宋劍波,周松松,楊 坤,曽黎明,王勝難,王國(guó)鑫,何 彬,王義華,黃長(zhǎng)干*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,江西南昌 330045；2.江西軒斛生物科技有限公司,江西鷹潭 335005)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)是蘭科石斛屬,為多年生的草本植物,是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材之一,在我國(guó)已經(jīng)有兩千多年的藥用歷史,具有養(yǎng)陰生津、益胃、抗腫瘤、抗突變、降血糖的功效,被譽(yù)為“中華九大仙草之首”[1-2]。野生鐵皮石斛生長(zhǎng)于海拔100～3 000 m的山地半陰濕巖石、樹(shù)皮上,喜溫暖濕潤(rùn)氣候和半陰濕的環(huán)境,不耐寒。鐵皮石斛種子細(xì)小,其種子在自然條件下需與合適的真菌共生才能萌發(fā),因而自身繁殖能力極低。再加上人類(lèi)對(duì)其生境的破壞和資源的過(guò)度利用,使野生鐵皮石斛資源瀕臨滅絕,成為“瀕危珍稀植物”,被列到《中國(guó)植物紅皮書(shū)》[3-5]。現(xiàn)有栽培鐵皮石斛的地區(qū)也從傳統(tǒng)的浙江、云南擴(kuò)展到廣西、廣東、福建、安徽、貴州、江蘇、北京、上海等10余個(gè)省市區(qū)[6]。在江西,石斛產(chǎn)業(yè)還處于起步階段,目前只在鷹潭、上饒、贛州、撫州等地有一定規(guī)模的種植。野生鐵皮石斛資源豐富,氣候生態(tài)環(huán)境適合鐵皮石斛規(guī)?；N植。

近年來(lái),在國(guó)際上發(fā)展起來(lái)一種新的生物鑒定技術(shù)——DNA條形碼技術(shù)，此技術(shù)主要是利用一段有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列提供快速、準(zhǔn)確的分子水平上的鑒定[7-8]。這項(xiàng)技術(shù)起源于 “生命條形碼計(jì)劃”(barcode of life project),“生命條形碼計(jì)劃”于2003年由加拿大安大略省圭爾夫(http://www.barcoding.si.edu)的研究人員發(fā)起,旨在建立一個(gè)基于標(biāo)準(zhǔn)分子方法的真核物種清單的通用系統(tǒng)，并于2004年由國(guó)際生命條形碼聯(lián)盟(CBOL)發(fā)起[9]。只要有準(zhǔn)確的分類(lèi)學(xué)鑒定,就可以建立一個(gè)公共的分類(lèi)群參考數(shù)據(jù)庫(kù),以此來(lái)鑒定更廣泛的物種。DNA條形碼可以為許多科學(xué)領(lǐng)域(如生態(tài)學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、流行病學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)、生物地理學(xué)和保護(hù)生物學(xué))和生物工業(yè)提供有力的支持。DNA條形碼的成本和時(shí)間效益使其能夠自動(dòng)識(shí)別物種。這在大型取樣活動(dòng)中特別有用,例如Craig Venter的全球海洋取樣小組的大規(guī)模采樣鑒定[10]。通過(guò)這種方式，DNA條形碼還可以改進(jìn)針對(duì)具有醫(yī)學(xué)、生態(tài)和農(nóng)學(xué)意義的病原物種的未知物種檢測(cè)和鑒定的大型調(diào)查[11]。此外,重要的是能夠識(shí)別、檢測(cè)和追蹤專(zhuān)利生物在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中的擴(kuò)散,以證實(shí)來(lái)源生物或生物資源的安全知識(shí)產(chǎn)權(quán)[12-14]。

目前植物DNA條形碼主要根據(jù)國(guó)際生命條形碼聯(lián)盟(CBOL)的建議,在植物葉綠體中尋找植物 DNA 條形碼[15]。ITS序列可以作為種子植物的核心條形碼,用于植物的分類(lèi)鑒定[16]。DNA條形碼將DNA的標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域作為物種識(shí)別的工具進(jìn)行測(cè)序,截至目前,在植物中還沒(méi)有形成統(tǒng)一的DNA條形碼通用序列,其物種水平的鑒定效率達(dá)92.7%。目前核基因ITS2片段是公認(rèn)的具有相對(duì)優(yōu)勢(shì)的片段而被關(guān)注[17-23]。近幾年國(guó)內(nèi)中藥 DNA 條形碼分子鑒定得到快速發(fā)展,加快了中藥鑒定標(biāo)準(zhǔn)化的進(jìn)程。通過(guò)中藥DNA條形碼鑒定研究,我國(guó)首次提出將 ITS2序列作為藥用植物鑒定的通用條形碼序列,并建立以ITS2為核心、psb A-trn H為補(bǔ)充序列的植物類(lèi)藥材DNA條形碼鑒定體系和以COI序列為核心、ITS2為輔助序列的動(dòng)物類(lèi)藥材DNA條形碼鑒定體系,為中藥DNA條形碼鑒定的發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)[24]。ITS2片段在植物物種水平上變化速度相對(duì)而言比較快,有更多的突變位點(diǎn)來(lái)區(qū)別不同品種之間的微小差別,因此在品種的鑒定上具有很大的潛在價(jià)值。筆者利用ITS2序列對(duì)龍虎山鐵皮石斛31個(gè)樣品進(jìn)行了分類(lèi)和鑒定,以期為保護(hù)江西優(yōu)質(zhì)的石斛資源奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料試驗(yàn)樣本為江西省鷹潭市龍虎山石斛野生種質(zhì)資源。根據(jù)外型不同采取野生石斛樣品31個(gè)(表1)。

表1 石斛樣品編號(hào)

1.2儀器與試劑儀器：DYY-5電泳儀(北京六一儀器廠)；HC-2518R離心機(jī)(加拿大BBI公司)；FR980凝膠成像系統(tǒng)(上海復(fù)日科技儀器有限公司)；S1000PCR儀(美國(guó)伯樂(lè)BIO-RAD)；旋渦混勻器(美國(guó)LABNET)；測(cè)序儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；移液槍(北京DRAGONMED)。

試劑：植物基因組DNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)； ExTaq酶(TaKaRa寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)；瓊脂糖(BIOWEST ,西班牙)；引物交由上海生工生物公司合成,75%乙醇,液氮。

1.3方法采用植物基因組DNA提取試劑盒對(duì)31個(gè)樣品進(jìn)行DNA提取,所有基因組DNA樣品采用ITS2通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.1總DNA的提取。

(1)取新鮮鐵皮石斛樣品的葉片100 mg左右放入研缽,加入液氮,快速充分碾磨成細(xì)粉,之后利用植物基因組DNA提取試劑盒。

(2)把細(xì)粉轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中,加入550 μL 65 ℃預(yù)熱的Buffer P1和4 μL RNase A,劇烈渦旋1 min,靜置10 min。

(3)加入130 μL Buffer P2混勻,1 200 r/min離心3 min,吸取上清液于分離柱A,12 000 r/min離心3 min,收集濾液加入1.5倍體積的Buffer P3輕輕渦旋。

(4)將上述液體加入一個(gè)吸附柱AC中,12 000 r/min離心1 min,棄廢液。

(5)加入700 μL漂洗液WB,12 000 r/min離心1 min,棄廢液。

(6)將吸附柱AC放回空收集管中,12 000 r/min,5 min,盡量去除漂洗液。

(7)將吸附柱AC放于干凈的離心管中,在吸附膜中間加入25 μL洗脫緩沖液EB(先放于65 ℃水浴中預(yù)熱使用)；室溫放置3～5 min,12 000 r/min離心1 min,再加入25 μL洗脫緩沖液,放置3～5 min,12 000 r/min離心1 min,收集DNA。

(8)收集的DNA可存放于2～8 ℃,長(zhǎng)期保存則放于-20 ℃。用 0.8%的瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè),并經(jīng)UItraPowerDNA染料染色后,在凝膠成像系統(tǒng)上觀測(cè)其純度并判斷DNA分子的大小及完整性,選取條帶單一、清晰明亮的基因組用于下一步試驗(yàn)。

1.3.2序列擴(kuò)增與測(cè)定。PCR反應(yīng)體系為模板DNA 1 μL、ExTaq酶 10 μL、引物A(P1) 1 μL、引物S(P2) 1 μL、滅菌水 7 μL。

正反序列引物分別為P1：CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC；P2：TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃高溫預(yù)變性5 min；94 ℃模板變性30 s,54 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸45 s,共計(jì)35個(gè)循環(huán)。直接測(cè)序PCR擴(kuò)增純化,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,進(jìn)行ITS2序列的測(cè)序工作,送到上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3.3數(shù)據(jù)處理。通過(guò)DNA條形碼技術(shù)對(duì)在龍虎山采取的31株野生石斛樣品進(jìn)行分子鑒定,之后在NCBI上進(jìn)行樣品BLAST同源性比對(duì)分析。采用序列拼接軟件Codon Code Aligner V3.0對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行校正,去除低質(zhì)量序列及引物區(qū),進(jìn)行多序列比對(duì)和人工校驗(yàn)。然后使用基于隱馬爾可夫模型[25-28](hidden Markov model,HMMer)去除所有序列兩端的5.8S和26S區(qū)段,進(jìn)而獲得ITS2間隔序列。將所得DOKM-1、DOKM-2、DOKM-4、DOKM-5、DOKM-12、DOKM-13、DOKM-19、DOKM-21、DOKM-24、DOKM-26號(hào)的數(shù)據(jù)在Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)網(wǎng)站上進(jìn)行樣品間的兩兩同源性比對(duì)。之后將這10個(gè)樣品數(shù)據(jù)導(dǎo)入生物信息學(xué)軟件MEGA 7.0進(jìn)行多序列比對(duì),并使用同種軟件計(jì)算K2P遺傳距離,測(cè)定樣品之間親緣關(guān)系,用軟件MEGA 7.0對(duì)所得序列構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1樣品間的兩兩同源比對(duì)從31株樣品中鑒定出10個(gè)品種,挑選10個(gè)品種的樣品進(jìn)行兩兩同源性比對(duì)，結(jié)果表明,品種十與其他品種同源差異最大,其他品種間雖有差異,但變化極小(表2)。

表2 10個(gè)品種之間的兩兩同源比對(duì)

2.2野生石斛分子鑒定通過(guò)DNA條形碼技術(shù)對(duì)在龍虎山采取的31株野生石斛樣品進(jìn)行分子鑒定,之后在NCBI上進(jìn)行樣品BLAST同源性比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn),這31株樣本分別屬于10個(gè)品種。其中,有9個(gè)品種為鐵皮石斛,1個(gè)品種為霍山石斛。在9個(gè)鐵皮石斛品種中,有6個(gè)龍虎山特有的鐵皮石斛品種,其中DOKM-1、DOKM-3、DOKM-12、DOKM-21、DOKM-19、DOKM-4和DOKM-26為龍虎山特有種,其生長(zhǎng)形態(tài)如圖1(選自江西龍虎山江西龍虎天元生物科技有限公司)所示。

注：A.DOKM-1；B.DOKM-3；C.DOKM-21；D.DOKM-19；E.DOKM-12；F.DOKM-26圖 1 龍虎山鐵皮石斛特有品種 Fig.1 Specific varieties in Longhu Mountain

其中,品種一、品種二、品種三、品種四、品種五和品種六都屬于龍虎山特有的野生鐵皮石斛品種(表3)。將這6個(gè)品種在NCBI上進(jìn)行登記認(rèn)證,其GenBank序列號(hào)見(jiàn)表4。對(duì)其ITS2序列進(jìn)行分析后,發(fā)現(xiàn)龍虎山特有的鐵皮石斛品種的序列長(zhǎng)度為597～601 bp,ITS序列的GC含量為52.91%～53.27%,平均GC含量約為53.04%。

表3 龍虎山石斛種質(zhì)鑒定

將鑒定出10個(gè)品種的基因序列使用MEGA6.0計(jì)算K2P遺傳距離,結(jié)果表明,其種內(nèi)的遺傳距離在0～0.005(表5)。由此可知,龍虎山特有品種的鐵皮石斛之間序列進(jìn)化變異極小。

2.3系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析使用MEGA 6.0 軟件對(duì)31株樣品的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析并建立DNA條形碼的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)，結(jié)果表明,31株龍虎山野生石斛樣品有30株為鐵皮石斛,1株為霍山石斛,分屬于10個(gè)品種,其中6個(gè)是龍虎山特有品種。它們之間有差異,但變異程度極小,都是由同一分支進(jìn)化而來(lái)。

表4 6種特有品種ITS2間隔區(qū)的基本信息

表5 10個(gè)品種之間的K2P遺傳距離

圖 2 31株樣品之間的進(jìn)化樹(shù)Fig.2 The phylogenetic tree of the thirty-one sample

3 討論與展望

DNA條形碼技術(shù)是指使用通用DNA序列信息鑒定物種變異類(lèi)型的一種分子生物學(xué)技術(shù)。在物種鑒別中,有很多可用的方法,可以是從形態(tài)方面的鑒別,也可以是從分子水平上的檢測(cè)。因從形態(tài)學(xué)上的方法區(qū)別近屬物種難度比較大,所以一般選用從分子水平來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。雖然DNA分子在進(jìn)化了數(shù)億萬(wàn)年之后,種屬之間差異很大,但對(duì)于同一物種而言,DNA條形碼技術(shù)在物種變異過(guò)程的鑒定中具有很大的作用。

該研究利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)龍虎山地區(qū)的野生石斛資源進(jìn)行了分子遺傳學(xué)鑒定,進(jìn)行分門(mén)別類(lèi),并結(jié)合江西其他地區(qū)已知的野生石斛建立江西地區(qū)野生石斛種質(zhì)資源庫(kù),以保護(hù)江西優(yōu)質(zhì)的石斛資源。鷹潭龍虎山是我國(guó)鐵皮石斛資源主要分布區(qū)之一,野生鐵皮石斛資源豐富,氣候生態(tài)環(huán)境適合鐵皮石斛規(guī)?；N植。目前,龍虎山鐵皮石斛基地已經(jīng)建立穩(wěn)定有效的龍虎山石斛新品種的組培快繁體系和栽培技術(shù)體系,一方面可以保護(hù)龍虎山的野生種質(zhì)資源,另一方面可以對(duì)新品種進(jìn)行大規(guī)模的人工栽培與開(kāi)發(fā),還可以對(duì)比龍虎山石斛與其他地區(qū)石斛的營(yíng)養(yǎng)成分差別,最終篩選出優(yōu)質(zhì)的石斛新品種并進(jìn)行推廣。