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2型糖尿病的主要發(fā)病機制是胰島素抵抗(IR)，但IR發(fā)病機制復雜多樣，目前仍未完全明確，炎癥介質(zhì)及脂肪因子可能參與IR的發(fā)生。黃連素是一種異喹啉類生物堿，從小檗屬植物黃連、黃柏根莖提取。已有研究證實，黃連素通過多種途徑改善IR，如參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減輕氧化應激、參與調(diào)節(jié)胰島素信號轉(zhuǎn)導等[1-2]。黃連素可增加能量代謝、葡萄糖耐量，改善高脂喂養(yǎng)小鼠的代謝功能[3]；能增加葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白表達水平，減輕肝臟IR[4]。黃連素通過激活腺苷酸(AMP)激酶信號傳導系統(tǒng)，減輕脂肪組織纖維化，從而減輕肥胖相關(guān)IR[5]。黃連素對IR炎癥介質(zhì)和脂肪因子分泌的影響尚不明確。本研究觀察黃連素對IR 3T3-L1脂肪細胞脂聯(lián)素、瘦素及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素6(IL-6)蛋白分泌的影響，進一步探討黃連素改善脂肪細胞IR的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞 3T3-L1前脂肪細胞株購自CTCC公司。

1.1.2 實驗試劑 DMEM高糖/無糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素購于Hyclone，1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤購于Sigma，地塞米松購于碧云天，胰島素購于諾和諾德，黃連素購于上?？稻呕び邢薰荆琁L-6及TNF-α酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑盒購于北京四正柏技術(shù)公司，葡萄糖檢測試劑盒購于北京福瑞生物技術(shù)公司，瘦素抗體及脂聯(lián)素抗體購于武漢博士德公司，β-actin抗體、BCA蛋白檢測試劑盒購于Santa Cruz，Marker購于AMRESCO，抗兔二抗購于碧云天，其他化學試劑均為分析純。

1.1.3 實驗儀器 全自動酶標儀MK3、垂直電泳裝置、半干式轉(zhuǎn)印儀(美國Bio-Rad公司)，Image Tool 3.0全自動圖像分析系統(tǒng)(Olympus公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂肪細胞培養(yǎng)及誘導分化 37 ℃、5% CO2條件下，3T3-L1前脂肪細胞于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細胞狀態(tài)良好時接種于培養(yǎng)板，待細胞融合后，加入含1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤0.5 mmol/L、地塞米松1 μmol/L、胰島素10 μg/mL、10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，更換含胰島素10 μg/mL培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h，之后以10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔48 h換培養(yǎng)液1次，誘導分化8～12 d，待90%以上呈脂肪細胞表型即可用于實驗。經(jīng)1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤、地塞米松、胰島素誘導分化8～12 d后，細胞變圓、變亮，細胞質(zhì)中大量圓形脂肪滴聚集，且90%以上呈脂肪細胞表型，為成熟的3T3-L1脂肪細胞。

1.2.2 3T3-L1脂肪細胞IR模型建立 將細胞分組處理，更換含地塞米松10 μmol/L的DMEM無糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，誘導IR，取上清液，之后更換DMEM高糖培養(yǎng)基，并加入胰島素100 μg/mL繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取上清液。正常狀態(tài)下3T3-L1脂肪細胞經(jīng)胰島素刺激后，葡萄糖消耗量顯著增加，經(jīng)地塞米松誘導后，加入胰島素，與對照組比較葡萄糖消耗量減少，說明細胞出現(xiàn)IR，提示造模成功。

1.2.3 實驗分組 將實驗細胞分為對照組、IR組和黃連素組。其中對照組正常培養(yǎng)，IR組和黃連素組按照1.2.2誘導細胞發(fā)生IR，黃連素組同時加入黃連素20 μmol/L。

1.2.4 葡萄糖消耗量測定 分別測定地塞米松誘導前后和胰島素加入前后細胞上清液中葡萄糖含量。

1.2.5 免疫印跡試驗檢測脂聯(lián)素、瘦素蛋白表達情況 使用細胞裂解液裂解細胞后提取總蛋白，根據(jù)BCA試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)整上樣量。取蛋白50 μg進行蛋白變性后，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離，轉(zhuǎn)膜，含5%脫脂奶粉的封閉液封閉2 h，4 ℃搖床一抗孵育過夜。磷酸緩沖鹽溶液洗滌后加入二抗，室溫下?lián)u床孵育2 h，充分洗滌，ECL顯色。定影后應用凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。通過圖像分析軟件讀取所測蛋白灰度值，將所得灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值比值作為相應蛋白的相對表達量，進行半定量分析。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附實驗方法檢測TNF-α、IL-6濃度 收集各組細胞上清液，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2 結(jié) 果

2.1 3組葡萄糖消耗量比較(見表1)

與對照組比較，1)P<0.05；與IR組比較，2)P<0.05

2.2 脂聯(lián)素和瘦素蛋白表達量測定 結(jié)果顯示：細胞形成IR后，脂聯(lián)素分泌減少，瘦素分泌增加；加入黃連素后，脂聯(lián)素分泌增加，瘦素分泌減少，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖1、表2。

圖1 3組脂聯(lián)素和瘦素蛋白表達

表2 3組脂聯(lián)素、瘦素蛋白灰度值比較(±s)

與對照組比較，1)P<0.05；與IR組比較，2)P<0.05

2.3 3組TNF-α和IL-6水平比較 細胞形成IR后，TNF-α、IL-6蛋白分泌明顯增加；加入黃連素后，TNF-α、IL-6蛋白分泌減少，仍顯著高于對照組(P<0.05)。詳見表3。

表3 3組TNF-α和IL-6水平比較(±s) ng/L

與對照組比較，1)P<0.05；與IR組比較，2)P<0.05

3 討 論

目前研究表明，脂肪組織是一個重要的內(nèi)分泌器官，可分泌多種生物活性物質(zhì)，包括瘦素、脂聯(lián)素、TNF-α、IL-6等多種脂肪因子和炎癥因子，這些因子通過自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌途徑參與各種復雜代謝過程，形成復雜的脂肪細胞因子網(wǎng)絡(luò)，在糖脂代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

脂聯(lián)素是脂肪組織分泌的一種分子量為28 kD的凝膠結(jié)合蛋白，具有改善IR、促進葡萄糖攝取、抑制內(nèi)皮細胞炎癥等作用。有研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素水平與IR程度呈負相關(guān)，脂聯(lián)素水平升高可增加胰島素敏感性，IR減輕，反之，脂聯(lián)素水平降低則IR加重[6-7]。瘦素作為一種代謝激素，除影響脂肪的分解、合成外，還可影響胰島素釋放及葡萄糖代謝[8]。有研究表明，血清瘦素作為一種糖尿病病人的早期生化標志物，與IR密切相關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，IR組脂聯(lián)素水平降低，瘦素水平升高，表明脂聯(lián)素與瘦素參與IR的發(fā)生。進一步研究結(jié)果證實，給予黃連素干預后，脂肪細胞脂聯(lián)素水平升高，瘦素水平降低，提示黃連素通過影響脂聯(lián)素和瘦素水平進而改善IR。

既往研究顯示，在IR發(fā)生過程中，有免疫細胞、炎性介質(zhì)參與，其中較重要的因子有TNF-α、IL-6[10]。本研究結(jié)果顯示，IR組TNF-α、IL-6水平較對照組升高，提示TNF-α、IL-6參與IR過程。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可抑制胰島素受體與底物結(jié)合，增加外周游離脂肪酸濃度，引起脂質(zhì)代謝紊亂，降低葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-4含量，進一步降低脂肪細胞攝取葡萄糖能力[11-12]；TNF-α可促進炎癥細胞分泌多種炎癥因子，包括IL-6，抑制脂聯(lián)素產(chǎn)生[13]。IL-6作為重要的炎癥因子，具有加重IR作用。糖尿病病人IL-6水平升高[14-15]；肥胖病人常同時存在IR，機體內(nèi)存在低水平慢性炎癥，IL-6水平升高[16]。IL-6可抑制胰島素受體底物磷酸化、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)及蛋白激酶B(AKT)激活，進而影響下游一系列的級聯(lián)反應，抑制胰島素信號傳導系統(tǒng)，降低胰島素敏感性，參與IR的發(fā)生[17-18]；同時IL-6能促進脂肪分解，增加外周游離脂肪酸，誘發(fā)脂代謝紊亂，間接誘導IR[19]。本研究結(jié)果顯示，應用黃連素干預后，TNF-α、IL-6分泌減少，表明黃連素可能促進IR狀態(tài)下脂肪細胞TNF-α、IL-6分泌減少，從而發(fā)揮改善IR作用。

綜上所述，黃連素可能通過增加脂聯(lián)素蛋白表達，降低瘦素和TNF-α、IL-6蛋白水平，從而改善高胰島素血癥。對IR的臨床治療具有重要的指導意義，但仍需對其作用的分子機制進行深入探討。