陳圳煒， 曾海鷗， 袁麗萍， 何東玲， 唐海容， 伍強(qiáng)， 楊鐵城

中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院腎內(nèi)科(廣東深圳 518000)

由劉志紅院士牽頭目前國內(nèi)最大的對(duì)血管鈣化(vascular calcification, VC)多中心研究顯示，透析患者VC發(fā)生率為77.4%[1]，VC會(huì)增加患者心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和增加患者全因死亡風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)患者VC的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，VC目前認(rèn)為是一個(gè)主動(dòng)的過程，中心環(huán)節(jié)是血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)凋亡和囊泡形成并轉(zhuǎn)分化為成骨樣細(xì)胞，這些細(xì)胞可以誘導(dǎo)基質(zhì)形成并引起局部的礦化的啟動(dòng)[4]。流行病學(xué)和臨床資料發(fā)現(xiàn)CKD患者發(fā)生VC和導(dǎo)致CVD的危險(xiǎn)因素既包括糖尿病、性別、高血壓、血脂異常、年齡、吸煙等傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素，也包括透析時(shí)間、鈣磷代謝異常、甲狀旁腺功能亢進(jìn)、炎癥狀態(tài)、氧化應(yīng)激等CKD特征性危險(xiǎn)因素[5]。這些危險(xiǎn)因素在一定作用下導(dǎo)致VSMC轉(zhuǎn)分化為成骨樣細(xì)胞，從而啟動(dòng)組織的礦化過程[6]。終末期腎臟病(end-stage renal disease, ESRD)患者行動(dòng)靜脈內(nèi)瘺(arteriovenous fistula, AVF)成形術(shù)，術(shù)中我們可以獲得橈動(dòng)脈殘端，通過鈣化染色我們可以判斷有無橈動(dòng)脈鈣化(radial arterial calcification, RAC)。我們既往研究發(fā)現(xiàn)RAC與血液透析(hemodialysis, HD)時(shí)間>5年及糖尿病相關(guān)[7]，但并未對(duì)不同HD及糖尿病亞組人群RAC特點(diǎn)進(jìn)行細(xì)化分析，因此，本課題繼續(xù)對(duì)ESRD患者AVF成形術(shù)獲取的吻合口處的橈動(dòng)脈殘端進(jìn)行鈣化染色，判斷有無吻合口處RAC，觀察不同HD及糖尿病亞組人群的RAC臨床特點(diǎn)，并對(duì)可能的機(jī)制進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 廣東省深圳市血液凈化中心2014年1月至2016年1月行自體AVF成形術(shù)的ESRD患者。排除采用移植血管者；尿毒癥合并腫瘤行HD的患者；腎移植術(shù)后，移植腎失功，行HD的患者；腹膜透析患者。研究獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 鈣化判斷 橈動(dòng)脈標(biāo)本取自手術(shù)中對(duì)橈動(dòng)脈的修剪，用10%中性甲醛溶液固定24 h后石臘包埋，采用茜素紅S法對(duì)動(dòng)脈進(jìn)行鈣化染色，通過光學(xué)顯微鏡判斷有無鈣化，陽性為紅色嗜堿性沉積物。

1.3 分組標(biāo)準(zhǔn) (1)根據(jù)有無血管鈣化將血管標(biāo)本分無鈣化組及鈣化組。(2)根據(jù)是否行HD分HD組及非HD組。(3)根據(jù)HD時(shí)間是否≥5年分HD≥5年組及HD<5年組。(4)根據(jù)是否合并糖尿病分糖尿病組及非糖尿病組。(5)根據(jù)糖尿病病程是否≥15年分≥15年組及<15年組。

1.4 血液指標(biāo)檢測(cè) 應(yīng)用貝克曼庫爾特DXC800全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中鈣、磷、尿素氮、肌酐、膽固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)、三酰甘油(triglyceride, TG)，采用散射比濁法測(cè)定超敏C反應(yīng)蛋白(high sensitivity C reactive protein, hs-CRP)，采用庫爾特電阻抗法測(cè)定糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin, HbA1C)，采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清中全段甲狀旁腺激素(intact parathyroid hormone, iPTH)。同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)采用循環(huán)酶法測(cè)定(正常值5～15 μmol/L)。計(jì)算校正血鈣，公式為: 校正血鈣(mmol/L)=測(cè)定血鈣(mmol/L)+[40-血白蛋白(g/L)]×0.025。計(jì)算鈣磷乘積(mg2/dL2)=校正血鈣(mg/dL)×血磷(mg/dL)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以M(P25,P75)表示。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，兩組比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料，對(duì)其進(jìn)行正態(tài)轉(zhuǎn)換進(jìn)行參數(shù)檢驗(yàn)，或采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法；采用多因素logistic回歸分析方法建立RAC的回歸方程。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 180例行自體AVF成形術(shù)的ESRD患者基本情況詳見表1。原發(fā)病為慢性腎小球腎炎83例，糖尿病腎病50例，高血壓腎損害19例，多囊腎8例，梗阻性腎病8例，狼瘡性腎炎4例，其他8例。

2.2 組織學(xué)特點(diǎn) 茜素紅S染色結(jié)果顯示：180例ESRD患者中38例發(fā)現(xiàn)鈣化，發(fā)生率為21.1%。在橈動(dòng)脈沉積的鈣鹽，表現(xiàn)為紅色嗜堿性沉積物，隨著鈣化程度的加重，紅色嗜堿性沉積物逐漸增多。鈣鹽在橈動(dòng)脈沉積主要發(fā)生在血管中膜，38例RAC中動(dòng)脈中膜鈣化(arterial medial calcification,AMC)占37例，僅1例動(dòng)脈內(nèi)膜鈣化(arterial intimal calcification,AIC)，外膜鈣化未檢出。同時(shí)我們?cè)诖蟛糠謽飫?dòng)脈亦發(fā)現(xiàn)了不同程度的動(dòng)脈內(nèi)膜增生。見圖1。

A：動(dòng)脈內(nèi)膜增厚無鈣鹽沉積；B：動(dòng)脈中膜輕度鈣化；C：動(dòng)脈中膜中度鈣化；D：動(dòng)脈中膜重度鈣化

2.3 鈣化組與非鈣化組的臨床資料比較 180例ESRD行AVF的患者中38例來自鈣化組，142例來自非鈣化組。鈣化組與非鈣化組觀察項(xiàng)目比較結(jié)果見表1。鈣化組HD時(shí)間≥5年占比、糖尿病發(fā)病率、HbA1C較非鈣化組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 鈣化組和非鈣化組臨床資料比較 M(P25, P75)

2.4 RAC危險(xiǎn)因素的logistic回歸分析 以有無RAC為因變量，模型1納入HD時(shí)間≥5年、糖尿病、HbA1C為自變量，模型2納入年齡、吸煙、HD時(shí)間≥5年、糖尿病、HbA1C、TG、TC、LDL、hs-CRP、服用鈣劑、服用活性維生素D、甲狀旁腺激素、校正血鈣、血磷、鈣磷乘積為自變量，多因素logistic 回歸分析結(jié)果顯示，HD時(shí)間≥5年、糖尿病是ESRD患者發(fā)生AVF吻合口處RAC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表2。

表2 RAC影響因素的logistic回歸分析

2.5 HD對(duì)ESRD患者影響 180例ESRD患者中160例來自HD組，20例來自非透析組，HD組與非透析組觀察項(xiàng)目比較結(jié)果見表3。從表3可看出HD組血紅蛋白、尿素氮、hs-CRP、校正血鈣較非透析組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。180例ESRD患者中148例來自HD<5年組，32例來自HD≥5年組，HD<5年及HD≥5年觀察項(xiàng)目比較結(jié)果見表3。從表3可看出HD≥5年組糖尿病、RAC、血紅蛋白、血肌酐、服用鈣劑、iPTH、校正血鈣、血磷、鈣磷乘積較HD<5年組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.6 糖尿病對(duì)ESRD患者影響 180例ESRD患者中62例來自糖尿病組，118例來自非糖尿病組。糖尿病組HD時(shí)間≥5年比率、RAC、年齡、收縮壓、舒張壓、TG、白蛋白、HbA1C、血磷較非糖尿病組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。62例糖尿病ESRD患者中40例糖尿病<15年，22例糖尿病≥15年。糖尿病≥15年組RAC、年齡較糖尿病<15年組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表3 不同透析組臨床資料比較 M(P25, P75)

表4 不同糖尿病組臨床資料比較 M(P25, P75)

3 討論

據(jù)我們查閱，這可能是目前最大的通過動(dòng)脈活檢對(duì)VC檢測(cè)的臨床觀察研究，VC在ESRD患者中非常普遍，僅橈動(dòng)脈遠(yuǎn)端組織病理證實(shí)的VC發(fā)生率已達(dá)21.1%。VC可以出現(xiàn)在血管的內(nèi)膜及中膜，和炎癥相關(guān)的AIC出現(xiàn)在CKD的早期階段，而AMC即Monckeberg鈣化則出現(xiàn)在CKD的晚期階段[8]。ESRD患者VC絕大部分以AMC為主，隨著鈣化程度的加重，嗜堿性羥基磷灰石逐漸彌漫整個(gè)動(dòng)脈中膜。AIC極少發(fā)現(xiàn)，但動(dòng)脈內(nèi)膜存在不同程度的增生，這在發(fā)育成熟的AVF表現(xiàn)更加明顯，考慮可能與血流量及壓力的改變刺激動(dòng)脈內(nèi)膜的增生有關(guān)[9]。

VC是多因素在一定的時(shí)間上共同作用的結(jié)果，VSMC向成骨樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化是VC發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[10]。與我們既往研究相符[7]，本次在擴(kuò)大了入組患者后，繼續(xù)通過組織活檢證實(shí)RAC，然后分析其與VC傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素及CKD特征危險(xiǎn)因素的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)RAC仍與HD≥5年及糖尿病相關(guān)。進(jìn)一步的logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，在糾正了干擾因素后，HD時(shí)間≥5年、糖尿病是ESRD患者發(fā)生RAC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。那么HD和非透析、HD時(shí)間長短、糖尿病與非糖尿病、糖尿病病史長短患者的RAC有什么特點(diǎn)，我們以下對(duì)此進(jìn)行了進(jìn)一步的亞組分析。

HD是ESRD患者重要的治療方法，我們?cè)趤喗M分析中，通過對(duì)比HD及保守治療的ESRD患者中發(fā)現(xiàn)，HD可以改善ESRD患者貧血狀態(tài)、降低尿素氮水平、提升血鈣，但也帶來了全身的炎癥狀態(tài)的提升。血鈣的升高導(dǎo)致鈣磷沉積升高，可導(dǎo)致鈣磷沉積物被動(dòng)沉積在VSMC，從而導(dǎo)致VSMC鈣化[11]。而血管的微炎癥狀態(tài)在CKD早期即可出現(xiàn)，并且可以通過多種途徑導(dǎo)致VC的發(fā)生[12]，其中一條就是可以通過擾亂LDL受體途徑[13]。通過對(duì)比HD及保守治療組患者，我們并未發(fā)現(xiàn)其RAC有顯著差別，提示單純的啟動(dòng)HD并不是導(dǎo)致RAC的主因。

那隨著HD時(shí)間的延長，是否會(huì)有更多的導(dǎo)致VC的因素參與其中，故我們參閱了文獻(xiàn)及對(duì)比了我們既往的研究結(jié)果[14-15]，把HD時(shí)間≥5年作為一個(gè)長期透析的分界點(diǎn)。在對(duì)HD時(shí)間的亞組分析中我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HD時(shí)間≥5年，校正血鈣、血磷、鈣磷乘積、甲狀旁腺激素、服用鈣劑的比例較HD<5年明顯升高，這些結(jié)果印證了既往對(duì)ESRD患者導(dǎo)致VC的相關(guān)觀點(diǎn)[16-18]。從組織病理學(xué)角度，我們發(fā)現(xiàn)兩組患者的RAC發(fā)生率出現(xiàn)顯著差別，這給我們提示HD必須要有時(shí)間的積累才能導(dǎo)致組織學(xué)上可檢測(cè)的鈣化，而從影像學(xué)檢測(cè)的VC，也得到VC與HD時(shí)間相關(guān)的相似的結(jié)果[19]。ESRD患者在繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)導(dǎo)致的鈣磷代謝紊亂、鈣磷負(fù)荷增加(食物、醫(yī)源性藥物)、HD時(shí)穿刺及血液的渦流、亂流對(duì)血管壁的長期刺激等因素作用下[20]，經(jīng)過一定時(shí)間的積累，最終導(dǎo)致在組織病理上可檢測(cè)的RAC。

糖尿病既是ESRD的主要病因，也是CVD的主要危險(xiǎn)因素之一[21]。我們納入的ESRD患者中，糖尿病患者占34.4%，在亞組分析中，我們對(duì)比糖尿病及非糖尿病ESRD患者，發(fā)現(xiàn)糖尿病組盡管在HD時(shí)間及血磷兩個(gè)導(dǎo)致VC的因素中低于非糖尿病組，但其RAC發(fā)生率卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非糖尿病組，提示糖尿病本身就是一個(gè)很強(qiáng)的致VC因素。目前研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病導(dǎo)致VC可能與炎癥狀態(tài)、氧化應(yīng)激級(jí)骨礦物質(zhì)代謝紊亂等因素有關(guān)[22]。糖尿病組患者同時(shí)存在更高年齡、脈壓差(收縮壓減舒張壓)及TG，高齡、血脂代謝紊亂可以導(dǎo)致血管僵硬或鈣化[5]，僵硬及鈣化的血管脈壓差必然增高，且血壓更難控制。此外，患有糖尿病的ESRD患者VC程度高于非糖尿患者，因?yàn)槌薈KD的危險(xiǎn)因素外，還與糖尿病特有的內(nèi)皮功能紊亂、高脂血癥、高胰島素血癥、血糖控制欠佳、組織缺氧等因素有關(guān)[23]。最后，糖尿病患者HD≥5年的比例明顯少于非糖尿病患者，考慮這與糖尿病患者普遍年齡大，VC程度重增加CVD死亡風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。

那糖尿病的病程是否也對(duì)ESRD患者的VC有進(jìn)一步的加重作用，故我們對(duì)糖尿病的ESRD患者作進(jìn)一步的亞組分析，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)糖尿病病史≥15年即可出現(xiàn)RAC的顯著差別，且這部分患者更為年長。對(duì)于冠狀動(dòng)脈而言，結(jié)論也是相似的，糖尿病病程與冠狀動(dòng)脈的鈣化指數(shù)相關(guān)[24]。VC被看作是與年齡時(shí)間相關(guān)的礦物質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)被動(dòng)在血管沉積的一種衰退[25]，羥基磷灰石在血管沉積還要有一個(gè)時(shí)間的過程，而這體現(xiàn)在糖尿病病程及年齡方面的差異。

我們的研究尚存在一些局限性：首先，組織學(xué)活檢只能檢測(cè)一小部分動(dòng)脈，并不能像影像學(xué)對(duì)整體血管進(jìn)行評(píng)估，雖然補(bǔ)充了以影像學(xué)為基礎(chǔ)的觀察，但本研究沒有對(duì)血管進(jìn)行組織學(xué)聯(lián)合影像學(xué)對(duì)比觀察，故未來將補(bǔ)充對(duì)患者進(jìn)行聯(lián)合組織學(xué)、影像學(xué)及血清學(xué)觀察；其次，縱然是可查閱目前最大的動(dòng)脈活檢數(shù)量，大部分?jǐn)?shù)據(jù)仍呈偏態(tài)分布，提示入組數(shù)量仍不足，故將來仍需繼續(xù)擴(kuò)大樣本數(shù)量；再次，這是一個(gè)單中心的研究，未來將聯(lián)合更多中心觀察。

綜上所述，ESRD的患者存在較高的RAC率，HD時(shí)間≥5年及糖尿病是導(dǎo)致組織病理學(xué)RAC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。RAC是多方面因素在一定時(shí)間上共同作用的結(jié)果，ESRD患者HD≥5年或糖尿病病史≥15年即可出現(xiàn)明顯的組織病理學(xué)RAC。