周 方，張楊波，鄭 新，林海燕,3*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙410128；3.湖南省植物功能成分利用協(xié)調(diào)創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

白茶是我國特種茶之一，發(fā)源于中國福建福鼎，具有抗輻射、抗氧化、抗腫瘤和降血壓、降血脂、降血糖等功效[1]。不同年份的白茶化學(xué)成分含量不同，其兒茶素組分含量總趨勢(shì)一致，表現(xiàn)為EGCG（表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯）>ECG（表兒茶素沒食子酸脂）>EGC（表沒食子酸兒茶素） >EC（表兒茶素） >C（兒茶素），即酯型兒茶素比例較高。白茶中含有咖啡堿、可溶性糖、氨基酸和黃酮類等物質(zhì)，對(duì)茶葉的品質(zhì)及藥理功效起到了重要的作用[2]。

炎癥是病原微生物侵入機(jī)體內(nèi)造成機(jī)體內(nèi)一系列不正常的病理性反應(yīng)，而且在炎癥的整個(gè)過程都受到炎癥相關(guān)信號(hào)分子的嚴(yán)格調(diào)控，這些信號(hào)分子與炎癥的發(fā)生、維持和消退有著密切聯(lián)系。白茶中含有大量的茶多酚、茶氨酸等生物活性成分，研究發(fā)現(xiàn)這些活性單體成分在許多體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中具有較好的抗炎功效[3-5]。

本實(shí)驗(yàn)選用LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7建立炎癥反應(yīng)模型[6]，選用一氧化氮（NO）與白介素-6（IL-6）這兩個(gè)炎癥因子探討白茶提取物對(duì)RAW264.7的抗炎效果[7-8]；探究白茶提取物對(duì)一氧化氮合酶（iNOS）與IL-6等mRNA表達(dá)的影響及其在核酸水平上的作用效果。本研究通過建立炎癥模型，研究白茶提取物抗炎功效，為后續(xù)研究老年衰退性疾病與代謝綜合征提供參考。

1 材料與儀器

細(xì)胞RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞株系（自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心）；新白茶（2018年白牡丹，福建品品香公司）、陳年白茶（2014年白牡丹，福建品品香公司）；噻唑藍(lán)（Amresco)；DMSO、LPS、吲哚美辛（Sigma）；胎牛血清(Hyclone)；PBS（索萊寶）；qPCR引物（上海生工）；DMEM培養(yǎng)基（上海生工）；胎牛血清（BI）；SYBR熒光染料（TakaRa）；NO試劑盒（碧云天）；總RNA提取試劑盒 （全式金）；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（全式金）。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮儀(EL-131 Buchi)；高速冷凍干燥機(jī)（Christ）；超凈工作臺(tái)（力康opticlean-1300）；CO2培養(yǎng)箱 （Nuaire）；倒置顯微鏡 （Leica Microsystems）；熒光定量PCR儀（Thermo）；多功能酶標(biāo)儀（Thermo）；普通離心機(jī)（Rotina）；精密電子天平（Starorius）等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 白茶提取物的制備

稱取不同年份白茶茶樣100 g，加入1000 mL沸水水浴加熱30 min，過濾后再加入沸水定容500 mL，水浴25 min，合并濾液經(jīng)冷凍干燥48 h制成茶粉，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 白茶提取物主要成分測(cè)定

茶多酚的測(cè)定采用福林酚比色法，參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T8313-2008；黃酮類化合物總量測(cè)定采用三氯化鋁比色法[9]；游離氨基酸的測(cè)定參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T8314-2013；兒茶素組分、生物堿和沒食子酸含量的測(cè)定采用HPLC檢測(cè)法[10]。

2.3 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)與分組

液氮凍存的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞系復(fù)蘇后，放置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)，按照1∶4至1∶8比例傳代。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

空白對(duì)照組（control）：不做任何處理，正常培養(yǎng)24 h；炎癥模型組：1 μg/mL LPS持續(xù)刺激細(xì)胞24 h；處理組：不同濃度白茶提取物（10 μg/mL、30 μg/mL 和 50 μg/mL） 處理細(xì)胞24 h；LPS（1μg/mL） 和不同濃度白茶提取物（10 μg/mL、30 μg/mL 和 50μg/mL） 共同處理細(xì)胞 24 h；不同濃度 EGCG（1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL和20 μM） 單獨(dú)處理細(xì)胞24 h； LPS（1 μg/mL） 和 不 同 濃 度 EGCG（1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和 20 μM） 共同處理24 h；陽性藥物組：1 μg/mL LPS和 20 μg/mL吲哚美辛[11]共同處理細(xì)胞24h。

2.4 RW264.7細(xì)胞炎癥模型的建立

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按1×104密度接種于96孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用移液槍吸出每孔舊的培養(yǎng)液，分別加入含有不同濃度 （0 μg/mL、1μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL和10 μg/mL） LPS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后取上清培養(yǎng)液，于3000 rpm、4℃離心10 min，取上清液用于NO試劑盒檢測(cè)炎性因子NO的分泌量；與上述操作一致的96孔板中加入MTT染色，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后棄上清液，加入DMSO（150 μL/孔），搖床上輕晃10 min使細(xì)胞內(nèi)晶體完全溶解后，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值OD（波長(zhǎng)為570 nm）以檢測(cè)LPS對(duì)細(xì)胞活力影響。具體計(jì)算公式如下：

2.5 MTT法檢測(cè)白茶提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力影響

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按1×104密度接種于96孔板。24 h后，空白組不作任何處理；模型組按照LPS最佳濃度誘導(dǎo)；處理組用不同濃度白茶提取物（10μg/mL、30 μg/mL和 50 μg/mL） 單獨(dú)處理細(xì)胞以及LPS（1μg/mL） 和不同濃度白茶提取物 （10 μg/mL、30 μμg/mL和50 μg/mL） 共同處理細(xì)胞。24 h后采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)活力。

2.6 中性紅法測(cè)定巨噬細(xì)胞吞噬活性

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按1×104密度接種于96孔板。48 h后，每孔加入0.075%中性紅生理鹽水溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸取上清液，用PBS緩沖液清洗3次，每孔加入細(xì)胞裂解液（冰醋酸:乙醇=1:1） 100μL，4℃下放置2 h，待細(xì)胞裂解后測(cè)定吸光度值OD（波長(zhǎng)為540 nm）。

2.7 NO試劑盒檢測(cè)炎癥因子NO的分泌情況

將RAW264.7細(xì)胞株系以1×104密度接種于96孔板，模型組LPS誘導(dǎo)炎癥，按上述分組處理細(xì)胞。24 h后，用NO試劑盒檢測(cè)NO濃度，按照說明書操作，最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值（波長(zhǎng)為540 nm）。

2.8 iNOS和Il-6基因表達(dá)的測(cè)定

提取細(xì)胞的總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，熒光定量qPCR檢測(cè)炎癥因子iNOS和Il-6 mRNA基因表達(dá)。各待測(cè)基因mRNA序列從NCBI中獲取，引物由primer 6設(shè)計(jì)，按表1合成。并按20 μL反應(yīng)體系：SYBR Green Mix 10 μL，Rox 0.4 μL，上下游引物各 0.4 μL （10 μmol/L），cDNA 2μL，RNase-free H2O 6.8 μL；反應(yīng)條件如下：95℃變性10 min；95℃30 s、60℃ 30 s、72℃ 20 s，共 40個(gè)循環(huán)；95℃ 30 s，55℃30 s，95℃30 s。每個(gè)標(biāo)本均作三個(gè)復(fù)孔，復(fù)孔間的Ct值差異控制在0.5以內(nèi)。

待測(cè)基因樣本的mRNA相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用以下公式：

待測(cè)基因樣本mRNA相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct

2.9 統(tǒng)計(jì)方法

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，采用GraphPad Prism 7軟件分析數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 內(nèi)參及目的基因熒光定量PCR反應(yīng)的引物序列Table 1 Primer sequences for fluorescent quantitative PCR reaction of reference and target genes

3 結(jié)果與分析

3.1 白茶提取物中主要化學(xué)成分含量

由表2可知，在白茶提取物中，茶多酚含量最高，其中2018年白茶的茶多酚含量達(dá)到了23.15%，比2014年白茶茶多酚含量高出1.91%；貯藏過程中，游離氨基酸、EGCG和EGC含量具有小幅度下降，但是咖啡堿含量基本上保持一致，這與咖啡堿是嘌呤堿雜環(huán)化合物，具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)而相對(duì)比較穩(wěn)定有關(guān)；2018年白茶的黃酮含量為5.64 mg/g，2014年白茶的黃酮含量為5.98 mg/g，上升幅度為6.03%，原因可能是茶葉在貯藏過程中酚類物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)化，形成了黃酮類物質(zhì)[12]。

表2 白茶提取物中主要化學(xué)成分含量Table 2 Contents of main chemical components in White tea extract

3.2 RAW264.7細(xì)胞炎癥模型的建立

熒光顯微鏡下觀察RAW264.7細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，生長(zhǎng)速度較快，簇狀生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞還未貼壁時(shí)，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，其細(xì)胞質(zhì)有一環(huán)“光圈”，折光透明光亮。如圖1-A所示，RAW264.7細(xì)胞傳代后可在2～4 h內(nèi)貼壁，一般一小時(shí)后就可牢固貼壁了，貼壁后大多數(shù)也是呈圓形或橢圓形生長(zhǎng)。模型組給予1μg/mL LPS刺激后，細(xì)胞會(huì)變?yōu)轭愃扑慕切位蚨噙呅?，?xì)胞質(zhì)出現(xiàn)顆粒性物質(zhì)，并且都伸出偽足之類，胞體變大，簇狀生長(zhǎng)消失，見圖1-B。結(jié)果與鄧延珍的研究一致[13]。

圖1 倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)Fig.1 RAW264.7 cells under inverted microscope

如圖2-A所示，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7 分別在 1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL和10μg/mL的LPS刺激誘導(dǎo)下，均能顯著提高炎癥因子NO的分泌量，且呈劑量關(guān)系，表現(xiàn)極顯著性差異（P＜0.05）。通過比較細(xì)胞活力大小來評(píng)估四種濃度對(duì)細(xì)胞活性的影響，如圖2-B所示，1μg/mL LPS細(xì)胞的相對(duì)活力與正常組相比相對(duì)活力相差不大，2μg/mL、5μg/mL和10 μg/mL LPS均能顯著提高細(xì)胞相對(duì)活力，對(duì)RAW264.7細(xì)胞有增殖的效果。綜合分析得出，1μg/mL LPS能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，并對(duì)細(xì)胞活力無影響，因此選用1 μg/mL的LPS誘導(dǎo)RAW264.7建立細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，這與Swirski F K實(shí)驗(yàn)建模方法一致[14]。

3.3 白茶提取物對(duì)細(xì)胞活力的影響

圖2 不同濃度LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中NO含量和細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effects of different concentrations of LPS on NO content and cell viability in RAW264.7 cells A:NO content;B:Relative cell viability

MTT法可以檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)，其原理是活細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶能將四氮唑化物（MTT）由黃色還原為藍(lán)色的甲臜（Formazan），后者溶于有機(jī)溶劑（如二甲基亞砜、無水乙醇或酸化異丙醇等），產(chǎn)量與活細(xì)胞數(shù)成正比[15]。與對(duì)照組比較，EGCG和白茶提取物對(duì)細(xì)胞相對(duì)活力沒有顯著變化，說明此實(shí)驗(yàn)條件下該濃度范圍內(nèi)的EGCG、白茶提取物均未對(duì)細(xì)胞的活性造成顯著影響（圖3）。

圖3 不同處理對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effects of different treatments on the viability of RAW264.7 cells

圖4 不同處理對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響Fig.4 Effects of different treatments on the phagocytic activity of RAW264.7 macrophages

圖5 不同處理對(duì)LRS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO表達(dá)的影響Fig.5 Effects of different treatments on No expression RAW 264.7 cells induced by LPS

3.4 不同處理對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響

有研究結(jié)果表明，20μmol/L的EGCG可以降低巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，并提高吞噬活性[16]。如圖4-A所示，用LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞的吞噬活性相比于正常細(xì)胞是顯著變化的，當(dāng)使用不同濃度的EGCG（1 μM、5 μM、10μM和20 μM）處理時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20 μM的EGCG能夠有效提高巨噬細(xì)胞的吞噬活性。由圖4-B實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白茶提取物均能顯著提高RAW264.7細(xì)胞的吞噬活性，白茶提取物具有活化RAW264.7細(xì)胞，提高吞噬能力的作用，可保護(hù)機(jī)體免受抗原感染。

3.5 不同處理對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞后NO表達(dá)的影響

EGCG具有較好的抗炎作用[17-18]。如圖5-A所示，LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的NO釋放量顯著高于正常組（P＜0.01）；與模型組相比，EGCG能夠極顯著的抑制RAW264.7細(xì)胞中NO的產(chǎn)生，且具有顯著性差異（P＜0.05）。采用新、陳年白茶提取物作為處理組，分別加入10 μg/mL、30 μg/mL 和 50 μg/mL 的茶葉提取物+LPS（1 μg/mL） 共同作用 RAW264.7細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5-B所示，新白茶提取物和陳年白茶提取物均能有效抑制RAW264.7細(xì)胞中NO的產(chǎn)生，且具有極顯著性差異（P＜0.05），且陳年白茶提取物的抑制效果優(yōu)于新白茶提取物。白茶加工工藝簡(jiǎn)單，經(jīng)萎凋干燥制作而成，鮮葉中的多酚與咖啡堿等物質(zhì)損耗較低，這些物質(zhì)能抑制NF-KB信號(hào)途徑的激活下調(diào)iNOS表達(dá)[19-20]。

3.6 不同處理對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中炎癥因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響

誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（iNOS）是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的蛋白酶，細(xì)胞在正常情況下不表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞被LPS刺激活化時(shí)，炎癥反應(yīng)激活，誘導(dǎo)細(xì)胞分泌iNOS基因表達(dá)，分泌NO炎癥因子，使炎癥程度加重[21]。如圖6所示，相比于正常組，模型組細(xì)胞中的iNOS和IL-6 mRNA水平顯著提高（P＜0.05）；50μM、100μM和20μM的EGCG濃度均可顯著抑制iNOS與iL-6在mRNA水平上的表達(dá)。如圖7所示，10 μg/mL、30μg/mL和50 μg/mL陳年白茶可降低iNOS與IL-6 mRNA表達(dá)水平，呈劑量正相關(guān)。由此可證明陳年白茶提取物高劑量組對(duì)IL-6和iNOS mRNA水平轉(zhuǎn)錄抑制作用優(yōu)于吲哚美辛。從圖8所示，將相同濃度（10 μg/mL）的陳年白茶提取物和新白茶提取物對(duì)iNOS與IL-6 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)陳年白茶提取物和新白茶提取物均能夠顯著抑制IL-6和iNOS mRNA水平轉(zhuǎn)錄，抑制效果與陽性藥物組吲哚美辛基本一致?？赡苁前撞柚胁瓒喾?、黃酮類和咖啡堿等活性成分共同作用的結(jié)果，其有效地抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥。

圖6 EGCG對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中iNOS（A）和IL-6（B）基因相對(duì)表達(dá)的影響Fig.6 Effect of EGCG on the relative expression of iNOS（A） and IL-6（B） in RAW264.7 cells induced by LPS

圖7 陳年白茶提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中iNOS（A）和IL-6（B）基因相對(duì)表達(dá)的影響Fig.7 Effect of old white tea extract on the relative expression of iNOS（A） and IL-6（B） in RAW264.7 induced by LPS

圖8 茶提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中iNOS（A）和IL-6（B）基因相對(duì)表達(dá)的影響Fig.8 Effect of tea extract on the relative expression of iNOS （A） and IL-6（B） in RAW264.7 induced by LPS

4 結(jié)論與討論

NO作為一種生物學(xué)活性物質(zhì)，除了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)作為重要的信號(hào)傳遞物質(zhì)外，還廣泛參與了包括免疫反應(yīng)在內(nèi)的機(jī)體多系統(tǒng)的生理和病理過程[22-24]，巨噬細(xì)胞受到刺激活化時(shí)，會(huì)釋放大量的NO殺死機(jī)體內(nèi)病原微生物等來誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)以抵御外界不利因素的侵害。NO的表達(dá)是通過其上游關(guān)鍵酶iNOS來控制的。

白茶提取物中含有大量的茶多酚、氨基酸和咖啡堿等活性成分，并且通過體外實(shí)驗(yàn)或體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，都已經(jīng)被證實(shí)了可以通過抑制NF-KB通路的激活而表現(xiàn)出來一定程度的抗炎功效[3,5,16,20]。試驗(yàn)結(jié)果表明白茶提取物能夠抑制RAW264.7細(xì)胞中NO的產(chǎn)生，且具有極顯著性差異（P＜0.05），呈劑量依賴性，并且陳年白茶提取物的抑制效果優(yōu)于新白茶提取物；通過進(jìn)一步檢測(cè)白茶提取物對(duì)NO的上游關(guān)鍵酶iNOS mRNA表達(dá)和促炎因子IL-6的mRNA表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)白茶提取物能夠顯著抑制IL-6和iNOS mRNA水平轉(zhuǎn)錄，抑制效果與陽性藥物組吲哚美辛相比基本一致。

本研究表明了白茶提取物能夠抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥，且陳年白茶提取物的抑制效果優(yōu)于新白茶提取物。其中可能的原因?yàn)椋旱谝?，白茶制作工藝過程中多酚與咖啡堿的損耗較低，而咖啡堿與茶多酚能夠抑制NF-KB信號(hào)途徑的激活，下調(diào)iNOS表達(dá)[20]；第二，黃酮是抑制炎癥反應(yīng)中的重要活性物質(zhì)[25]。通過對(duì)比陳年白茶提取物與新白茶提取物生化成分發(fā)現(xiàn)，陳年白茶提取物中黃酮含量比新年白茶提取物含量高出6.03%，這與周瓊瓊等人[26]研究結(jié)果一致；第三，可能是白茶中茶多酚、黃酮類、咖啡堿等活性成分共同作用的結(jié)果；Ho等[27]研究表明，龍眼花提取物抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO是由于多酚類、黃酮類、原花青素類等共同作用的結(jié)果，而不僅僅是單一的酚類物質(zhì)。

本試驗(yàn)僅進(jìn)行體外抗炎研究，仍需進(jìn)一步的體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)NF-KB蛋白p65、NF-KB p50蛋白的表達(dá)影響等還需要進(jìn)一步研究以便開發(fā)白茶提取物的抗炎活性功效。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步探討白茶提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥的影響，發(fā)現(xiàn)白茶提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥具有一定的抑制作用，這對(duì)今后研究白茶提取物抗炎功效，為后續(xù)研究老年衰退性疾病、代謝綜合征和白茶功效研究等提供參考。