李俊杰 宋艷艷 趙小奇 丁劉闖 韓祥禎 周琦琪 何惠宇

間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛存在于多種組織中，是一種多能干細(xì)胞，具有向多種細(xì)胞分化的潛能，可向神經(jīng)元分化[1]，成骨細(xì)胞分化[2]等，這種多能性使間充質(zhì)干細(xì)胞成為組織工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，尤其是在骨和軟骨修復(fù)領(lǐng)域，是骨組織工程應(yīng)用的細(xì)胞來源[3]。并且是一種很有吸引力的再生醫(yī)學(xué)資源[4]。

RNAi（RNA interference，RNAi）是科學(xué)發(fā)展中具有里程碑意義的發(fā)現(xiàn)，一個典型的應(yīng)用是將小干擾RNA（SiRNA）傳遞到細(xì)胞中，觸發(fā)互補(bǔ)mRNA 的降解，從而降低內(nèi)源性基因的表達(dá)[5]。RNAi 也被應(yīng)用于提高免疫系統(tǒng)[6]。動物基因研究[7]。具有高精度治療，將成為用于精密醫(yī)學(xué)的新的潛在模式[8]。

骨穩(wěn)態(tài)是由破骨細(xì)胞骨吸收和成骨細(xì)胞骨形成之間的平衡維持的，骨細(xì)胞活性失調(diào)可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥，其特點(diǎn)是破骨細(xì)胞活躍，導(dǎo)致骨量降低，骨脆性和骨折風(fēng)險增加[9]。M-CSF 是破骨細(xì)胞形成的關(guān)鍵因子之一[10]，破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞能夠相互作用，相互影響。本實(shí)驗(yàn)利用RNAi 探究M-CSF與成骨相關(guān)因子的關(guān)系，可為組織工程因子的利用提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

資料和方法

一、材料

成年SD 大鼠，雌雄不限，體重100g，由新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

二、方法

1.小鼠骨髓巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)：取4 周齡SD 大鼠，脫頸椎處死，取股骨及脛骨，去兩端，高糖型DMEM（100U/ml 青霉素、100U/ml 鏈霉素、10%胎牛血清）溶液，沖洗骨髓，離心（1000rpm×5min）1 次。加入5ml DMEM 培養(yǎng)基，37.0℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72h 后去上清液，余下貼壁細(xì)胞即為骨髓干細(xì)胞（bone marrow-derived macrophages，BMSCs）。隔兩天換液，長至80%以上傳代。取第三代骨髓干細(xì)胞行流式鑒定。

shRNA（M-CSF-RNAi），陰性對照質(zhì)粒及甘油菌液質(zhì)粒提取盒，DNA 產(chǎn)物純化試劑盒感受態(tài)DH5α、脂質(zhì)體LipofectamineTM 3000、Trizol逆轉(zhuǎn)錄、PCR 試劑盒激光共聚焦顯微鏡，倒置顯微鏡流式細(xì)胞儀二氧化碳培養(yǎng)箱、核酸蛋白測定儀、超凈工作臺（SW-CJ-2F）PBS、0.25%胰蛋白酶、α-MEM、青-鏈霉素胎牛血清紫外分光光度計、凝膠成像儀、熒光定量PCR 儀SOC 液體及固體細(xì)菌培養(yǎng)基引物吉凱公司,中國天根公司，中國Invitrogen 公司，美國TAKARA，日本萊卡，德國FACSAriaⅡ，美國Thermon，美國安泰公司，中國Hyclone,美國四季青，中國Bio-RAD 公司，美國生工公司，中國

2.M-CSF shRNA 序列設(shè)計和重組質(zhì)粒的鑒定：根據(jù)GenBank 中的M-CSF基因序列，參照shRNA設(shè)計原則，在線分析設(shè)計，確定3 個靶序列，設(shè)計3個針對M-CSF 的短發(fā)夾RNA（small hair RNA，shRNA）及一對陰性對照序列。最終篩選一個轉(zhuǎn)染效率及沉默效果最好的靶序列。序列經(jīng)上海吉凱有限公司合成。序列：

正義鏈：GATCCCCACCGAGAGGCTACAGGAACT CTCGAGAGTTCCTGTAGCCTCTCGGTGTTTTTGGAT

反義鏈：AGCTATCCAAAAACACCGAGAGGCTACA GAACTCTCGAGAGTTCCTGTAGCCTCTCGGTGGG

將合成的DNA與GV-102 質(zhì)粒連接。轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH-5α 菌種，篩選陽性克隆。挑取單菌落置液體培養(yǎng)基過夜；用質(zhì)粒微量抽提試劑盒小量制備質(zhì)粒，分光光度儀測定濃度及純度，凝膠電泳并送至上海吉凱公司測序。

3.轉(zhuǎn)染骨髓干細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)分組：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒為質(zhì)粒對照組，轉(zhuǎn)染M-CSF 重組質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)組。

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓干細(xì)胞：將細(xì)胞按1×105個/孔接種于六孔培養(yǎng)板，第二天待細(xì)胞融合至90%時，用無血清培養(yǎng)基稀釋重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒和LipofectamineTM3000 混合，孵育20min，逐滴加入，混勻，培養(yǎng)6h 后終止轉(zhuǎn)染，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48h 后觀察。

Trizol 法提取RNA：依次加入trizol、氯仿、異丙醇、75%酒精，DEPC 水，紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度。兩步法反轉(zhuǎn)錄為cDNA：①去除基因組DNA 反 應(yīng)：5×gDNA Eraser Buffer（2μL），gDNA Eraser（1μL），Total RNA（小于1μg），RNase Free dH2O（up to 10 μl）。室溫反應(yīng)5～30min②反轉(zhuǎn)錄反 應(yīng)：步 驟①反 應(yīng) 液（10μl），PrimeScript RT Enzyme Mix I（1μL），RT Primer Mix（1μL），5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）（4μL），RNase Free dH2O（4μL），上PCR 儀器，37℃15min，85℃5s，1 個循環(huán)。

兩步法實(shí)時熒光定量PCR: 引物由上海生工生物工程公司合成，M-CSF 上游引物CTGCTGGTCTGTCTCCTCGT，下游引物GTCTCCATTTGGCTGTCGAT，OSX 上游引物AAGGCAGTTGGCAATAGTGG，下游引物TGAATGGGCTTCTTCCTCAG；OCN 上游引物GGTGCAGACCTAGCAGACACCA，下游引物AGGTAGCGCCGGAGTCTATTCA。

熒光定量PCR 反應(yīng)體系為20μL，Premix Ex Taq 10μL，cDNA 2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，ddH2O6 μL；反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下：95℃2min，95℃5s，60℃10s，40 個循環(huán)。重復(fù)3 次。

主要觀察指標(biāo)及數(shù)據(jù)分析：轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組和對照組相關(guān)成骨基因mRNA 水平表達(dá)的差異。采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS16.0 分析，實(shí)驗(yàn)組及對照組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)分析，P＜0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定培養(yǎng)的第3 代大鼠BMSCs 均一表達(dá)CD29，CD44，陽性率分別為50.2%，70.3%；而CD45，呈陰性，陽性率分別為4.9%。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞鑒定

2.選取ALB 平板上的可疑菌落搖菌后提取質(zhì)粒，用瓊脂凝膠電泳分析可見1 條約6400bp 的條帶。大小與預(yù)期結(jié)果相吻合。測序結(jié)果表明，與所設(shè)計的干擾序列完全一致。結(jié)果靶向沉默小鼠M-CSF基因的載體構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒1%凝膠電泳

圖3 M-CSF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后

圖4 陰性對照重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后

3.M-CSF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs 細(xì)胞：轉(zhuǎn)染48h 后，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，激光共聚焦顯示綠色熒光。

RT-PCR：48后，RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，M-CSFmRNA下調(diào)，相關(guān)破骨基因中OSX、OCN表達(dá)上降（P＜0.05）BMP-2基本不變（P＞0.05）。

圖5 OSX、OCN、BMP-2相對陰性對照組表達(dá)差異圖

討 論

破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞聯(lián)系緊密，能夠相互作用，相互影響，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞在骨吸收過程中的上清液可能通過抑制增殖、脂肪形成和促進(jìn)分化而提高BMSCs 的成骨活性[11]。

M-CSF 是形成破骨細(xì)胞的關(guān)鍵因子[12]，抑制M-CSF 的作用能夠減少Oc（Osteoclast）的形成[13]。進(jìn)而降低骨吸收。M-CSF 高表達(dá)，能夠?qū)е鹿鞘杷蒣14]。M-CSF 表達(dá)的變化，可能會影響破骨或成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)利用RNAi 轉(zhuǎn)染骨髓干細(xì)胞，降低M-CSF 的表達(dá)，觀察成骨相關(guān)基因OSX、OCN的表達(dá)變化。探索M-CSF與其他成骨基因間的動態(tài)變化。為組織工程中細(xì)胞因子的利用及骨吸收機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。

MAPK 信號通路是在骨質(zhì)疏松發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，而MAPK 通路中主要有以下3 條通路組成：ERK1/2 通路，通路和JNK 通路。p38MAPK 能夠影響成骨細(xì)胞的活化[15]。同時，TGFΒ 能夠通過介導(dǎo)Smad 途徑激活P38MAPK[16]。

成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞來源于共同的前體細(xì)胞，OSX 誘導(dǎo)干細(xì)胞先經(jīng)歷一個雙向潛能或多向潛能的分化階段再分化為成骨細(xì)胞[17]。OSX在所有發(fā)育中的骨骼中都有特異性表達(dá)。國外有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，OSX 過表達(dá)的BMSCs 植入小鼠體內(nèi)后，參與移植后創(chuàng)面的愈合，骨-種植界面骨密度增加，促進(jìn)了骨整合[17]。剔除OSX 后，小鼠無骨形成。骨膜和膜骨元素間質(zhì)中的細(xì)胞不能分化為成骨細(xì)胞。然而，這些細(xì)胞確實(shí)表達(dá) Runx2 （runt-related transcription factor-2，Runx2），相反，OSX在Runx 2 空小鼠中不表達(dá)，因此，OSX 作用于Runx 2 的下游[18]。已有研究證實(shí)Runx 2 可能控制了肥大軟骨細(xì)胞的分化[19]。

在膜和軟骨內(nèi)骨骼中，OSX 被剔除的預(yù)成骨細(xì)胞被阻止分化為成骨細(xì)胞，但表達(dá)多種軟骨細(xì)胞標(biāo)記物。包括sox 9、sox 5 等在內(nèi)的基因。Runx 2 表達(dá)的前成骨細(xì)胞在一個或多個步驟中分化成成熟的成骨細(xì)胞，并表達(dá)特征性的成骨標(biāo)記基因。其他轉(zhuǎn)錄因子與OSX 協(xié)同作用，激活體內(nèi)成骨細(xì)胞內(nèi)基因，產(chǎn)生特異性骨基質(zhì)。有學(xué)者推測，在成骨細(xì)胞中，OSX 可能是Sox 9 和Sox 5 表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)因子[20]。

本實(shí)驗(yàn)顯示：M-CSF 下調(diào)后，OSX 表達(dá)上調(diào)，推測M-CSF與TGFΒ 通過介導(dǎo)Smad 激活p38MAPK信號通路有關(guān)聯(lián)，同時由于Sox 9 和sox 5與M-CSF 負(fù)相關(guān)，推測Sox 9 和sox 5 表達(dá)下降，干細(xì)胞形成成骨細(xì)胞的能力上升但形成軟骨細(xì)胞的能力下降。

腫瘤壞死因子能激活NF-κB，通過隨后上調(diào)TAZ 的表達(dá)誘導(dǎo)成骨[21]。TAZ 可與OCN 協(xié)同激活成骨[22]。ATF 4 通過與骨鈣素特異性元件（OSE1）的結(jié)合，積極調(diào)節(jié)OCN 的表達(dá)[17]。在基質(zhì)礦化階段，ATF 4在很大程度上受到c-Jun N-末端激酶（JNK）的正調(diào)控，進(jìn)而影響OCN 和BSP 的表達(dá)[23]。本研究顯示M-CSF 下調(diào)后，OCN 表達(dá)上調(diào)，推測TAZ 及ATF4 表達(dá)上調(diào)，M-CSF 可能與NF-κB 及JNK在通路上有聯(lián)系。

具體環(huán)節(jié)需要進(jìn)一步驗(yàn)證。接下來需要提高M(jìn)-CSF基因表達(dá)，檢測相關(guān)成骨基因的表達(dá)，進(jìn)一步探索基因間相互關(guān)系。

但本研究仍然存在一定的局限性，在 M-CSF發(fā)揮作用機(jī)制的具體環(huán)節(jié)，仍未探討清楚，需要進(jìn)一步深入的研究。