內(nèi)的真菌、細(xì)菌和放線(xiàn)菌。研究表明內(nèi)生菌與宿主之間建立了緊密的生態(tài)關(guān)系,由于它產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)對(duì)植物和生態(tài)環(huán)境無(wú)害、不易產(chǎn)生抗藥性、低劑量抑制病原物等優(yōu)點(diǎn),因此越來(lái)越受到人們的關(guān)注[1]。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)利用一些藥用、海洋植物等進(jìn)行內(nèi)生菌的分離、鑒定研究,它們次級(jí)代謝物在抗癌抗蟲(chóng)、保鮮防腐等方面都有應(yīng)用研究,然而對(duì)于果蔬內(nèi)生菌的分離和鑒定的研究及其應(yīng)用研究仍然具有很大的空間[2-3]。

圣女果屬于呼吸高峰型果實(shí),水分含量達(dá)70%以上,含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),其商品食用及藥用價(jià)值極大。研究發(fā)現(xiàn),圣女果采后微生物病原菌主要為鏈格孢、灰葡萄孢、根霉屬菌等,但事實(shí)上的還有炭疽病菌、疫霉屬和殼針孢屬等。圣女果保鮮技術(shù)使得長(zhǎng)期使用化學(xué)保鮮劑對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了破壞,致病菌產(chǎn)生抗藥性。低溫貯藏成本較高且易使圣女果發(fā)生冷害[4]。利用植物內(nèi)生菌防治作物病害是一個(gè)潛力巨大的新型領(lǐng)域,微生物拮抗技術(shù)融入傳統(tǒng)的保鮮技術(shù)中,能降低我國(guó)果蔬的采后損失率,以獲得高品質(zhì)、價(jià)格適中、安全性強(qiáng)的果蔬[5]。

本研究從獼猴桃分離的一株對(duì)八株果蔬采后致病菌有明顯拮抗作用的內(nèi)生菌為材料,擬通過(guò)對(duì)其生理生化鑒定、抑菌特性、抑菌譜測(cè)定及研究其發(fā)酵濾液對(duì)回接致病菌圣女果的保鮮效果。旨在明確此菌株在果蔬保鮮中的實(shí)用價(jià)值,為后續(xù)內(nèi)生菌次級(jí)代謝物在果蔬保鮮應(yīng)用提供參考和依據(jù)[6-7]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

獼猴桃(翠玉)的根、莖、葉和果實(shí) 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果園；櫻桃圣女果(萬(wàn)紫紅) 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果園；辣椒炭疽病菌(C.gloeosporioides)、辣椒白絹病菌(Sclerotiumrolfsii)、葡萄座腔病菌(Botryosphaeriadothidea)、白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、辣椒疫病菌(Phytophthoracapsici) 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)14教314實(shí)驗(yàn)室；鏈格孢(Alternarianees) 廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研發(fā)中心；灰葡萄孢(Botrytiscinerea) 中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心； LB固體培養(yǎng)基、高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基+50 mg·L-1重鉻酸鉀、PDA培養(yǎng)基、馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(pH自然)、內(nèi)生菌發(fā)酵液、LB液體培養(yǎng)基(pH7.0～7.2)、淀粉培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基、油脂培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；復(fù)合果蔬保鮮劑(脫氫乙酸鈉、乳酸鏈球菌素、丙酸鈣、防腐酶制劑等) 博涵誠(chéng)信食化；革蘭氏染色液 長(zhǎng)沙裕豐化器械有限公司；Ex Taq酶、dNTP TaKaRa；引物 Invitrogen；無(wú)水乙醇、次氯酸鈉、N,N-二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

LRH-250型號(hào)生化培養(yǎng)箱 上海飛躍實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;HR/T16M冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司;RDN-260D-3人工氣候箱 寧波樂(lè)電儀器制造有限公司;SW-CJ-1FD型號(hào)超凈工作臺(tái) 蘇潔凈化設(shè)備制造責(zé)任有限公司;DYY-6C型號(hào)電泳儀 北京六一儀器制造廠;Gel Logic212型號(hào)凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)柯達(dá)公司;BCD-197K冰箱 河南新飛電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生菌的分離 選健康、表面無(wú)破損的獼猴桃根、莖、葉和果實(shí)。取根、莖、葉各5 g和整個(gè)果實(shí),先用清水洗凈,再用75%乙醇清洗表面后,用5% NaClO溶液浸泡5 min,無(wú)菌水沖洗3次,無(wú)菌濾紙吸干水分。用無(wú)菌小刀取根、莖、葉和果實(shí)各1 g,加9 mL無(wú)菌水于無(wú)菌研缽中碾碎成勻漿,10倍梯度稀釋得到10-2、10-3的稀釋液。移取勻漿100 μL于PDA、高氏一號(hào)、LB培養(yǎng)基中,均勻地涂布于培養(yǎng)基表面,28 ℃黑暗培養(yǎng)48～72 h。最后一次清洗的無(wú)菌水取0.1 mL涂平板,作為對(duì)照組,當(dāng)無(wú)菌長(zhǎng)出,表明樣品表面無(wú)菌,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[8-9]。

選擇菌落總數(shù)在10～100 CFU/g,參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)菌落總數(shù)計(jì)數(shù)方法,根據(jù)菌落顏色、形態(tài)、光澤、邊緣整齊度、菌落濕潤(rùn)情況描述菌落特征并統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量和種類(lèi),純化后試管斜面上4 ℃保存。

1.2.2 拮抗菌篩選 以18株獼猴桃內(nèi)生菌為拮抗菌,辣椒白絹病菌、油菜菌核病菌、葡萄座腔菌3種采后致病菌為指示菌,平板對(duì)峙法[10]篩選出對(duì)指示菌有拮抗效果的內(nèi)生菌。用直徑5 mm的打孔器打孔菌餅,生長(zhǎng)致病菌的一面置于馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基表面中心位置,28 ℃培養(yǎng)。待菌餅直徑長(zhǎng)到20 mm,距離菌絲邊緣20 mm處劃線(xiàn)接種內(nèi)生菌,待菌絲剛長(zhǎng)滿(mǎn)平板,測(cè)量?jī)?nèi)生菌對(duì)致病菌的拮抗直徑。

1.2.3 菌株菌落形態(tài)觀察 參考文獻(xiàn)[7]方法,于LB固體培養(yǎng)基劃線(xiàn),28 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,觀察菌落特征。挑選單個(gè)菌落,經(jīng)革蘭氏染色后,于100×顯微鏡下觀察單個(gè)菌體形態(tài)特征。

1.2.4 菌株生理生化的分析鑒定 參照常見(jiàn)菌種鑒定手冊(cè)[11-12]對(duì)篩選出的拮抗菌進(jìn)行生理生化鑒定。

1.2.5 16S rRNA序列分析 DNA的提取:分離菌株內(nèi)生菌連續(xù)兩代活化后,接種到液體培養(yǎng)基中,以30 ℃,180 r/min的條件搖床培養(yǎng)48 h,采用CTAB法提取菌株總DNA。

PCR擴(kuò)增:用于16S rRNA擴(kuò)增的引物為細(xì)菌通用引物,正向引物為:5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′;反向引物為:5′-ACGGCTACCTTGTT ACGACT-3[13]。PCR 反應(yīng)體系(20 μL):正向引物0.8 μL;反向引物0.8 μL;模板0.5 μL;水14.1 μL。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,55 ℃退30 s,72 ℃延伸40 s,循環(huán)35次,72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳25 min,將得到的純PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送到長(zhǎng)沙基源生物公司測(cè)序。所得序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì),將得到的序列用MEGA[14]軟件進(jìn)行分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.6 發(fā)酵濾液的制備 內(nèi)生菌MR-1在PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)兩代后,挑選單個(gè)菌落的1環(huán)于10 mL的無(wú)菌水中,用旋渦旋轉(zhuǎn)器振蕩均勻,取2 mL菌懸液于LB液體培養(yǎng)基中,180 r/min、28 ℃搖床振蕩培養(yǎng)48 h。于10000 r/min、4 ℃離心15 min,得離心液。再用0.22 μm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾,濾液待用。

1.2.7 抑菌活性的測(cè)定 量取25 mL的PDA培養(yǎng)基于50 mL錐形瓶中,經(jīng)過(guò)121 ℃高壓滅菌后,倒平板,于平板中心位置倒置直徑為5 mm的菌餅。距中心25 mm的位置用直徑為12 mm的打孔器打孔,并剔除其中的培養(yǎng)基,取200 μL的發(fā)酵濾液于孔中,無(wú)菌水作為對(duì)照組。待液體完全滲透到培養(yǎng)基中,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。致病菌菌絲剛好長(zhǎng)到空白組孔徑邊緣附近,測(cè)量?jī)蓚€(gè)圓心之間菌絲的生長(zhǎng)直徑,分別記作Rck、R實(shí)驗(yàn)[15-16]。

式中:R實(shí)驗(yàn)為實(shí)驗(yàn)組菌塊直徑,RCK為對(duì)照組菌塊直徑。

1.2.8 病原菌致病性研究 PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)兩代的8株果蔬致病菌,分別是辣椒炭疽病菌、辣椒白絹病菌、葡萄座腔病菌、白菜黑斑病菌、油菜菌核病菌、辣椒疫病菌(Phytophthoracapsici)、鏈格孢、灰葡萄孢。用無(wú)菌打孔器取直徑5 mm的菌餅,部分培養(yǎng)基可較好地粘著在果實(shí)表面。用無(wú)菌棉吸附75%的乙醇擦拭果實(shí)表面,再用無(wú)菌水洗凈晾干備用。通過(guò)接種的病斑感染圣女果的程度,可判斷被接種致病菌致病能力的大小,病原菌接種果實(shí)分為有傷和無(wú)傷兩種接種方式。有傷接種是在果實(shí)表面用一次性針頭刺破5個(gè)孔,孔眼集中在直徑5 mm圓中,用打孔器打取在直徑約5 mm菌餅,剛好覆蓋打孔處,于25 ℃、85%濕度條件下培養(yǎng)3～7 d。陽(yáng)性對(duì)照為無(wú)傷接種,即接種菌餅于無(wú)傷果實(shí)表面,陰性對(duì)照組接種無(wú)菌培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。接種后需用75%的乙醇擦拭的保鮮袋隔離以達(dá)到保濕、防污染的作用[17]。

1.2.9 拮抗菌生物防治對(duì)櫻桃圣女果有傷感染致病菌的影響研究 挑選硬度大、飽滿(mǎn)圓潤(rùn)、外觀整齊、無(wú)損傷的健康圣女果果實(shí),用無(wú)菌棉吸附75%的乙醇擦拭果實(shí)表面,再用無(wú)菌水洗凈晾干,果實(shí)表面用一次性針頭刺破5個(gè)孔,孔眼集中在直徑5 mm圓中,立即于傷口處噴灑MR-1發(fā)酵濾液,靜置2 h后,分別接種鏈格孢、灰葡萄孢菌、辣椒炭疽病菌致病菌餅,以復(fù)合果蔬保鮮劑做陽(yáng)性對(duì)照,無(wú)菌水作為空白對(duì)照,將處理后的櫻桃圣女果于25 ℃、85%濕度的人工氣調(diào)箱貯藏8 d,每隔2 d記錄一次腐爛直徑。每組隨機(jī)挑選10個(gè)果實(shí),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃根、莖、葉及果實(shí)中內(nèi)生菌的分布

從獼猴桃根、莖、葉及果實(shí)中一共分離出了18株內(nèi)生菌,見(jiàn)表1。包括2株內(nèi)生真菌,3株內(nèi)生放線(xiàn)菌,13株內(nèi)生細(xì)菌。分別從根中分離了10株內(nèi)生菌,從莖中分離出3株內(nèi)生菌,從葉片中分離出3株內(nèi)生菌,從果實(shí)中分離出2株內(nèi)生菌。

表1 獼猴桃根、莖、葉及果實(shí)中內(nèi)生菌的分布和數(shù)量Table 1 Distribution and number of endophytes in kiwifruit roots,stems,leaves,and fruits

2.2 具有廣譜抑菌效果的內(nèi)生菌的篩選

以辣椒白絹菌、葡萄座腔菌、油菜菌核菌病菌為指示菌,以18種內(nèi)生菌為拮抗菌,通過(guò)平板對(duì)峙法,發(fā)現(xiàn)MR-1、根2、葉1、根11均表現(xiàn)比較明顯的廣譜性抑制效果(表2),其中MR-1對(duì)3種采后致病菌均具有較強(qiáng)的拮抗抑菌效果。

表2 內(nèi)生菌對(duì)采后致病菌拮抗作用的測(cè)定Table 2 Inhibition effect of entophyteon postharvest pathogens

2.3 菌株MR-1的菌落形態(tài)特征

由圖1、圖2可知，內(nèi)生菌MR-1單個(gè)菌落是乳白色不透明,褶皺,菌體易挑取,菌落直徑約0.2～0.5 mm。在100×顯微鏡下,菌體呈桿狀,革蘭氏染色呈陽(yáng)性。

圖2 內(nèi)生細(xì)菌MR-1革蘭氏染色(100×)Fig.2 Gram staining of endophytic bacteria strain MR-1(100×)

圖1 內(nèi)生細(xì)菌MR-1菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of endophytic bacteria strain MR-1

2.4 菌株MR-1的生理生化反應(yīng)特性

細(xì)菌MR-1的生理生化反應(yīng)結(jié)果表明(表3),MR-1好氧,低溫不能夠生長(zhǎng),能分解淀粉和油脂,硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性,明膠液化陽(yáng)性,葡萄糖產(chǎn)氣陽(yáng)性,過(guò)氧化氫反應(yīng)陽(yáng)性,接觸酶反應(yīng)陽(yáng)性,氧化酶反應(yīng)陰性,V-P反應(yīng)陽(yáng)性,甲基紅反應(yīng)陰性,硫化氫反應(yīng)陰性,葡萄糖產(chǎn)酸陰性,初步確定為一種解淀粉芽孢桿菌。

表3 內(nèi)生細(xì)菌MR-1的生理生化特性Table 3 Biochemical and physiological of endophytic bacteria strain strain MR-1

2.5 菌株MR-1的16S rRNA序列分析

將菌株MR-1的DNA提取后進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到單一條帶(圖3),經(jīng)過(guò)回收純化后測(cè)序,序列長(zhǎng)度為1423bp。將測(cè)得的菌株序列上傳至NCBI基因序列分析網(wǎng)站進(jìn)行同源性分析,并選取與其相近序列的菌株,發(fā)現(xiàn)提交序列與100種菌株的16S rRNA的序列極為相似,同源性達(dá)到99%,其中登陸號(hào)為KF933607.1的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株BDH11的16S rRNA的序列與拮抗菌MR-1(全長(zhǎng)1423bp)大小基本相同,同源性達(dá)到100%,通過(guò)MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4),兩株菌株在發(fā)育樹(shù)處于同一分支。綜合生理生化鑒定,可以確定MR-1為一株解淀粉芽孢桿菌。

圖4 內(nèi)生細(xì)菌MR-1及近源菌16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of entophytic bacterium strain MR-1 and its relatives based on 16S rRNA

圖3 內(nèi)生細(xì)菌MR-1 16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR amplified products from 16S rRNA of endophytic bacteria strain MR-1注:M:DL2000 DNA Marker。

2.6 打孔法測(cè)MR-1發(fā)酵濾液對(duì)采后致病真菌的抑制率

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(表4),內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌MR-1對(duì)8種常見(jiàn)的植物病原菌均有較強(qiáng)的拮抗作用,其中對(duì)灰葡萄孢的抑制作用最強(qiáng),抑制率達(dá)到了48.00%。對(duì)葡萄座腔菌的抑制效果最差,僅為16.00%?；移咸焰?、鏈格孢和炭疽病菌是櫻桃圣女果主要的病害菌,MR-1發(fā)酵液對(duì)這3種致病菌表現(xiàn)較強(qiáng)的抑制作用。

表4 MR-1發(fā)酵濾液對(duì)8種植物采后病原菌的抑制率Table 4 Inhibition effect of the crude fermentation on eight phytopathogenic fungi

2.7 致病菌對(duì)櫻桃圣女果的致病性研究

如圖5～圖12，實(shí)驗(yàn)第4 d,受到葡萄座腔病菌感染的圣女果果實(shí)腐爛體積超過(guò)1/2,受到辣椒炭疽感染后的果實(shí)呈濕潤(rùn)狀,病斑為褐色,果實(shí)凹陷,受到灰葡萄孢感染的果實(shí)表現(xiàn)果皮成為灰白色水漬狀,變軟腐爛,受到鏈格孢感染的果實(shí)凹陷軟爛。實(shí)驗(yàn)表明,圣女果容易受到辣椒炭疽病菌、葡萄座腔病菌、灰葡萄孢的侵染,比較容易受到鏈孢格的感染,能受到辣椒白絹菌和白菜黑斑菌的感染,但是辣椒疫病和油菜菌核比較難感染圣女果傷口。

圖5 感染辣椒炭疽病的圣女果Fig.5 Infected cherry tomatoes with C. gloeosporioides

圖6 感染鏈格孢的圣女果Fig.6 Infected cherry tomatoes with Alternaria nees

圖7 感染灰葡萄孢的圣女果Fig.7 Infected cherry tomatoes with Botrytis cinerea

圖8 感染葡萄座腔菌的圣女果Fig.8 Infected cherry tomatoes with Botryosphaeria dothidea

圖9 感染白菜菌核菌的圣女果Fig.9 Infected cherry tomatoes with Alternaria brassicae

圖10 感染辣椒白絹菌的圣女果Fig.10 Infected cherry tomatoes with Sclerotium rolfsii

圖11 感染辣椒疫病菌的圣女果Fig.11 Infected cherry tomatoes with Phytophthora capsici

圖12 感染油菜菌核菌的圣女果Fig.12 Infected cherry tomatoes with Sclerotinia sclerotiorum

2.8 拮抗菌生物防治對(duì)櫻桃圣女果有傷感染致病真菌的影響

2.8.1 拮抗菌生物防治對(duì)櫻桃圣女果有傷感染鏈格孢的影響 隨著貯藏期的延長(zhǎng),鏈格孢侵染圣女果的直徑不斷增大(圖13)。不同貯藏期各處理之間呈極顯著差異(p<0.01)。在整個(gè)貯藏期間,經(jīng)發(fā)酵濾液處理的圣女果保鮮效果最好,其次為復(fù)合果蔬保鮮劑,其腐爛直徑均低于無(wú)菌水處理。貯藏第8 d,圣女果經(jīng)發(fā)酵液處理和保鮮液處理的腐爛直徑分別為7.8和8.5 mm,與空白對(duì)照組相比,降低了50.6%和46.2%,呈顯著性差異(p<0.05)。

圖13 不同試劑處理對(duì)回接鏈孢格的圣女果的影響 Fig.13 Effect of different reagent treatments on cherry tomatoes with Alternaria nees

2.8.2 拮抗菌生物防治對(duì)櫻桃圣女果有傷感染灰葡萄孢的影響研究 隨著貯藏期的延長(zhǎng),灰葡萄孢侵染圣女果的直徑不斷增大(圖14)。不同貯藏期各處理之間呈極顯著差異(p<0.01),在整個(gè)貯藏期間,經(jīng)發(fā)酵濾液處理的圣女果保鮮效果最好,其次為復(fù)合果蔬保鮮劑,其腐爛直徑均低于無(wú)菌水處理。貯藏第8 d,圣女果經(jīng)發(fā)酵液處理和復(fù)合果蔬保鮮劑處理的腐爛直徑為9.2和8.0 mm,與空白對(duì)照組相比,分別降低50.6%和43.2%,呈顯著性差異(p<0.05)。

圖14 不同試劑處理對(duì)回接灰葡萄孢的圣女果的影響Fig.14 Effect of different reagent treatments on cherry tomatoes with with Botrytis cinerea

2.8.3 拮抗菌生物防治對(duì)櫻桃圣女果有傷感染辣椒炭疽病菌的影響研究 隨著貯藏期的延長(zhǎng),辣椒炭疽病菌侵染圣女果的直徑不斷增大(圖15)。不同貯藏期各處理之間呈極顯著差異(p<0.01),在整個(gè)貯藏期間,經(jīng)發(fā)酵濾液處理的圣女果保鮮效果最好,其次為復(fù)合果蔬保鮮劑,其腐爛直徑均低于無(wú)菌水處理。貯藏第8 d,圣女果經(jīng)發(fā)酵液處理和復(fù)合果蔬保鮮劑處理的腐爛直徑為10.8和9.8 mm,與空白對(duì)照組相比,分別降低了44.9%和39.3%,呈顯著性差異(p<0.05)。

圖15 不同試劑處理對(duì)回接辣椒 炭疽病菌的圣女果的影響Fig.15 Effect of different reagent treatments on cherry tomatoes with C.gloeosporioides

3 討論

獼猴桃內(nèi)生菌種類(lèi)和數(shù)量較多,郭睿文[19]從獼猴桃的芽孢、葉片和莖部分離出來(lái)了大量的內(nèi)生菌,陳超[7]從果肉中分離了一株對(duì)獼猴桃座腔菌的抑制率達(dá)到64.72%的內(nèi)生細(xì)菌。本文首次從獼猴桃根、莖、葉和果實(shí)中分離內(nèi)生菌,測(cè)定強(qiáng)活性菌株MR-1對(duì)8種采后致病菌的抑制率,發(fā)現(xiàn)其對(duì)圣女果常見(jiàn)致病菌有較強(qiáng)的抑制生長(zhǎng)的作用。在圣女果保鮮實(shí)驗(yàn)中,針對(duì)圣女果的主要采后致病菌灰葡萄孢、鏈格孢以及辣椒炭疽病菌,內(nèi)生菌MR-1的發(fā)酵濾液均具有較強(qiáng)的抑菌效果,然而其保鮮機(jī)制和最適宜處理濃度待進(jìn)一步研究。

復(fù)合果蔬保鮮劑包含脫氫乙酸鈉、乳酸鏈球菌素、丙酸鈣、防腐酶制劑等,主要是化學(xué)試劑,長(zhǎng)期使用會(huì)使病原菌產(chǎn)生抗藥性,環(huán)境中也會(huì)導(dǎo)致藥物殘留,破壞生態(tài)。解淀粉芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的一種,分泌的抑菌物質(zhì)有很多種,常見(jiàn)的種類(lèi)分為脂肽類(lèi)物質(zhì)、聚酮類(lèi)物質(zhì)還有具有蛋白活性的抑菌物質(zhì)。解淀粉芽孢桿菌的抑菌作用研究已經(jīng)廣泛開(kāi)展,并且利用解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行生物防治的前景十分廣闊,但是生物體是復(fù)雜多變的,仍然有很多東西是未知的[20-23]。

實(shí)驗(yàn)表明內(nèi)生細(xì)菌MR-1具有廣譜抑菌作用,對(duì)多種果蔬致病菌具有很強(qiáng)的抑制效果,其發(fā)酵濾液為它的次級(jí)代謝產(chǎn)物,其所含活性物質(zhì)的種類(lèi)和抑菌機(jī)理需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究從獼猴桃根、莖、葉和果實(shí)中分離出來(lái)了18株內(nèi)生菌,其中內(nèi)生菌MR-1對(duì)鏈格孢、灰葡萄孢、辣椒炭疽病菌、辣椒疫病病菌、辣椒白絹病菌、油菜菌核菌、白菜黑斑病菌、葡萄座腔菌8種致病菌均有較強(qiáng)的抑制效果。通過(guò)菌體、菌落形態(tài)觀察、生理生化測(cè)定及16S rRNA序列分析,鑒定其為一株解淀粉芽孢桿菌。此外,鏈格孢、灰葡萄孢、辣椒炭疽病菌能夠通過(guò)有傷接種的形式感染圣女果,導(dǎo)致果實(shí)腐爛變質(zhì)。以鏈格孢、灰葡萄孢、辣椒炭疽病菌有傷感染圣女果,相比無(wú)菌水對(duì)照組,腐爛直徑分別下降了50.6%、50.6%、44.9%,整個(gè)儲(chǔ)藏期間,內(nèi)生菌MR-1發(fā)酵液能較好的控制圣女果的腐爛變質(zhì)。