李 晨，程聯(lián)智，洪國勇，潘發(fā)福，周榮平，賈驚宇，顧玉榮

1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科(南昌330000)；2.江西省婺源縣人民醫(yī)院骨科(婺源 333200 )

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是骨惡性腫瘤中最常見且高度惡性的腫瘤之一，嚴(yán)重危害兒童和青少年的身體健康。在該年齡段癌癥致死排名中，骨肉瘤高居第三位。研究表明骨肉瘤最常見轉(zhuǎn)移器官是肺，患者5年生存率很低。目前對于骨肉瘤治療采用綜合療法，常規(guī)化療治療骨肉瘤副作用大，效果仍不佳。尋找新的方向突破尤其是中醫(yī)領(lǐng)域是研究熱點(diǎn)。

牛蒡子苷元(Arctigenin，ARG)是中醫(yī)藥牛蒡子中的主要有效活性成分。目前多項研究表明牛蒡子苷元具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗病毒等作用。牛蒡子苷元在肝癌、直腸癌、結(jié)腸癌等腫瘤中已經(jīng)被證實(shí)具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用[1-4]。但是目前在國內(nèi)外對于牛蒡子苷元治療骨肉瘤研究少，本研究為研究牛蒡子苷元對骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲的影響，為其治療骨肉瘤提供臨床理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

1 材 料 人骨肉瘤細(xì)胞系MG63(武漢大學(xué)中國典型生物保藏中心)；牛蒡子苷元(美國Sigma公司)；RPMI-1640培養(yǎng)液(美國Sigma公司)；Matrigel(美國Sigma公司)；MTT(美國Sigma公司)；二甲基亞砜(美國Sigma公司)；PBS、Annexin V和PI(鼎國生物試劑有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(英國Galaxy公司)；Wallace 1420酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗設(shè)備有限公司)；SW-CJ-IF超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備公司)；CSX41倒置顯微鏡(日本尼康公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

2 骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將人骨肉瘤細(xì)胞系MG63培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的MG63細(xì)胞用胰蛋白酶消化制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/ml。將牛蒡子苷元設(shè)置成不同濃度分組(A-E組)用于實(shí)驗(分別為10、20、40、80和100 μmol/L)。

3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(MTT法) 取100 μl骨肉瘤細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置于CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃，培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞完全貼壁后加入不同濃度的牛蒡子苷元干預(yù)，設(shè)置陰性對照組和空白組，陰性對照組中不加藥物牛蒡子苷元只加入等量的生長液，而空白組中不加細(xì)胞加入等量的牛蒡子苷元藥物。培養(yǎng)時間分別為24、48、72 h。待藥物作用結(jié)束后，加入 MTT溶液20 μl(終濃度為5 mg/ml)，置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中反應(yīng)后棄上清液，加入150 μl DMSO，避光條件下緩慢震蕩10 min，觀察結(jié)晶物完全溶解后。用酶聯(lián)免疫檢測儀測定其吸光度(OD)值，實(shí)驗重復(fù)3次。

4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗( Transwell法) MG63細(xì)胞經(jīng)過不同濃度分組(A-E組)的牛蒡子苷元作用干預(yù)48 h后，胰蛋白酶消化細(xì)胞，加入培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×103個/ml細(xì)胞懸液，加入到提前5 h用Matrigel包被過的Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室中，每小室100 μl，設(shè)3個平行孔，在Transwell小室下部加入培養(yǎng)基中，于溫箱內(nèi)孵育48 h后將小室取出，濾膜用甲醇固定5 min。棄去固定液，加適量蘇木精染色10～30min。用棉簽擦掉未穿過膜的細(xì)胞(濾膜上層細(xì)胞)。隨機(jī)選取5個視野計數(shù)，取平均數(shù)，穿膜細(xì)胞數(shù)越多表示侵襲能力越強(qiáng)。于顯微鏡下計數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。

5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 取培養(yǎng)處理好的MG-63細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個/孔，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞生長液2 ml，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，觀察細(xì)胞完全貼壁，倒掉細(xì)胞生長液，分別在MG-63細(xì)胞中加不同濃度分組(A-E組)的牛蒡子苷元的含藥培養(yǎng)基，每孔中加入細(xì)胞生長液體積為2 ml。同時設(shè)對照組，對照組MG-63細(xì)胞中不加牛蒡子苷元，加入等量的DMSO溶液，繼續(xù)孵育48 h，棄去含藥培養(yǎng)基，加入PBS洗滌后，胰蛋白酶消化細(xì)胞，2 000 rpm、5 min離心，加入PBS重懸，調(diào)整每孔中細(xì)胞數(shù)量大約為1×106個，繼續(xù)2000 rpm、5 min離心，收集細(xì)胞，在每組細(xì)胞中加入500 μl的結(jié)合緩沖液，混合均勻，重懸細(xì)胞。加入5 μl Annexin V，再加入5 μl PI混合，室溫下孵育反應(yīng)10 min后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/(凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù))。實(shí)驗重復(fù)3次。

6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件統(tǒng)計分析所得數(shù)據(jù)，計量資料行單因素方差分析，P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 牛蒡子苷元對骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖影響 檢測不同濃度牛蒡子苷元(10、20、40、80、100 μmol/L)對人骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖影響作用(圖1)。隨著牛蒡子苷元作用時間延長(0、24、48、72 h)，MG-63細(xì)胞逐步增殖，但牛蒡子苷元藥物的濃度越高，骨肉瘤腫瘤細(xì)胞增殖抑制越明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 牛蒡子苷元對骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖影響

2 牛蒡子苷元對骨肉瘤細(xì)胞MG-63侵襲影響 MG63細(xì)胞經(jīng)過不同濃度分組(10、20、40、80和100 μmol/L)的牛蒡子苷元作用干預(yù)48 h后，利用 Transwell小室測定其侵襲性。結(jié)果顯示經(jīng)過0、10、20、40、80和100 μmol/L濃度的牛蒡子苷元作用后，骨肉瘤細(xì)胞侵襲力分別為：867±19.47、634.67±11.24、571.33±14.19、441.33±18.77、245.67±9.07、136.33±11.50。數(shù)據(jù)分析說明濃度為10、20、40、80和100 μmol/L的牛蒡子苷元與對照組(0 μmol/L)具有顯著性差異(P<0.05)，提示牛蒡子苷元可以減弱骨肉瘤細(xì)胞的侵襲性，濃度越高，效果越明顯(圖2)。

圖2 牛蒡子苷元對骨肉瘤細(xì)胞MG-63侵襲影響

3 牛蒡子苷元對骨肉瘤細(xì)胞MG-63凋亡影響 骨肉瘤MG-63細(xì)胞中加不同濃度(0、10、20、40、80和100 μmol/L)的牛蒡子苷元作用48 h后，經(jīng)過染色，凋亡率隨藥物濃度增加而增加，分別為0.13±0.02、0.29±0.01、0.43±0.03、0.64±0.01、0.85±0.01、0.93±0.01。六組相互比較，均提示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明牛蒡子苷元可以促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡，濃度越高，凋亡越多(圖3)。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測骨肉瘤細(xì)胞凋亡

討 論

骨肉瘤(Osteosarcoma)是惡性程度高的骨原發(fā)性腫瘤，其特點(diǎn)是瘤細(xì)胞直接形成骨樣組織。骨肉瘤惡性程度高，預(yù)后極差，可于數(shù)月內(nèi)出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移，5年存活率低。雖然目前最新采取的治療方式多為新輔助化療+手術(shù)治療為主，主要以手術(shù)聯(lián)合新輔助化療為主,基因治療、分子靶向治療、免疫治療等的研究取得了一定進(jìn)展,仍有待于進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究及臨床實(shí)踐論證。新輔助化療縮小瘤體、消滅微小病灶,為手術(shù)徹底切除提供保障,減少腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[5], 但患者存活率仍然不樂觀。而且化療藥物對于骨肉瘤細(xì)胞和人體正常細(xì)胞均有明顯的殺傷作用，不良反應(yīng)較大。

中國中醫(yī)藥博大精深，抗腫瘤藥物層出不窮[6-7]。牛蒡子苷元是從菊科植物牛蒡?qū)倥］蜃又刑崛〉哪局仡惢衔颷8-10]。初期被用于抗炎[1，12]，后期發(fā)現(xiàn)牛蒡子苷元可以調(diào)節(jié)免疫調(diào)節(jié)、抑制許多種腫瘤的作用[1-4]。目前發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制為阻斷腫瘤細(xì)胞周期中G0/G1期，或在G2/M期抑制細(xì)胞增殖[13-16]。

本實(shí)驗結(jié)果顯示，牛蒡子苷元干預(yù)骨肉瘤細(xì)胞系后，增殖明顯受到抑制，侵襲性降低，凋亡水平明顯增高，具有統(tǒng)計學(xué)差異。牛蒡子苷元對骨肉瘤細(xì)胞的抑制呈現(xiàn)濃度依賴性和時間依賴性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。而且通過流式細(xì)胞技術(shù)分析的結(jié)果與MTT法的細(xì)胞增值實(shí)驗一致，說明牛蒡子苷元有抗骨肉瘤作用，值得進(jìn)一步研究。

目前關(guān)于牛蒡子苷元對人骨肉瘤細(xì)胞影響的研究較少，本研究結(jié)果對牛蒡子苷元抗骨肉瘤的研究有一定的幫助，但需要進(jìn)一步研究其抗腫瘤的機(jī)理通路并在動物實(shí)驗中驗證。