袁昕 高四書 羅凱明 項守奎 華飛

蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院內(nèi)分泌科，常州 213003

維生素D是一種類固醇激素，通過與靶細(xì)胞維生素D受體(VDR)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用，經(jīng)典作用是調(diào)節(jié)鈣、磷代謝[1]。近年來全世界人群維生素D缺乏越來越普遍，隨著研究的深入，已發(fā)現(xiàn)維生素D與腫瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病等的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，還有研究表明維生素D可調(diào)節(jié)女性生殖過程[2-5]。

研究發(fā)現(xiàn)，敲除VDR基因或維生素D活化所需的1α-羥化酶基因的小鼠，除有低鈣、低磷及佝僂病樣表現(xiàn)外，還出現(xiàn)性激素紊亂、卵泡生成受損、子宮發(fā)育不全、不育等，而補充鈣、磷后可糾正生殖異常，因此認(rèn)為，維生素D對雌鼠生育系統(tǒng)的影響是通過調(diào)節(jié)鈣、磷水平實現(xiàn)的[6]。本研究擬建立正常鈣、磷水平的維生素D缺乏大鼠模型，觀察維生素D對雌性大鼠代謝、性激素、卵巢形態(tài)及功能的直接影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 48只健康SPF級3周齡Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠，體重(59.0±7.1)g，由江蘇常州卡文斯實驗動物有限公司提供[許可證號：SCXK(蘇)2016-0010，合格證編號：201821081]。飼養(yǎng)環(huán)境：12 h白熾燈光照/12 h夜晚，溫度22℃，濕度50%～60%，大鼠自由飲食、飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠按隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為對照組(n=24)和維生素D缺乏組(n=24)，分別予標(biāo)準(zhǔn)飼料、維生素D缺乏飼料喂養(yǎng)。標(biāo)準(zhǔn)飼料(按AIN-93標(biāo)準(zhǔn)配方生產(chǎn)，維生素D1 000 IU/kg，0.5%鈣，0.3%磷)和維生素D缺乏飼料(幾乎不含維生素D，2%鈣，1.2%磷)由江蘇南通特洛菲飼料公司提供。

1.2 試劑 25-羥維生素D[25(OH)D]檢測試劑盒購自上海羅氏診斷產(chǎn)品公司。睪酮、雌二醇、孕酮、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)檢測試劑盒購自南京建成生物科技公司?？姑缋展芗に?AMH)檢測試劑盒購自Cusabio公司。大鼠胰島素ELISA試劑盒購自美國Millipore公司。

1.3 實驗方法 每周檢測攝食量及體重變化。第6、14、22周兩組分別按隨機(jī)數(shù)字法取8只大鼠，每日行陰道涂片，在顯微鏡下觀察，記錄涂片中的細(xì)胞類型，判斷動情周期的階段，共14 d。第8、16、24周，將已觀察動情周期的大鼠禁食12 h，戊巴比妥鈉麻醉后打開腹腔，腹主動脈取血，摘取雙側(cè)卵巢。血標(biāo)本離心后收集血清，于-80℃保存。卵巢組織用4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，沿卵巢長軸最大截面切片，HE染色后光鏡下觀察病理學(xué)結(jié)構(gòu)。大鼠血清室溫復(fù)溶后用全自動生化分析儀檢測空腹血糖、甘油三酯、總膽固醇、血鈣、血磷，ELISA法檢測空腹胰島素、睪酮、雌二醇、孕酮、LH、FSH、AMH，電化學(xué)發(fā)光法檢測25(OH)D水平。計算穩(wěn)態(tài)模型評估-胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清25(OH)D、血鈣、磷的比較 第8、16、24周維生素D缺乏組血清25(OH)D水平均顯著低于對照組(t=9.69、3.69、4.04，P均<0.05)。3個時間點兩組血鈣、磷水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1。

2.2 大鼠體重及血脂、血糖、胰島素、HOMA-IR的比較 維生素D缺乏組與對照組的體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義。第8周時兩組甘油三酯、空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR差異無統(tǒng)計學(xué)意義，第16、24周維生素D缺乏組血清甘油三酯、空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR均較對照組升高(t=-2.45、-2.50、-3.08、2.93、-4.02、-3.94、3.87、3.86，P均<0.05)。3個時間點兩組血清總膽固醇水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。

2.3 大鼠性激素水平的比較 維生素D缺乏組血清睪酮、雌二醇、孕酮、LH與對照組相比均無明顯差異。第8、16周兩組大鼠FSH水平無顯著差異，第24周維生素D缺乏組FSH水平較對照組顯著降低(t= 2.35，P<0.05)。3個時間點維生素D缺乏組LH/FSH比值均高于對照組(t=-2.29、-2.45、-3.12，P均<0.05)，見圖3。

表1 大鼠動情周期各階段持續(xù)時間的比較

2.4 大鼠血清AMH水平的比較 第8、16、24周維生素D缺乏組AMH水平均較對照組升高(t=-2.54、-2.99、-2.39，P均<0.05)，見圖4。

2.5 動情周期 第8、16、24周兩組的動情前期、動情期、動情后期、動情間期持續(xù)的時間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.6 卵巢形態(tài) 對照組和維生素D缺乏組的卵巢切片均可見處于各個發(fā)育階段的卵泡和黃體，還可見囊狀擴(kuò)張的卵泡，見圖5(封3)。通過對各階段卵泡計數(shù)并比較，發(fā)現(xiàn)第24周維生素D缺乏組卵巢的囊狀卵泡數(shù)量顯著高于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 大鼠囊狀卵泡數(shù)量的比較(個,

2.7 相關(guān)性分析 相關(guān)性分析的結(jié)果顯示，血清25(OH)D水平與甘油三酯水平和LH/FSH比值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.378、 -0.362，P均<0.05)；但與總膽固醇、睪酮、雌二醇、孕酮、LH、FSH及AMH沒有顯著相關(guān)性(P均>0.05)。

3 討論

維生素D缺乏往往合并鈣、磷水平降低，既往有研究對敲除VDR基因或1α-羥化酶基因的小鼠補充鈣、磷后，小鼠出現(xiàn)的生殖功能異常得到糾正，維生素D對雌鼠生育的影響是通過調(diào)節(jié)鈣、磷水平實現(xiàn)的[6]。還有研究發(fā)現(xiàn)，增加鈣攝入可改善多囊卵巢綜合征(PCOS)患者的高雄激素血癥，增加高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)水平[7]。這些研究結(jié)果均表明，血鈣、磷可影響代謝、性激素水平及生殖功能。

維生素D缺乏的飼料喂養(yǎng)聯(lián)合不含紫外線光照環(huán)境是建立維生素D缺乏動物模型較為常用的方法之一，且符合現(xiàn)代人由于飲食結(jié)構(gòu)不平衡及戶外光照時間減少所致維生素D水平降低的特征[6]。Stavenuiter等[8]通過增加大鼠維生素D缺乏飼料中鈣、磷的含量，在引起維生素D缺乏的同時，維持了血清鈣、磷水平的穩(wěn)定。Sun等[6]給予1α-羥化酶基因敲除大鼠高鈣、高磷飲食，使大鼠維持正常的鈣、磷水平。本實驗結(jié)合既往文獻(xiàn)，在不含紫外線的白熾燈光照環(huán)境下，給予維生素D缺乏組幾乎不含維生素D的飼料，其中鈣和磷的含量較對照組標(biāo)準(zhǔn)飼料均升高4倍。喂養(yǎng)8、16、24周后，維生素D缺乏組維生素D水平顯著降低，鈣、磷水平較對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

臨床觀察性研究表明，維生素D水平與代謝綜合征的發(fā)生風(fēng)險及嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，PCOS女性血清25(OH)D水平與HOMA-IR呈負(fù)相關(guān)，補充維生素D則可以降低PCOS女性甘油三酯水平，改善糖代謝[11-12]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，維生素D缺乏組甘油三酯、空腹血糖、HOMA-IR增加，且血清25(OH)D水平與甘油三酯水平呈負(fù)相關(guān)，提示維生素D缺乏會影響糖、脂代謝。關(guān)于維生素D作用機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，維生素D缺乏會加重細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)，損害肝臟和胰腺對糖、脂代謝的調(diào)節(jié)功能[4, 13]。

VDR不僅存在于下丘腦、垂體，也存在于卵巢、子宮、胎盤等外周生殖器官[5]。提示維生素D可能作用于靶組織VDR，影響生殖功能。敲除VDR基因或1α-羥化酶的大鼠，性腺功能低下，卵泡形成受損，子宮發(fā)育不良[5-6]。卵巢顆粒細(xì)胞體外實驗發(fā)現(xiàn)，維生素D在細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)中起作用，影響顆粒細(xì)胞的增殖與凋亡[14]。與性激素合成密切相關(guān)的類固醇合成酶的表達(dá)也受維生素D影響，如維生素D可上調(diào)3β-羥基類固醇激素脫氫酶、類固醇合成快速調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞色素P450羥化酶mRNA表達(dá)，增加孕酮、雌二醇的合成[14-15]。本研究中，維生素D缺乏大鼠雌二醇水平有降低的趨勢，可能是維生素D缺乏后導(dǎo)致類固醇合成酶相關(guān)基因表達(dá)降低的結(jié)果。但兩組之間雌二醇、孕酮、睪酮差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，可能是因為：(1)大鼠體內(nèi)存在復(fù)雜的反饋機(jī)制及其他可能影響類固醇激素合成的因素，與單獨顆粒細(xì)胞培養(yǎng)時維生素D對類固醇激素的調(diào)節(jié)作用可能有差異。(2)本實驗維持了正常的鈣、磷水平，與既往一些研究的條件有所不同。

PCOS是育齡期女性最常見的生殖內(nèi)分泌疾病，也是無排卵性不孕最常見的原因[12]。臨床特點包括高雄激素血癥、月經(jīng)異常、不孕、卵巢多囊樣改變等，可伴有肥胖、胰島素抵抗、血脂紊亂等代謝異常[16]。研究發(fā)現(xiàn)，與健康育齡期女性相比，PCOS患者合并維生素D缺乏的比例更高[17]。且維生素D水平與PCOS患者的代謝及生殖異常具有相關(guān)性[17-18]。PCOS患者常存在高LH伴正?；虻退降腇SH，LH/FSH比值升高，影響卵泡發(fā)育，出現(xiàn)生殖功能障礙[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，維生素D缺乏大鼠LH水平有升高趨勢，F(xiàn)SH水平降低，LH/FSH比值升高，這與PCOS患者垂體促性腺激素的變化特點一致，且大鼠LH/FSH比值與25(OH)D水平呈負(fù)相關(guān)。既往也有研究發(fā)現(xiàn)，PCOS女性LH/FSH比值與25(OH)D水平具有相關(guān)性[20]。筆者推測維生素D缺乏與性激素水平失調(diào)有關(guān)，可能影響性激素分泌的中樞機(jī)制。

本研究還發(fā)現(xiàn)，大鼠維生素D缺乏的同時伴有AMH水平升高，卵巢囊狀卵泡數(shù)量增加。既往研究發(fā)現(xiàn)，維生素D與AMH水平密切相關(guān)[21]。維生素D通過抑制AMH水平，降低AMH受體、FSH受體的基因表達(dá)，調(diào)節(jié)AMH信號通路，參與卵泡的發(fā)育成熟過程[22]。維生素D缺乏后AMH與性激素的異常，可能共同參與了多囊卵巢卵泡異常的發(fā)生。

本研究結(jié)果提示，維生素D缺乏可影響雌性大鼠糖、脂代謝、性激素及AMH水平，卵巢出現(xiàn)多囊樣改變。維生素D缺乏可能參與PCOS代謝、生殖功能異常的發(fā)生，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。