老年人的腦血管疾病是血管性認(rèn)知障礙最常見的原因之一,最近的研究顯示，淡漠是老年腦小血管病(cerebral small vessel disease,CSVD)的主要神經(jīng)精神癥狀,且存在于伴有白質(zhì)病變的病人中。淡漠是一種由情感遲鈍、認(rèn)知和行為減退組成的綜合征,通常被認(rèn)為是認(rèn)知衰退的一種形式[1]。在大、小鼠中挖穴技能受損及社交能力下降,均被認(rèn)為是動物的淡漠行為[2-3]。髓鞘是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細(xì)胞軸突周圍形成的絕緣鞘,在認(rèn)知功能的發(fā)育和維持中起重要作用,炎癥和髓鞘損傷可能引起神經(jīng)精神癥狀[4]。髓鞘主要分布于白質(zhì),接受不成比例的低血流供應(yīng)和少量的側(cè)支循環(huán),因此,白質(zhì)特別容易受到缺血性損傷,這種類型的損傷是血管性認(rèn)知損害的重要特征[5]。各種人類和動物研究表明,體育鍛煉可以改善認(rèn)知功能,但其機(jī)制仍不清楚[6]。本研究主要探討有氧運(yùn)動是否可以改善小鼠缺血性損傷導(dǎo)致的淡漠行為,為有氧運(yùn)動改善臨床CSVD病人淡漠行為提供根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立及分組 雄性成年300～350 g的SD大鼠(北京斯貝福實(shí)驗動物科技有限公司)48只,隨機(jī)分為4組,每組12只。正常對照組不做任何處理;假手術(shù)組僅暴露雙側(cè)頸動脈,不進(jìn)行結(jié)扎,在4周后進(jìn)行4周的游泳鍛煉;腦缺血組和游泳組采用雙側(cè)頸動脈結(jié)扎法(bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO)制備大鼠CSVD模型,游泳組在BCCAO術(shù)后4周進(jìn)行4周的游泳鍛煉。實(shí)驗共8周。術(shù)前對所有大鼠進(jìn)行挖穴和社交評價,假手術(shù)組和游泳組大鼠于直徑80 cm、高90 cm的圓柱形水桶中,1次/d,每次1 h,每周5次,進(jìn)行為期4周的游泳鍛煉。術(shù)前和術(shù)后8周對4組大鼠進(jìn)行挖穴和社交評價;之后每組6只用于固藍(lán)染色和免疫熒光染色檢測離子鈣接頭蛋白分子(Iba-1)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目;6只用于Western blotting試驗。

1.2 挖穴和社交評估 挖穴的測定參照文獻(xiàn)[7]:利用長32 cm,直徑為10 cm的塑料水管,一端用纖維板密封,用2個角度為90度的螺絲將管的一端遠(yuǎn)離地板6 cm高。將塑料水管內(nèi)填充2500 g沙礫,下午16時開始測試,2 h后將洞穴內(nèi)剩余的食物稱重進(jìn)行基線測定,然后重新放回籠中,過夜后于次日早晨8時再次進(jìn)行剩余沙礫的測定。社交行為的測定參照文獻(xiàn)[8]:使用一個透明的有機(jī)玻璃籠子,大小為46 cm(長)×21.5 cm(寬)×20.5 cm(高),含有1 cm厚的木屑墊料。由21.5 cm×20.5 cm的內(nèi)壁分成2個相同大小的隔室。內(nèi)壁的中間底部有一個絲網(wǎng)孔(直徑7.6 cm),被2個交叉鐵絲線劃分成4個相等大小的塊,可讓受試大鼠進(jìn)行嗅探,但可防止與隔間正常大鼠的直接接觸。受試大鼠和正常大鼠被放置在隔室中10 min。在沒有實(shí)驗者的情況下,在昏暗的房間里進(jìn)行測試。對動物的行為進(jìn)行視頻記錄并評估。嗅探:動物將其鼻子伸入絲網(wǎng)孔并隨其晶須移動的持續(xù)時間;穿越:動物在測試室中穿過絲網(wǎng)孔的次數(shù)。

1.3 髓鞘損傷評估 實(shí)驗大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,灌流固定,取大鼠基底節(jié)區(qū)腦組織行常規(guī)冰凍切片,厚度為10μm,將切片浸于固藍(lán)染色液中4 h,70%乙醇,碳酸鋰分化之后,梯度酒精脫水、二甲苯透明,中性樹膠封片,鏡下觀察大鼠白質(zhì)束髓鞘損傷情況。

1.4 免疫熒光檢測 取冰凍切片通過高溫?zé)嵝迯?fù)法進(jìn)行抗原修復(fù),常規(guī)畫圈,滴加打孔液,10%山羊血清封閉2 h后,加入1∶100稀釋的一抗Iba-1(Abcam公司,英國)和1∶250稀釋的一抗GFAP(Abcam公司,英國)后：4 ℃過夜,PBS沖洗,滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(碧云天,中國)2 h,PBS沖洗,DAPI染劑15 min復(fù)染,10%甘油封片,熒光顯微鏡下觀察。

1.5 western blotting法檢測 取大鼠基底節(jié)區(qū)腦組織用PIPA裂解液勻漿后,12000 r/min4 ℃離心15 min后取上清,加4x蛋白上樣緩沖液后,用BCA試劑盒測定蛋白濃度,常規(guī)western blotting法檢測髓鞘堿性蛋白(MBP)、白細(xì)胞介素1(IL-1)、IL-6及腫瘤壞死因子(TNF-α)的蛋白表達(dá)水平,以GAPDH為內(nèi)參組。采用Image J軟件計算目的條帶灰度值,各組與對照組的百分比用于統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 有氧運(yùn)動對大鼠挖穴和社交能力的影響 與正常對照組和假手術(shù)組相比,腦缺血組大鼠術(shù)后4周出現(xiàn)明顯的挖穴和社交能力下降(P<0.05)。與腦缺血組大鼠相比,游泳組大鼠挖穴剩余沙礫的質(zhì)量減少,嗅探時間和穿越次數(shù)增加,二者均得到一定的改善(P<0.05)。見表1。

表1 各組間挖穴和社交行為的比較

注:與正常對照組與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與腦缺血組比較,△P<0.05

2.2 有氧運(yùn)動對大鼠髓鞘再生的影響 Fast blue染色結(jié)果顯示,與正常對照組和假手術(shù)組相比,BCCAO后4周,腦缺血組的胼胝體和尾狀核部位出現(xiàn)髓鞘損傷(包括髓鞘纖維紊亂,空泡形成或髓鞘丟失)。相對于腦缺血組,游泳組髓鞘損傷顯著減少。見圖1。

2.3 有氧運(yùn)動對小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響 在假手術(shù)組中,大多數(shù)小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài),體育鍛煉對假手術(shù)大鼠的表型變化沒有顯著影響。與正常對照組和假手術(shù)組相比,腦缺血組中富含更多的Iba-1、GFAP細(xì)胞(P<0.05)。此外,相對于腦缺血組,游泳組下調(diào)Iba-1、GFAP陽性小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量(P<0.05)。見表2,圖2,3。

圖1 有氧運(yùn)動對CSVD大鼠髓鞘再生的影響(n=6)

組別Iba-1+/mm2GFAP+/mm2MBPIL-1IL-6TNF-α正常對照組13.66±1.9623.83±1.600.56±0.020.54±0.030.58±0.010.57±0.01假手術(shù)組14.66±1.0322.83±1.600.57±0.040.56±0.020.57±0.020.56±0.05腦缺血組33.16±1.94?50.16±5.11?0.37±0.02?0.75±0.02?1.07±0.04?0.75±0.02?游泳組組23.16±2.31?△27.66±2.16?△0.51±0.03?△0.62±0.08?△0.74±0.04?△0.76±0.03?

注:與正常對照組和假手術(shù)組比較,*P<0.05;與腦缺血組比較,△P<0.05

圖2 有氧運(yùn)動對CSVD大鼠Iba-1活化的影響(n=6)

圖3 有氧運(yùn)動對CSVD大鼠GFAP活化的影響(n=6)

2.4 有氧運(yùn)動對炎癥介質(zhì)和髓鞘再生的影響 正常對照組和假手術(shù)組IL-1、IL-6和TNF-α很少表達(dá),而腦缺血組IL-1、IL-6和TNF-α表達(dá)顯著增加(P<0.05),MBP表達(dá)下降(P<0.05)。體育鍛煉增加了MBP蛋白含量(P<0.05),降低了IL-1、IL-6蛋白表達(dá)水平(P<0.05),TNF-α各組間表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。見表2，圖4。

圖4 有氧運(yùn)動對CSVD大鼠MBP及炎癥介質(zhì)的影響

3 討論

CSVD引起的慢性低灌注可導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞的丟失和髓鞘損傷[9]。本研究結(jié)果顯示，大鼠在BCCAO后8周,LFB染色和MBP蛋白印跡的結(jié)果均證實(shí)了髓鞘損傷，體育鍛煉可改善老年CSVD大鼠的挖穴與社交能力,這是通過降低小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,降低炎癥反應(yīng)介質(zhì)表達(dá),從而減少髓鞘丟失和軸突損傷。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果，體育鍛煉改善了老年CSVD病人的WM完整性[10]。此外,進(jìn)行性抵抗體能訓(xùn)練可逆轉(zhuǎn)癡呆前驅(qū)癥狀及輕度認(rèn)知功能障礙病人的WM高信號進(jìn)展并改善總體認(rèn)知功能[11]。已有研究表明,小膠質(zhì)細(xì)胞的活化可以對髓鞘產(chǎn)生破壞并降低髓鞘保護(hù)作用[12]。減少小膠質(zhì)細(xì)胞活化可以驅(qū)動少突神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞分化并阻止新生少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡,這是髓鞘再生的重要機(jī)制[13]。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)體育鍛煉可以減少Iba-1、GFAP陽性小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá),此外,體育鍛煉通過降低促炎因子(TNF-α,IL-1,IL-6)的蛋白表達(dá)來阻止小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。與我們的研究結(jié)果一致,之前的研究也發(fā)現(xiàn),跑步運(yùn)動可減輕小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖,促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞形成和髓鞘再生,這與運(yùn)動誘導(dǎo)的神經(jīng)發(fā)生有關(guān)[14]。

腦白質(zhì)脫髓鞘是人腦退行性改變中主要觀察到的細(xì)胞變化[15]。通過減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生及小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,維持髓鞘磷脂完整性來促進(jìn)學(xué)習(xí)與記憶,提高CSVD病人的生存質(zhì)量,對于社會及家庭是極其重要的。本實(shí)驗亦有不足之處,檢測大鼠的淡漠行為有一定的局限性,下一步本課題組將嘗試在臨床上評估老年CSVD病人的淡漠行為,并進(jìn)行有氧運(yùn)動的測試,進(jìn)一步證實(shí)本實(shí)驗的研究結(jié)果。