李東陽 張遠(yuǎn)憲 歐永雄 普小云

(云南大學(xué)物理系, 昆明 650091)

將單一折射率的石英裸光纖植入由聚二甲基硅氧烷構(gòu)成的基片微流道中, 以低折射率的羅丹明B (RhB)和吡啶821 (LDS821)乙醇溶液構(gòu)成的供體和受體對作為激光增益介質(zhì). 采用沿光纖軸向消逝波抽運(yùn)方式, 首先以波長為532 nm的連續(xù)波激光器作為激勵(lì)光, 對熒光共振能量轉(zhuǎn)移特性參數(shù)進(jìn)行了研究. 然后以波長為532 nm的脈沖激光器作為抽運(yùn)光, 通過直接激勵(lì)供體分子RhB, 并將其能量轉(zhuǎn)移給臨近的受體分子LDS821,在不改變抽運(yùn)光波長的條件下, 實(shí)現(xiàn)了較低閾值(1.26 /mm2)的受體LDS821激光輻射.

1 引 言

光流控(optofluidic)激光器[1,2]是近年發(fā)展起來的一種具有廣闊前景的技術(shù), 其將光學(xué)微腔及液體增益介質(zhì)集成到微流道循環(huán)系統(tǒng)或芯片中. 由于其能夠放大由溶液濃度、折射率或生物分子構(gòu)象等變化引起的樣品信號光強(qiáng)度的微小變化, 所以,Optofluidic激光器在高靈敏度的生物技術(shù)和化學(xué)檢測方面具有極大的應(yīng)用前景[3-6]. 通常情況下,Optofluidic激光器均采用抽運(yùn)光直接激勵(lì)增益介質(zhì)(熒光染料)產(chǎn)生激光[7-9], 受抽運(yùn)光波長及染料對抽運(yùn)光吸收的限制, 需要改變抽運(yùn)光的波長與特定的染料吸收帶相配匹, 才能獲得可調(diào)諧的不同波長范圍的激光輻射. 在不改變抽運(yùn)光波長的情況下, 要獲得波長可調(diào)諧的激光輻射, 一種比較有效而新穎的方法就是借助熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)機(jī)制[10-12]. 在 FRET 機(jī)制中, 非輻射的 F?rster轉(zhuǎn)移是其中一種最重要的轉(zhuǎn)移機(jī)制[11], 即當(dāng)供體(donor, D)分子被抽運(yùn)光激發(fā)時(shí), 可通過偶極-偶極耦合作用將其一部分或全部能量以非輻射方式直接傳遞給與其比較接近(1—10 nm)的受體(acceptor, A)分子而自身不發(fā)射任何光子, 從而實(shí)現(xiàn)受體分子的受激輻射. 而且由于FRET激光器中供體的吸收帶與受體的輻射光譜之間的距離相隔較遠(yuǎn), 因此供體分子對受體分子輻射能量的吸收作用可以忽略不計(jì), 從而能有效降低受體分子的激光閾值.

1992 年, Armstrong 等[13]首次觀察到了懸浮于 F548 (激光輻射范圍: 559—589 nm)乙醇溶液中的熒光溶膠小液滴在609—654 nm范圍的激光輻射. Maslov[14]以 LD1 作為能量供體, LD703 作為能量受體, 實(shí)現(xiàn)了從黃光到近紅外光的可調(diào)諧激光輻射. Fan 研究組[15]利用 FRET 效應(yīng), 在光流控環(huán)形諧振腔 (optofluidic ring resonator, OFRR)中實(shí)現(xiàn)了以羅丹明6G染料作為能量供體, LDS722染料作為能量受體在黃光到近紅外波長范圍的激光輻射. Sun等[16]利用標(biāo)記DNA分子和染料分子間的FRET效應(yīng), 在OFRR中探測到了微摩爾濃度量級的DNA分子的激光振蕩. 雖然FRET在波長可調(diào)諧的激光輻射以及保持較低受體激光閾值方面取得了較大進(jìn)展, 但其采用的垂直于毛細(xì)管軸向的側(cè)向光抽運(yùn)方式仍存在如下三個(gè)突出不足:1)抽運(yùn)光直接穿過OFRR系統(tǒng)中的樣品, 這種強(qiáng)光的長時(shí)間照射易造成染料分子的漂白, 從而影響激光器的穩(wěn)定性; 2)側(cè)向光抽運(yùn)屬于一種非均勻抽運(yùn), 染料分子對抽運(yùn)光有強(qiáng)烈吸收作用, 其較大的吸收使得側(cè)向抽運(yùn)光在OFRR內(nèi)的空間分布是非均勻的, 由此產(chǎn)生的激光也是非均勻的, 此外染料分子的增益由抽運(yùn)光直接激勵(lì)產(chǎn)生, 不利于抽運(yùn)光和信號光的分離; 以上兩方面的不足都會(huì)引起較強(qiáng)的背景噪聲, 從而降低探測的信噪比;3)FRET能量轉(zhuǎn)移效率與供受體分子的間距(供受體濃度比)密切相關(guān), 需要手動(dòng)更換OFRR系統(tǒng)中的樣品溶液才能獲得FRET能量轉(zhuǎn)移效率, 極大地影響系統(tǒng)的穩(wěn)定性.

為了解決以上不足, 本文設(shè)計(jì)并制作了一種基于聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS,折射率1.410)的微流芯片. 首先將單一折射率的石英裸光纖(折射率1.458)植入PDMS基片微流道中, 然后在微流道中注入低折射率的染料溶液作為激光增益介質(zhì). 采用沿光纖軸向光抽運(yùn)方式, 進(jìn)入光纖端面的抽運(yùn)光以全反射(total internal reflection, TIR)方式沿光纖軸向傳播, 其消逝場延伸到包層溶液中, 并在此消逝場區(qū)域內(nèi)激勵(lì)染料分子形成激光增益. 垂直于石英光纖軸向的任一截面都構(gòu)成一個(gè)OFRR, 此圓形微腔中回音壁模式(whispering gallery mode, WGM)的消逝場和抽運(yùn)光的消逝場在增益區(qū)域內(nèi)高度重合, 受激輻射光在微腔WGM 的支持下形成激光振蕩[17]. 由于WGM激光增益由抽運(yùn)光的消逝場激勵(lì)產(chǎn)生, 從而實(shí)現(xiàn)了抽運(yùn)光和信號光的分離; 而且, 由于抽運(yùn)光的消逝場在光纖周圍是均勻的, 因此, WGM激光輻射在光纖周圍也是均勻的. 所以, 采用沿光纖軸向消逝波激勵(lì)方式, 能夠有效地降低背景噪聲的影響, 從而提高探測的信噪比和靈敏度. 同時(shí), PDMS微流芯片上的流體入口和出口分別與微型蠕動(dòng)泵相連接, 從而實(shí)現(xiàn)了微流道中溶液的循環(huán)流動(dòng)以及自動(dòng)更換, 解決了染料溶液易漂白以及由于手動(dòng)更換溶液而導(dǎo)致系統(tǒng)的穩(wěn)定性降低的問題. 在此基礎(chǔ)上, 以低折射率的羅丹明B (RhB)和吡啶821(LDS821)的乙醇混合溶液構(gòu)成的供體和受體對作為激光增益介質(zhì). 采用沿光纖軸向消逝波光激勵(lì)方式, 首先以波長為 532 nm 的連續(xù)波 (continue wave,CW)激光器作為激勵(lì)光, 對FRET特性參數(shù)進(jìn)行了研究; 在此基礎(chǔ)上, 以波長為 532 nm的脈沖激光器作為抽運(yùn)光, 在不改變抽運(yùn)光波長的條件下,利用染料分子間的FRET機(jī)制, 實(shí)現(xiàn)了較低閾值的受體LDS821激光輻射.

2 實(shí)驗(yàn)安排

2.1 PDMS芯片的設(shè)計(jì)與制作

如圖1所示, PDMS基片采用鑄模法制作而成, 其尺寸為 34 mm × 15 mm (長 × 寬). PDMS基片中光纖通道的尺寸為 34 mm × 0.2 mm ×0.2 mm (長 × 寬 × 高), 尺寸為 20 mm × 0.3 mm ×0.3 mm的微流道包含于光纖通道中. 基片由蘇州汶顥微流控有限公司生產(chǎn)制作.

圖1 PDMS 芯片結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1. Structure diagram of the PDMS chip.

為方便微流道中液體的循環(huán)流動(dòng), 需對微流道外的光纖通道與光纖的縫隙處進(jìn)行封堵, 如圖1虛線所示. 封堵過程如下: 首先, 一段長度約為 50 mm的光纖(直徑約為190, 折射率為1.458)插入到光纖通道中, 然后在光纖通道的左右兩側(cè)分別滴入一滴PDMS預(yù)聚物, PDMS預(yù)聚物通過毛細(xì)現(xiàn)象引入到光纖通道中, 當(dāng)預(yù)聚物流動(dòng)到如圖1所示的光纖通道和微流道的交界處時(shí), 用一塊PDMS模片蓋住PDMS基片表面上的入口和出口, 從而能有效阻止PDMS預(yù)聚物的流動(dòng), 在PDMS基片烘烤之前, PDMS基片兩端多余的預(yù)聚物通過吸附方式擦除掉; 接著, 將入口和出口處的PDMS膜片撕下后將PDMS基片置于烤箱中烘烤45 min,烤箱溫度為70 ℃, 由于PDMS預(yù)聚物較強(qiáng)的表面張力和黏稠性, 使得在烘烤過程中介于光纖通道和微流道界面處的PDMS預(yù)聚物界面是穩(wěn)定的.PDMS基片上流體入口和出口是兩個(gè)圓柱形的小孔 (半徑 0.15 mm, 高 0.4 mm), 由微型蠕動(dòng)泵BT100-2J進(jìn)行連接, 微流道的清洗、溶液的更換及溶液的循環(huán)流動(dòng)均通過BT100-2J完成. 在微流道中注入低于光纖折射率的增益包層介質(zhì)溶液后,就形成了光流控FRET激光PDMS芯片.

2.2 實(shí)驗(yàn)裝置

實(shí)驗(yàn)裝置如圖2所示, 以波長為 532 nm的YAG激光器(北京鐳寶公司生產(chǎn), 脈寬為7 ns)作為抽運(yùn)光. 抽運(yùn)光依次經(jīng)過分束鏡BS, 以便由激光能量計(jì) PM (MELLES GRIOT, 13PEM001)測出即時(shí)抽運(yùn)能量. 然后經(jīng)過由透鏡L1和L2構(gòu)成的光學(xué)縮束系統(tǒng)后再經(jīng)一塊焦距為75 mm的透鏡L3匯聚于光纖前端面, 焦點(diǎn)距石英光纖前端面約為2 mm, 抽運(yùn)光在光纖內(nèi)沿光纖軸向以TIR方式傳播, 其消逝場(Ep)滲透到包層溶液中, 并在此消逝場區(qū)域內(nèi)激勵(lì)染料分子產(chǎn)生激光輻射, WGM激光沿光纖表面切向輻射出來, 由導(dǎo)光光纖送至光譜采集系統(tǒng) (ICCD: PI-MAX; spectrometer: Spectrapro 500i)的進(jìn)光狹縫口. 增益介質(zhì)溶液經(jīng)微型蠕動(dòng)泵BT100-2J上的導(dǎo)管與PDMS上的流體入口和出口相連, 其流速為 1.0 mL/min.

圖2 實(shí)驗(yàn)裝置圖 BS, 分束鏡; PM, 激光能量計(jì); L1, L2,L3表示透鏡; 插圖為激光產(chǎn)生的原理圖, Ep表示 抽運(yùn)光的消逝場, Ew表示W(wǎng)GM的消逝場Fig. 2. Illustration of the experimental setup. BS, beam splite; PM, power meter; L1, L2, L3, lens. Inset: the schematic diagram of laser: Ep, evanescent field of pump light; Ew, evanescent field of WGM.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 FRET能量供體濃度的選取

實(shí)驗(yàn)中選用RhB和LDS821分別作為FRET的能量供體和能量受體. 首先測量了不同濃度的RhB (0.05, 0.10, 0.30, 0.50, 0.70, 1.00 mM, 1 M =1 mol/L)的激光閾值. 如圖 3 所示, 隨著 RhB 濃度增加, 激光閾值呈現(xiàn)出先減小后增加的趨勢, 當(dāng)c = 0.5 mM時(shí), 激光閾值達(dá)到最低. 因此, 為了實(shí)現(xiàn)低供體閾值、低供體濃度條件下高效率的基于FRET 機(jī)制的激光輻射, 本文中我們選用 c = 0.5 mM的RhB作為能量供體.

圖3 不同 RhB 濃度對應(yīng)的激光閾值, 誤差線是三次測量的平均值Fig. 3. Lasing threshold of RhB as a function of the dye concentration. Error bars are obtained with three measurements.

3.2 FRET特性參數(shù)實(shí)驗(yàn)

圖4 是濃度均為0.5 mM的RhB和LDS821的乙醇溶液(折射率1.361)的吸收和輻射光譜. 由圖可知, RhB 和 LDS821 在 542 nm 和 590 nm 處具有它們各自的吸收峰, 在580 nm和800 nm處具有各自的輻射峰; 同時(shí), RhB的輻射光譜和LDS821的吸收光譜為FRET提供了良好的光譜重疊[18], 且選用532 nm的綠色抽運(yùn)光非常有利于激發(fā)供體RhB.

圖4 歸一化吸收和輻射光譜 藍(lán)色和紫色實(shí)線分別表示RhB和LDS821的吸收光譜; 綠色和紅色實(shí)線分別表示RhB和LDS821的輻射光譜Fig. 4. Normalized absorption (blue, RhB; purple, LDS821)and emission (green, RhB; red, LDS821) spectra.

為了系統(tǒng)地表征能量轉(zhuǎn)移效率及測定供受體對之間的F?rster距離(R0)等FRET特性參數(shù),我們用微泵BT100-2J將RhB和LDS821的乙醇混合溶液通入PDMS芯片的微流道中, 以波長為532 nm 的低功率 (5 mW) CW 激光器作為激勵(lì)光, 獲得如圖 5(a) 所示的供-受體 (A/D) 對熒光輻射光譜. 如圖中藍(lán)色實(shí)線所示, 在沒有供體RhB時(shí), 由于激勵(lì)光遠(yuǎn)離受體 LDS821(濃度 c = 1.0 mM)的吸收峰且自身的熒光量子效率較低[19], 導(dǎo)致LDS821對激勵(lì)光的吸收較弱, 從而使得LDS821熒光輻射強(qiáng)度也較弱. 相反, 在沒有受體LDS821的情況下, 由于沒有發(fā)生 FRET, 供體 RhB (c =0.5 mM)對激勵(lì)光有較強(qiáng)的吸收且自身的熒光量子效率較高[19], 所以在= 580 nm 附近的熒光輻射強(qiáng)度達(dá)到最強(qiáng). 保持供體RhB濃度不變(0.5 mM),隨著受體濃度的逐漸增加, 由于FRET機(jī)制, 使得受體在= 800 nm附近的熒光輻射峰強(qiáng)度不斷增強(qiáng), 而供體RhB的熒光輻射峰強(qiáng)度逐漸減弱.圖 5(b)是 FRET效率隨受體與供體對比值(A/D)的變化關(guān)系, 由圖可知, 隨著A/D值的增加,不斷增大. 且由于受供體濃度 (0.5 mM)和受體溶解度的限制, 實(shí)驗(yàn)中, 當(dāng) A/D = 8.0/0.5 mM時(shí), 我們認(rèn)為到達(dá)最大(約為69.8%).

3.3 理論解釋

當(dāng)供體分子(RhB)吸收抽運(yùn)光的能量后被激發(fā)到更高的電子能態(tài), 在該電子回到基態(tài)前, 通過偶極子間的相互作用將其能量以非輻射方式傳遞給其鄰近的受體分子(LDS821). 由圖5(a)可知,FRET的直觀表現(xiàn)就是, 當(dāng)存在受體時(shí), 供體的熒光輻射強(qiáng)度較其單獨(dú)存在時(shí)要低得多, 而受體熒光輻射強(qiáng)度卻大大增強(qiáng).

圖5 (a) 以 RhB 和 LDS821 分別作為能量供體和能量受體的歸一化熒光輻射光譜, A/D為受體與供體濃度比值,圖中“A/D = 1.0/0 mM”表示沒有供體時(shí)受體的輻射光譜,其他值表示固定供體濃度為0.5 mM, 不同受體濃度所對應(yīng)的FRET光譜, 插圖為微流道中熒光輻射的實(shí)物圖; (b)紅色三角形是根據(jù)圖5(a)計(jì)算得到的能量轉(zhuǎn)移效率 隨A/D變化關(guān)系的實(shí)驗(yàn)值, 實(shí)線是根據(jù)(1)式得到的理論值Fig. 5. (a) Normalized fluorescence spectra of RhB (donor)and LDS821 (acceptor); A/D, acceptor to donor ratio, A/D= 1.0/0 mM was collected for 1.0 mM acceptor in the absence of donor and the other spectra were collected for a constant donor concentration of 0.5 mM and the acceptor concentration changing from 0 to 8 mM; inset, the picture of fluorescent radiation generated in the PDMS microfluidic channel; (b) the red triangle is the experimental value of the energy transfer efficiency as a function of A/D calculated from Fig. 5(a), and the solid line is the theoretical value calculted by formula (1).

式中c0表示供體強(qiáng)度下降到50%時(shí)受體分子的臨界濃度, F?rster距離 R0表示能量轉(zhuǎn)移效率=50%時(shí)的供受體對間的臨界距離. 其中c0和R0滿足[11]

式中N為阿伏伽德羅常數(shù). 由(1)式對圖5(b)所示的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合可得 c0= 8.2 mM, 對應(yīng)的受體濃度為 3.9 mM, A/D = 7.8, 即此時(shí)供受體對之間實(shí)現(xiàn)了較高效率(50%)的能量轉(zhuǎn)移. 將c0代入 (2)式可得 R0= 3.6 nm. 對于大多數(shù)供受體對,R0的范圍為1—10 nm[20], 對應(yīng)的溶液濃度范圍為—mM, 這是optofluidic染料激光器的常用濃度[21,22]. 由此可知, 本文借助于FRET機(jī)制非常有利于實(shí)現(xiàn)受體分子的WGM激光輻射. 通過對及R0等FRET特性參數(shù)的表征, 對理解下文所述的FRET激光是至關(guān)重要的.

3.4 FRET激光實(shí)驗(yàn)及討論

通過表征FRET特性參數(shù)以后, 我們利用RhB和LDS821分別作為能量供體和能量受體的FRET 激光實(shí)驗(yàn). 實(shí)驗(yàn)中, 以波長為 532 nm 的YAG脈沖激光器作為抽運(yùn)光, PDMS基片微流道中流體的流速仍為1.0 mL/min. 保持抽運(yùn)光的能量密度不變 (約為 1.45/mm2), 得到圖 6(a)所示的不同A/D值所對應(yīng)的激光光譜. 如圖所示,在沒有受體 LDS821 時(shí), RhB (c = 0.5 mM)在= 585 nm 附近具有較強(qiáng)的激光輻射峰. 隨著受體 LDS821 的加入 (A/D = 0.5/0.5 mM), 供體激光輻射強(qiáng)度降低, 同時(shí), 在波長較長的一側(cè)出現(xiàn)了較為突出的受體輻射峰 (797, 822, 828 nm), 表明在這些波長處首先達(dá)到了受體的激光閾值. 然而,由于實(shí)驗(yàn)中采用的是密度g = 150 g/mm的低分辨率光柵, 導(dǎo)致激光輻射峰不能完全被分辨. 圖7是采用中等分辨率 (g = 1200 g/mm)的光柵所采集的不同A/D值對應(yīng)的RhB在578—592 nm波長范圍以及LDS821在810—838 nm波長范圍的激光光譜. 由圖可知, 隨著A/D值的進(jìn)一步增加,由于FRET效應(yīng), 供體激光從逐漸減弱到完全淬滅 (A/D = 8/0.5 mM), 而受體激光輻射強(qiáng)度從逐漸增強(qiáng)到最強(qiáng).

圖6(b)是在沒有受體時(shí) RhB (c = 0.5 mM)在= 585 nm處的激光閾值及供體激光輻射完全淬滅 (A/D = 8/0.5 mM)時(shí)受體 LDS821 在=822 nm處的激光閾值. 由圖可知RhB和LDS821的激光閾值分別為0.48/mm2和1.26/mm2.可見, 由于RhB較高的熒光量子效率以及對532 nm抽運(yùn)光較大的吸收, 使得RhB即使在較低的溶液濃度條件下同樣表現(xiàn)出較低的激光閾值. 作為對比, 我們測量了在沒有供體RhB時(shí), 濃度為8 mM 的受體 LDS821 在= 822 nm 處的激光閾值, 由圖 6(b)可得激光閾值為 1.69/mm2, 遠(yuǎn)大于 A/D = 8/0.5 mM時(shí) LDS821的激光閾值1.26/mm2. 說明由于 LDS821 較低的熒光量子效率以及對532 nm抽運(yùn)光較弱的吸收, 即使在較高的溶液濃度條件下激光閾值仍然較高. 因此, 我們利用RhB較低的激光閾值特性以及RhB的輻射光譜和LDS821的吸收光譜的良好重疊特性, 借助于兩種分子間的FRET機(jī)制, 實(shí)現(xiàn)了較低閾值的受體LDS821的激光輻射.

圖6 (a)不同 A/D 值對應(yīng)的低等分辨率 (光柵密度 g =150 g/mm)的 FRET 激光光譜, 供體濃度保持 0.5 mM 不變; (b)激光輻射峰強(qiáng)度隨抽運(yùn)光能量密度的變化關(guān)系; 供體峰值為 585 nm, 閾值約為 0.48 /mm2; A/D = 8/0.5 mM和 A/D = 8/0 mM 的 LDS821 的峰值均為 822 nm, 其閾值分別為 1.26 /mm2和 1.69 /mm2Fig. 6. (a) Low resolution (grating density = 150 g/mm)FRET lasing spectra for various A/D values, the donor concentration is fixed at 0.5 mM; (b) lasing peak intensity vs. pump energy density. The donor peak is at 585 nm and its lasing threshold is approximately 0.48 /mm2. The peaks of LDS821 for A/D = 8/0.5 mM and A/D = 8/0 mM are at 822 nm and their lasing threshold is approximately 1.26 /mm2 and 1.69 /mm2, respetively.

圖7 不同 A/D 值對應(yīng)的中等分辨率 (光柵密度 g = 1200 g/mm)的激光光譜 光譜圖從上到下分別對應(yīng) A/D = 0/0.5, 0.5/0.5,1/0.5, 4/0.5, 8/0.5 mM; (a) RhB(供體) 的激光光譜; (b) LDS821(受體) 的激光光譜Fig. 7. Medium resolution (grating density = 1200 g/mm) lasing spectra for various A/D values. The spectra correspond to A/D =0/0.5, 0.5/0.5, 1/0.5, 4/0.5, 8/0.5 mM from top to bottom: (a) Lasing spectra of RhB (donor); (b) lasing spectra of LDS821(acceptor).

4 結(jié) 論

本文設(shè)計(jì)并制作了一種基于PDMS的微流芯片. 利用該芯片實(shí)現(xiàn)了微流道中溶液的循環(huán)流動(dòng)以及自動(dòng)更換, 解決了染料溶液易漂白以及由于手動(dòng)更換溶液而導(dǎo)致系統(tǒng)的穩(wěn)定性降低的問題. 在此基礎(chǔ)上, 采用沿光纖軸向消逝波光抽運(yùn)方式, 利用RhB較低的激光閾值以及RhB的輻射光譜和LDS821的吸收光譜的良好重疊特性, 在不改變抽運(yùn)光波長的條件下, 借助于兩種分子間的FRET機(jī)制, 實(shí)現(xiàn)了較低閾值的受體LDS821的激光輻射. 本文所述的光流控FRET激光可為芯片上的實(shí)驗(yàn)室提供一種波長可調(diào)諧的低閾值激光光源, 在生物技術(shù)[23]及化學(xué)分析[24]等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值.