，，，，，

有研究證實，腸道微生物的組成和數(shù)量改變與高血壓的發(fā)生發(fā)展具有明確的相關(guān)性[1-4]。經(jīng)16SV4區(qū)擴(kuò)增子HiSeq2500 PE250測序，老齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)腸道微生物物種類型降低，厚壁菌和擬桿菌比率增加等[5]。已有部分研究機(jī)構(gòu)有關(guān)于調(diào)節(jié)腸道微生物組調(diào)節(jié)高血壓、糖尿病等代謝相關(guān)性疾病報道[6-10]，但各種藥物對腸道微生物組影響不明確，調(diào)控腸道微生物組有望成為高血壓等心血管疾病的潛在治療靶點(diǎn)。中藥對腸道微生物組的影響近年備受關(guān)注。補(bǔ)腎和脈方對眩暈病(原發(fā)性高血壓)的治療療效顯著[11-14]，對老年單純收縮期高血壓效果尤其顯著，可明顯改善降壓過程因脈壓過大造成的組織器官低灌注損傷[15-17]。但作為中藥復(fù)方，其藥理機(jī)制作用靶點(diǎn)尚不明確。本研究觀察補(bǔ)腎和脈方對自發(fā)性高血壓大鼠腸道微生物組的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 9月齡雄性SPF級SHR 13只，由北京維通利華實驗動物中心提供[許可證號：SCXK(京)2012-0001]，SHR初始血壓均已到達(dá)高血壓平臺期，體質(zhì)量250～300 g。所有動物均于正式實驗前適應(yīng)性測壓訓(xùn)練2周(觀察適應(yīng)期)，即每日進(jìn)行3次測壓，8～10 d后大鼠適應(yīng)測壓環(huán)境，測壓時保持安靜；第2周末測量大鼠血壓及體質(zhì)量，記為基礎(chǔ)血壓及基礎(chǔ)體質(zhì)量。待大鼠適應(yīng)環(huán)境后，每周監(jiān)測體質(zhì)量、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、平均動脈壓(MAP)、脈壓(PP)。

補(bǔ)腎和脈顆粒(魯藥制字Z20120014)組方：黃芪、黃精、桑寄生、女貞子、牛膝等11味按比例配伍，每包3 g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房提供，以蒸餾水稀釋成含生藥2.5 g/mL的混懸藥液。

MRBP10通道大小鼠尾動脈血壓監(jiān)測儀，美國IITC公司產(chǎn)品；ME235P電子分析天平，德國賽多利斯產(chǎn)品；梅特勒-托利多DELTA320型pH計，瑞士梅特勒—托利多公司產(chǎn)品；Cascada I超純水系統(tǒng)，美國PALL公司；5424R型高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及干預(yù) 將SHR大鼠隨機(jī)分為補(bǔ)腎和脈方組(6只)和SHR模型組(7只)，補(bǔ)腎和脈方組每日灌胃給藥補(bǔ)腎和脈顆?；鞈乙? mL/100 g體質(zhì)量(含生藥2.5 g/mL)；SHR模型組每日給予等量生理鹽水。各組動物于每晚19:00灌胃給藥1次，每周用藥6 d，連續(xù)8周。每周將大鼠裝入測量盒內(nèi)，以電子天平測量體質(zhì)量，精確到0.2 g，根據(jù)變化隨時調(diào)整給藥量。

1.2.2 血壓測量方法 采用大鼠尾動脈加壓法，測量時尾部加溫至32 ℃，波形穩(wěn)定后，測量SBP、DBP、MAP、PP。固定在每周五、周六、周日14:30～17:30連續(xù)測壓(當(dāng)日灌胃之前)，由固定專人按照同樣測量順序，每日重復(fù)測量3次血壓，每次間隔1 min。連續(xù)3 d測量血壓基礎(chǔ)上，取第2天和第3天平均值作為所在周的血壓值。實驗開始給藥前一天，測量3次血壓，取平均值作為用藥前基礎(chǔ)數(shù)值。第1次給藥當(dāng)天記作第0天，次日記作第1天，以此類推；連續(xù)給藥的實驗數(shù)據(jù)均為給藥24 h及其之后血壓值。

1.2.3 腸道微生物組分析 取末次用藥24 h后大鼠應(yīng)激糞便為糞便樣品置于無菌離心管中，置于-80 ℃保存。大鼠糞便樣品DNA提取和16S V4區(qū)擴(kuò)增子信息采集與分析，委托北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行(合同編號：V01C101SC17020776)。根據(jù)所擴(kuò)增的16S區(qū)域特點(diǎn)，基于Illumina HiSeq測序平臺，利用雙末端測序(Paired-End)的方法，構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行雙末端測序。通過對讀數(shù)(Reads)拼接過濾，操作分?jǐn)?shù)單位(Operational Taxonomic Units，OTUs)聚類，并進(jìn)行物種注釋及豐度分析，揭示樣品物種構(gòu)成；進(jìn)一步的α多樣性分析(Alpha diversity)、β多樣性分析(Beta diversity)挖掘樣品之間的差異。

2 結(jié) 果

2.1 兩組血壓比較 灌胃給藥8周后，與SHR模型組比較，補(bǔ)腎和脈方組SBP、DBP、MAP、PP均明顯下降(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組血壓比較(±s) mmHg

與SHR模型組比較，1)P<0.05

2.2 對大鼠腸道微生物組的影響

2.2.1 OTU聚類 通過OTU聚類可見，用藥后補(bǔ)腎和脈方組與SHR組樣品物種構(gòu)成存在明顯差異。詳見圖1～圖3。

圖1 SHR屬(Genus)水平上的優(yōu)勢物種相對豐度的GraPhlAn圖

圖2 補(bǔ)腎和脈方屬(Genus)水平上的優(yōu)勢物種相對豐度GraPhlAn圖

圖3 物種豐度聚類熱圖(heatmap)

2.2.2 α多樣性分析 通過7種不同的Alpha多樣性指數(shù)的計算結(jié)果對樣品內(nèi)物種豐度和均一性進(jìn)行評估。各項指數(shù)均表明，用藥后補(bǔ)腎和脈方組腸道微生物組多樣性與SHR組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。補(bǔ)腎和脈方組物種累積箱形圖位置表現(xiàn)為急劇上升，提示群落中有大量物種被發(fā)現(xiàn)。詳見圖4。

表2 α多樣性分析指數(shù)統(tǒng)計

與SHR模型組比較，1)P<0.05

圖4 物種累積箱形圖

2.2.3 β多樣性分析 主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)、主成分分析(principal component analysis，PCA)、無度量多維標(biāo)定法(non-metric multi-dimensional scaling，NMDS)統(tǒng)計結(jié)果均說明：補(bǔ)腎和脈方組與SHR模型組樣品距離遠(yuǎn)，群落差異大。詳見圖5～圖7。

2.2.4 厚壁菌與擬桿菌比率 厚壁菌門(F)和擬桿菌門(B)比例稱為F/B比率，可作為評估病理狀態(tài)的生物標(biāo)志物。有研究發(fā)現(xiàn)，SHR大鼠F/B比率是WK大鼠的5倍左右，且使用米諾環(huán)素治療能顯著降低F/B值，使高血壓狀態(tài)得到改善[18-19]。本實驗根據(jù)門水平物種相對豐度計算得知，與SHR模型組相比，補(bǔ)腎和脈方組厚壁菌與擬桿菌比率明顯降低。詳見圖8。

2.2.5 共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)圖(network)分析 各個微生物群落之間的關(guān)系見圖9。

3 討 論

補(bǔ)腎和脈方中黃芪、桑寄生等益精填髓、補(bǔ)腎通絡(luò)，共為君藥；臣以黃精、女貞子等藥滋補(bǔ)肝腎；佐以牛膝等藥引血通絡(luò)。諸藥合用，共奏補(bǔ)腎氣、和血脈之功。整體觀念是中醫(yī)學(xué)理論體系的主要特點(diǎn)之一，其中強(qiáng)調(diào)人與自然環(huán)境的統(tǒng)一性，人體作為一個有機(jī)整體，生成并存在于自然界這一大的生態(tài)系統(tǒng)中。正如《素問·寶命全形論》曰：“夫人生于地，懸命于天，天地合氣，命之曰人”“人以天地之氣生，四時之法成”。人體生命過程受到大自然的規(guī)定和影響，自然環(huán)境的各種變化對人體的生理、病理以及疾病防治都會產(chǎn)生直接或間接的影響。此《靈樞·邪客》之所謂：“人與天地相應(yīng)也?！彪S著微生態(tài)學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，逐漸認(rèn)識到自然界中的細(xì)菌等微生物廣泛存在于人體內(nèi)部，特別是腸道中，腸道微生物組已形成一種存在于人體內(nèi)部的微生態(tài)系統(tǒng)。并且發(fā)現(xiàn)腸道微生物組的平衡與宿主的健康和疾病之間有密切關(guān)系，腸道微生態(tài)系統(tǒng)的失衡引起包括高血壓、糖尿病、腫瘤、卒中等各種疾病。因此，將這看作是人與自然相統(tǒng)一的另一種表現(xiàn)形式，人體受到外部大生態(tài)系統(tǒng)的影響，同樣會受到內(nèi)部微生態(tài)系統(tǒng)的影響。因此，有學(xué)者提出腸道微生物組可能是中藥治療疾病的潛在靶點(diǎn)。有研究指出，腸道微生物組失調(diào)與高血壓危險因素有關(guān)，如膽固醇、動脈硬化與腸道微生物組，糖尿病與腸道微生物組，肥胖、代謝綜合征與腸道微生物組，腸道微生物組可能為高血壓發(fā)病的環(huán)境因素[20]。已有大量研究證實，中藥復(fù)方制劑可分別從健脾、補(bǔ)益、清熱、化濕、瀉下、消食、理氣等方面直接或間接地對腸道微生態(tài)起到不同程度的調(diào)節(jié)作用,改善腸道微生物組失調(diào)，較好地保護(hù)腸道微生態(tài)的平衡[21]。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎和脈方不僅能降低SHR血壓，而且對SHR腸道微生物組有明顯改善作用。補(bǔ)腎和脈方顯著降低F/B比率，F(xiàn)/B比率是已知公認(rèn)評估高血壓病理狀態(tài)的生物標(biāo)志物[6]，F(xiàn)/B比率降低可能是SHR大鼠血壓和全身狀況改善的機(jī)制之一，因此，推測對腸道微生物組的調(diào)節(jié)是補(bǔ)腎和脈方的藥理作用靶點(diǎn)之一。這為研究補(bǔ)腎和脈方及其他中藥方劑、中成藥制劑的降壓機(jī)制提供了新思路。腸道微生物組與高血壓關(guān)系的研究尚且處于初始階段，面臨較多的困難與挑戰(zhàn)，一方面研究方法不足；另一方面，腸道微生物組與人體關(guān)系復(fù)雜，研究其與高血壓作用關(guān)系時混雜因素太多，如飲食、運(yùn)動、其他藥物、心理因素等。除改善F/B比率外，本研究發(fā)現(xiàn)用藥后SHR腸道微生物組存在其他多角度、多方向變化，但其具體原因與對高血壓的影響尚須進(jìn)一步研究進(jìn)行探討，這也將是下一步的重點(diǎn)研究方向。本研究結(jié)果進(jìn)一步揭示中藥復(fù)方與腸道微生物組及高血壓之間的作用關(guān)系，有助于加快中藥現(xiàn)代化進(jìn)程，對臨床中藥及中西藥合用治療有一定的指導(dǎo)意義。

圖5 群落相似度PCoA圖

圖6 群落相似度PCA圖

圖7 組間差異NMDS分析圖

圖8 兩組F/B比率比較

圖9 共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)圖