靳玉瑞，李愛秀，張 力

(中國人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院基礎(chǔ)部數(shù)理教研室，天津 300309)

0 前言

PET是一種被廣泛應(yīng)用的高分子芳香族聚酯，由取自原油的對(duì)苯二甲酸(TPA)和乙二醇(EG)這2種單體通過酯鍵相連構(gòu)成[1]。PET具有優(yōu)良的綜合性能，如質(zhì)輕、強(qiáng)度大、耐高低溫、耐化學(xué)腐蝕、絕緣性好、透明度高等，其產(chǎn)品包括纖維級(jí)PET和非纖維級(jí)PET(如瓶類、薄膜和工程塑料等)，前者被應(yīng)用于紡織業(yè)等，后者主要被應(yīng)用于包裝、電子電氣、建筑、汽車等領(lǐng)域，其中包裝是PET最大的非纖應(yīng)用市場，也是增速最快的領(lǐng)域。PET可單獨(dú)作為軟包裝材料，目前大部分瓶裝水、軟飲料都使用PET進(jìn)行灌裝；PET還能與鋁、氧化硅或納米材料等復(fù)合以改善強(qiáng)度、阻隔性或微波透過性等，使其在食品、藥品、化妝品和日用化學(xué)品包裝等領(lǐng)域，得到更廣泛的應(yīng)用。除民用以外，以PET為基材研制的多功能復(fù)合材料，還可用于軍用裝備元件的制造以及軍工產(chǎn)品的包裝等，如PET復(fù)合材料被用于火工品、引信、火炸藥等的內(nèi)包裝，以及武器裝備尤其是大型、復(fù)雜武器裝備系統(tǒng)的封套包裝[2-4]。PET改性材料，因具有防靜電、防電磁、阻燃和高阻隔等功能，能有效保護(hù)軍工產(chǎn)品在儲(chǔ)存和運(yùn)輸中的性能和安全。

2010年,我國 的PET 產(chǎn)量已達(dá) 29 000 kt，成為世界上最大的 PET 生產(chǎn)國和消費(fèi)國。調(diào)查表明，PET 的消費(fèi)量增長迅速，與此同時(shí)也產(chǎn)生了大量的 PET廢棄物，特別是PET包裝材料在使用后幾乎都成為廢料。PET作為一種芳香族聚酯，化學(xué)惰性強(qiáng)，且生物難降解，其廢棄物的積累給環(huán)境和生態(tài)帶來了嚴(yán)峻的壓力[5-6]。部隊(duì)在執(zhí)行搶險(xiǎn)救災(zāi)、海上維權(quán)等任務(wù)時(shí)，通常要攜帶大量物資前行，包括包裝食品、飲用水及武器裝備等，因此也將產(chǎn)生大量的PET廢棄物。如何經(jīng)濟(jì)環(huán)保地處理這些PET廢料，是軍地都急需解決的問題，故需要集合各方的技術(shù)和資源優(yōu)勢(shì)，通過深入融合共同探索解決方案。

近年來，生物降解法因兼具經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境友好性，利用此類方法處理塑料廢棄物成為一個(gè)重要的研究方向[7-8]。目前已發(fā)現(xiàn)一些能夠降解PET的生物酶(如角質(zhì)酶和脂肪酶等)，但這些酶并非以PET為主要底物，且酶降解效率尚不能達(dá)到工業(yè)化的要求。2016年，Yoshida等[9]發(fā)現(xiàn)了一種將PET作為主要能量和碳源的細(xì)菌Ideonellasakaiensis201-F6，并分離到對(duì)PET降解起關(guān)鍵作用的水解酶PETase。該酶是目前對(duì)PET降解活性和底物專屬性最強(qiáng)的酶，這引起研究者們的極大興趣。在對(duì)PETase的研究中，解析其突出的PET降解活性需基于對(duì)其結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制的深刻理解。本文主要介紹了PETase的降解活性及相關(guān)影響因素，對(duì)PETase的晶體結(jié)構(gòu)信息、底物結(jié)合模式和催化降解機(jī)制進(jìn)行了總結(jié)，重點(diǎn)闡述了該酶發(fā)揮突出降解活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征，并對(duì)PETase生物降解的研究方向進(jìn)行了展望。

1 PET的處理

目前對(duì)PET廢棄物的處理方法有填埋、焚燒和回收利用等。焚燒法是通過專用的焚燒爐燒掉廢舊塑料，在此過程中可回收熱能，但能量利用率較低，且會(huì)產(chǎn)生大量有毒物質(zhì)。填埋法是將廢舊塑料集中用土掩埋，該方法簡單易行，但長期不能降解的塑料將成為永久垃圾，不僅占用土地資源，還會(huì)進(jìn)一步污染土壤、地下水等[10]。相比傳統(tǒng)的填埋和焚燒，回收利用更加科學(xué)有效，能兼顧資源的循環(huán)利用和避免環(huán)境污染。利用機(jī)械加工進(jìn)行物理回收要求廢棄物所含的雜質(zhì)較少，且加工過程易造成制品的性能降低，一般只能降級(jí)使用[11]?；瘜W(xué)回收則是將PET解聚成對(duì)苯二甲酸二甲酯、TPA、和EG等，使其重新用于高品質(zhì)化學(xué)品的合成，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益。由于PET僅在非常強(qiáng)烈的化學(xué)條件(如強(qiáng)酸、高溫等) 下被降解再利用[12]，該方法對(duì)設(shè)備有很高的要求，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的廢水，這增加了處理成本，也阻礙了化學(xué)回收法的發(fā)展。

鑒于環(huán)境和資源的友好性，生物降解法處理塑料受到越來越多的關(guān)注。近年來研究者發(fā)現(xiàn)了一些具有PET水解活性的角質(zhì)酶(cutinase)[13-14]、脂肪酶(lipase)[15-16]和酯酶(esterase)[17-18]等，其中以角質(zhì)酶最有潛力，該類酶不僅降解活性更高，且沒有“帽子”結(jié)構(gòu)而不像脂肪酶那樣需要脂水界面激活[19]。雖然生物降解的應(yīng)用前景很好，但已發(fā)現(xiàn)的PET水解酶活性太低，盡管采用了多種策略去增強(qiáng)酶的活性，仍無法達(dá)到工業(yè)化的要求。2016年，Yoshida等[9]從I.sakaiensis中分離出一種特殊的PET水解酶PETase，該酶與具有PET水解活性的角質(zhì)酶有很高的序列相似性(約50 %)，但它對(duì)PET的水解活性和選擇性均明顯高于其他PET水解酶。PETase的發(fā)現(xiàn)，是PET生物降解研究中的突破性進(jìn)展，對(duì)PETase結(jié)構(gòu)和機(jī)制的闡明將為PET乃至其他塑料的降解提供重要線索。

2 PETase的降解活性及相關(guān)影響因素

Yoshida等[9]發(fā)現(xiàn)I.sakaiensis能夠吸附于PET薄膜的表面，其分泌的PETase能將PET降解為主產(chǎn)物對(duì)苯二甲酸乙二醇酯單體(MHET)、次產(chǎn)物對(duì)苯二甲酸二乙二醇酯(BHET)和TPA，也可將BHET降解為MHET，PET及其產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。將PETase與其進(jìn)化分枝上的3種PET水解酶(來自嗜熱放線菌的水解酶TfH[20]、來自枝葉堆肥元基因組的角質(zhì)酶同系物L(fēng)CC[21]和來自腐皮鐮刀菌的角質(zhì)酶FsC[22])進(jìn)行PET水解活性的比較，發(fā)現(xiàn)PETase與其他PET水解酶在底物的選擇性和水解活性上存在差異。在30 ℃，pH=7條件下，PETase對(duì)PET薄膜的水解活性分別是TfH、LCC和FsC的120、5.5和88倍，但對(duì)脂肪酶和角質(zhì)酶的優(yōu)選底物對(duì)硝基苯酯的水解活性顯著低于TfH、LCC和FsC。盡管致密的高結(jié)晶度PET能顯著弱化酯鍵的酶解[23]，PETase對(duì)取自塑料瓶的高結(jié)晶度PET的活性也明顯高于TfH、LCC和FsC。PETase幾乎無法降解萘基酯，對(duì)該類物質(zhì)的降解活性約為對(duì)硝基苯酯類的百萬分之一。但在PETase中分別引入S64M、W130F和N212F突變后，該酶對(duì)萘基酯表現(xiàn)出降解活性，其中以W130F突變酶的活性提高最為明顯。這可能因?yàn)橥蛔冃蚉ETase的催化中心疏水性增加，且立體阻礙降低，使體積更大的疏水性萘基能順利進(jìn)入酶的催化域凹槽中。Austin等[24]發(fā)現(xiàn)PETase對(duì)PET的生物基替代物2，5-呋喃二甲酸乙二醇酯(PEF)具有活性，但對(duì)脂肪族聚酯類的聚乳酸和聚丁二酸丁二醇酯均無活性。因此推測(cè)PETase主要是一種芳香族聚酯酶，并且可能對(duì)多種芳香族聚酯具有水解活性。

PETase具有一定的熱不穩(wěn)定性，其最適溫度范圍是25～35 ℃，在55 ℃時(shí)幾乎沒有活性，通過硫酸銨沉淀和戊二醛交聯(lián)法固定PETase后，酶的活性比溶液條件下有所下降，但其熱穩(wěn)定性增強(qiáng)，最適溫度范圍擴(kuò)大到25～45 ℃，且在65 ℃時(shí)仍保留其最高活性的60 %[25]?？梢奝ETase能在室溫時(shí)表現(xiàn)出很好的PET薄膜降解活性，而TfH、LCC和FsC的活性最佳溫度在50～70 ℃，因此在工業(yè)應(yīng)用中PETase對(duì)溫度條件的要求可能更低。隨著酶濃度的增加，PETase相比TfH、LCC和FsC的活度比下降，表明PETase在低濃度下能更有效地降解PET[9]。

PETase對(duì)PET的水解活性還受到溶劑中其他組分的影響，如溶劑中鹽濃度在100～500 mmol/L的范圍內(nèi)，PETase的酶活性與鹽濃度成正比，中等濃度的甘油(10 %～20 %)能夠提高酶的活性，而有機(jī)溶劑和洗滌劑(如乙醇、丙醇、吐溫20等)會(huì)降低酶活性。Furukawa等[26]將低結(jié)晶度的PET薄膜提前用陰離子表面活性劑處理1 h，然后加入PETase在30 ℃進(jìn)行水解反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)酶在起初3 h的催化活性比不用陰離子表面活性劑處理的對(duì)照組提高了120多倍。這可能是因?yàn)镻ETase自身帶正電，經(jīng)陰離子表面活性劑處理后的PET薄膜帶負(fù)電，因此酶到達(dá)PET表面的量增加，進(jìn)而降解效率提高。該課題組提出PETase表面陰離子區(qū)由位于底物結(jié)合口袋一側(cè)的Arg24、Arg61和Lys66構(gòu)成，該區(qū)域?qū)﹃庪x子表面活性劑發(fā)揮作用至關(guān)重要。此外他們發(fā)現(xiàn)，0.023 %的十二烷基磺酸鈉(SDS)能顯著增加PETase對(duì)PET薄膜的降解活性，但Liu等[25]發(fā)現(xiàn)0.1 %的SDS能完全抑制PETase降解對(duì)硝基苯基丁酯，因此對(duì)于表面活性劑的影響還有待深入研究。另外，溶液的pH也會(huì)影響PETase活性的發(fā)揮，該酶在pH為6～10時(shí)有活性，其最適pH范圍是7～9，在pH=8時(shí)達(dá)到最佳活性。

3 PETase的晶體結(jié)構(gòu)

目前蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB)中收錄的PETase晶體結(jié)構(gòu)僅有14個(gè)，有關(guān)信息如表1所示。其中PETase與配體的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)僅有2個(gè)，即R103G/S131A雙突變(DM)型PETase分別與對(duì)硝基酚(pNP)和HEMT的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。PETase原型酶以及DM型PETase-HEMT復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)如圖2所示，配體pNP和HEMT的分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

表1 PDB數(shù)據(jù)庫中PETase的晶體結(jié)構(gòu)信息Tab.1 Information of crystal structures of PETase from PDB

在不同的PETase晶體結(jié)構(gòu)[24, 27-29]中，一個(gè)非對(duì)稱單元里曾發(fā)現(xiàn)1條或者3條肽鏈，而排阻色譜實(shí)驗(yàn)表明該酶以單體發(fā)揮PET水解活性[28]。PETase屬于α/β-水解酶超家族，具有典型的ɑ/β-水解酶折疊，結(jié)構(gòu)中心的β-片層(β1～β9)由α-螺旋(α1～α7)所包圍。PETase具有在不同PET水解酶之間嚴(yán)格保守的催化三聯(lián)體Ser131-His208-Asp177。這3個(gè)催化殘基分別位于β5、β7和β8后的loop環(huán)上，其中親核性Ser131位于高度保守的“親核肘”(nucleophilic elbow)處，同His208形成氫鍵并被其誘導(dǎo)極化，而堿性His208則被酸性Asp177所穩(wěn)定[27-28]。Han等[27]發(fā)現(xiàn)催化中心Met132和Tyr58的骨架NH基團(tuán)形成一個(gè)氧陰離子洞，這也是超家族成員酯酶和脂肪酶的共同特征。此外，催化中心附近的Trp156在PETase的3條肽鏈中分別采取不同構(gòu)象(“A”“B”和“C”構(gòu)象)，而其他同源酶相應(yīng)位置的Trp均采取“C”構(gòu)象，未出現(xiàn)構(gòu)象“擺動(dòng)”，這可能是因?yàn)镻ETase的Trp156附近為Ser185，比其他同源酶相應(yīng)位置的His空間位阻更小，允許Trp156采取多種構(gòu)象。PETase的表面高度極化，帶正電(等電點(diǎn)為9.6)；而與其同源性很高的嗜熱放線菌角質(zhì)酶TfCut2[13]，其表面散布著酸性和堿性殘基，因此更接近于電中性(等電點(diǎn)為6.3)。此外，PETase和TfCut2相比具有更寬的底物結(jié)合凹槽，前者凹槽的最寬處約為后者的3倍，該結(jié)構(gòu)對(duì)于結(jié)晶度較高的芳香族聚酯與活性位點(diǎn)的結(jié)合可能是必要的[24]。

圖1 PETase水解反應(yīng)產(chǎn)物和PETase復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中配體的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of PETase hydrolysis products and ligands in the crystal complexes of PETase

圖2 PETase原型酶和DM型PETase-HEMT的晶體結(jié)構(gòu)Fig.2 Crystal structures of apo-form PETase and DM-form PETase-HEMT

目前，研究者還無法得到野生型PETase與配體的復(fù)合物晶體，可能是因?yàn)镻ETase的Arg103側(cè)鏈伸入Ser131附近的狹縫，從而阻礙底物進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)。Han等成功得到含有R103G突變的DM型PETase，以及該酶分別與底物類似物HEMT和產(chǎn)物類似物pNP的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。將DM型和野生型PETase的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)突變并未明顯改變蛋白的整體折疊(Cα的RMSD=0.144～0.2 ?)，因此可利用DM型PETase的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)來推測(cè)酶的底物結(jié)合模式以及催化機(jī)制。此外研究者還測(cè)定了多種突變型PETase的晶體結(jié)構(gòu)，如S131A和R280A突變酶等，用以分析定點(diǎn)突變的氨基酸殘基是否對(duì)酶的底物結(jié)合位點(diǎn)及活性產(chǎn)生關(guān)鍵的影響[27-28]。

4 PETase的底物結(jié)合模式與催化降解機(jī)制

4.1 PETase的底物結(jié)合模式

在DM-HEMT和DM-pNP的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中[27]，配體主要以疏水作用結(jié)合于PETase表面的淺顯凹槽中。HEMT的結(jié)合位點(diǎn)包含Ala131、His208、Trp156、Ile179、Trp130、Tyr58和Met132等氨基酸殘基，底物一端羰基鄰近Ala131，推測(cè)其在野生型PETase中會(huì)受到Ser131的親核進(jìn)攻，同時(shí)羰基氧原子指向氧陰離子洞并與之形成氫鍵，而酯氧原子與His208側(cè)鏈形成氫鍵。Trp156采取“B”構(gòu)象并與底物苯環(huán)形成T-型的π-π堆積作用，而其他氨基酸殘基則提供疏水作用。pNP與DM型PETase的相互作用殘基則明顯少于HEMT，只有Trp156、Ile179和Met132與底物形成了疏水作用。有趣的是，pNP和HEMT的位置發(fā)生了輕微變化，二者的苯環(huán)旋轉(zhuǎn)了約36 °，且pNP的苯環(huán)比HEMT遠(yuǎn)離活性位點(diǎn)約2.3 ?，并與Trp156的吲哚環(huán)形成面對(duì)面的π-π堆積作用。

Joo等[28]與Han等[27]幾乎同時(shí)得到了PETase的晶體結(jié)構(gòu)，但前者通過分子對(duì)接模擬了一個(gè)長底物2-羥乙基四羥乙基對(duì)苯二甲酸酯[2-HE(MHET)4]與PETase的結(jié)合模式。模擬得到的底物結(jié)合口袋是一個(gè)長而淺的L型表面凹槽，寬約25～29 ?，長約40 ?，其表面主要呈現(xiàn)疏水性。2-HE(MHET)4中的一個(gè)MHET單體結(jié)合于亞位點(diǎn)I，其他3個(gè)MHET單體分別結(jié)合于亞位點(diǎn)II的IIa、IIb和IIc區(qū)。其中酶的催化域包含于亞位點(diǎn)I中，該位點(diǎn)與MHET單體的結(jié)合模式與Han等[29]得到的HEMT結(jié)合模式相似。

4.2 PETase的催化降解機(jī)制

基于晶體結(jié)構(gòu)分析、定點(diǎn)突變和分子模擬等技術(shù)，研究者初步得到了PETase的催化機(jī)制，如圖3所示。首先PETase的原酶形式為底物提供了一個(gè)可供結(jié)合的淺表凹槽，同時(shí)催化中心附近的Trp156呈現(xiàn)不同構(gòu)象。當(dāng)酶結(jié)合PET時(shí)，底物中與苯環(huán)相連的羰基指向底物結(jié)合凹槽的中心，并受到催化三聯(lián)體的親核進(jìn)攻，同時(shí)氧陰離子洞使酯鍵發(fā)生極化并穩(wěn)定反應(yīng)中間產(chǎn)物，而Trp156采取“B”構(gòu)象并與PET的TPA基團(tuán)形成T型π-π堆積作用。接下來的作用機(jī)制與經(jīng)典的角質(zhì)酶催化機(jī)制相同，先形成?；钢虚g體，然后由水分子進(jìn)行第二次親核進(jìn)攻，從而解離酯鍵。最終得到的苯甲酸基團(tuán)形成一個(gè)大平面，其構(gòu)象發(fā)生旋轉(zhuǎn)從而與Trp156形成面對(duì)面的π-π堆積作用，使產(chǎn)物從原來可能較弱的T型π-π堆積作用位點(diǎn)被移走[27]。

圖3 PETase的催化降解機(jī)制[27]Fig.3 Catalytic mechanism of PETase[27]

5 PETase的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征

5.1 PETase與其他同源PET水解酶的結(jié)構(gòu)差異

將PETase與其他多個(gè)同源的PET水解酶進(jìn)行蛋白序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)底物結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基嚴(yán)格保守或者半保守，表明不同PET水解酶具有相似的底物相互作用[27]。但PETase與其他PET水解酶在底物結(jié)合位點(diǎn)處還存在細(xì)微的差異，這可能是PETase水解活性較高的原因：(1)PETase形成了2個(gè)分子內(nèi)二硫鍵(DS1和DS2)，而其他同源酶只有1個(gè)二硫鍵(DS2)。共同保守的DS2
(cys244-Cys260)連接了酶C末端的α-螺旋和最后一個(gè)loop環(huán)，因其位于活性位點(diǎn)的反面，推測(cè)DS2不會(huì)直接影響酶的活性，但會(huì)影響其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。PETase專有的DS1
(cys174-Cys210)連接著β7-α5環(huán)與β8-α6環(huán)，而這兩個(gè)環(huán)分別包含了催化三聯(lián)體中的Asp177和His208。分子動(dòng)力學(xué)模擬表明，在室溫下PETase活性位點(diǎn)的柔性比其他耐熱同源酶更大，而這種柔性由DS1控制，DS1的消失將導(dǎo)致催化三聯(lián)體的不穩(wěn)定。將DS1連接的2個(gè)Cys突變?yōu)槠渌鸓ET水解酶的對(duì)應(yīng)殘基Ala后，PETase的熱穩(wěn)定性和活性隨著DS1消失均明顯下降，因此說明DS1對(duì)PETase的熱穩(wěn)定性和活性都有重要意義[27-29]。(2)PETase中的β8-α6環(huán)比同源酶TfCut2多出3個(gè)殘基(Asn215、Ser216和Asn217)，該環(huán)的延伸促使亞位點(diǎn)II的IIa區(qū)與IIb、IIc區(qū)相連形成一個(gè)長凹槽，而同源酶中更短的環(huán)則阻礙了亞位點(diǎn)II長凹槽的形成，使該位點(diǎn)僅包含IIa區(qū)。PETase與TfCut2在活性位點(diǎn)I處的殘基相同，表明二者與第一個(gè)MHET的結(jié)合模式相似。但在亞位點(diǎn)II處，PETase中含有Trp130和Ser209，而TfCut2的對(duì)應(yīng)位置為His169和Phe249，將PETase的這兩個(gè)殘基分別突變?yōu)門fCut2的相應(yīng)殘基后，發(fā)現(xiàn)突變酶對(duì)PET和BHET的降解活性均顯著下降，表明Trp130和Ser209對(duì)PETase活性的發(fā)揮很關(guān)鍵，這種殘基差異可能導(dǎo)致TfCut2的IIa區(qū)更窄更深，而不利于第二個(gè)MHET與酶的結(jié)合[28]。

5.2 影響PETase活性的關(guān)鍵殘基

將PETase底物結(jié)合位點(diǎn)處的氨基酸殘基進(jìn)行突變，多數(shù)情況下會(huì)降低酶的水解活性。將催化域三聯(lián)體中的Ser、His和Asp分別突變?yōu)锳la，則酶對(duì)PET薄膜和BHET幾乎完全失去活性，說明這3個(gè)殘基是酶催化反應(yīng)的關(guān)鍵組成[28]。Tyr58、Thr59突變對(duì)PET降解為MHET的效率影響較小，但對(duì)MHET進(jìn)一步降解為TPA的效率影響很大。值得注意的是，盡管PETase的Ser209被替換為Phe或Trp130被替換為His后，酶活性顯著降低[28]，但對(duì)PETase引入S209F/W130H雙突變后，酶對(duì)PET和PEF的降解活性均高于野生型[24]。Ma等[30]通過分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)Ile179能與長底物對(duì)苯二甲酸乙二醇酯二聚體(2PET)形成疏水作用，以往研究發(fā)現(xiàn)I179A突變型PETase幾乎無水解活性，可能是因?yàn)槠茐牧薎le179的疏水作用。該課題組將Ile179突變?yōu)槭杷愿鼜?qiáng)且側(cè)鏈更長的Phe，設(shè)計(jì)的新酶能夠固定住PET的苯環(huán)，從而成功將酶的水解活性提高了2.5倍。

除與底物直接相互作用的氨基酸殘基，其他殘基也能對(duì)PETase的活性產(chǎn)生影響。在PETase的催化水解過程中，Trp156的構(gòu)象“擺動(dòng)”可能有利于底物的結(jié)合與產(chǎn)物的移走，而Trp156的構(gòu)象與Ser185緊密相關(guān)，將Ser185突變?yōu)镻ETase同源酶的對(duì)應(yīng)殘基His后，PETase的活性明顯降低，說明該酶的突出活性至少部分依賴于Ser185的存在[27]。同理，L88F通過穩(wěn)定活性位點(diǎn)的關(guān)鍵殘基Tyr58，使突變酶的水解活性提高了2.1倍[30]。位于結(jié)合位點(diǎn)IIc區(qū)末端的Arg251由于帶正電且結(jié)構(gòu)凸出，阻擋了底物結(jié)合位點(diǎn)的延伸，將其突變?yōu)檩^小疏水殘基Ala后，發(fā)現(xiàn)酶對(duì)PET薄膜的水解活性在18 h和36 h分別提高了22.4 %和32.4 %。對(duì)R251A型PETase進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)突變后酶結(jié)合位點(diǎn)的IIc區(qū)得到延伸，并出現(xiàn)疏水非突起的凹槽，更有利于容納PET底物[28]。將同樣位于底物結(jié)合凹槽邊緣的帶電Arg61突變?yōu)槭杷畾埢鵄la后，通過降低其周圍的帶電性，增強(qiáng)了疏水性PET同PETase的結(jié)合，使酶的水解活性提高了1.4倍[30]。

6 結(jié)語

PET作為當(dāng)前產(chǎn)量最高的聚酯，在民用和軍用產(chǎn)品的制造及包裝中得到廣泛的應(yīng)用。由于PET較難生物降解，產(chǎn)生的大量PET廢棄物給生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重危害。由于傳統(tǒng)的焚燒、填埋和回收方法具有較大的弊端，探索經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好的生物降解方法成為當(dāng)下的研究趨勢(shì)，而重點(diǎn)是找到降解活性強(qiáng)并且應(yīng)用條件易達(dá)到的生物酶，以便能夠工業(yè)化推廣。近年來發(fā)現(xiàn)的新型PET水解酶PETase，對(duì)PET底物具有很強(qiáng)的選擇性，且在常溫時(shí)的降解活性顯著高于其他PET水解酶。通過對(duì)PETase的生物降解研究進(jìn)行總結(jié)，得出以下幾點(diǎn)啟示：

(1)PETase發(fā)揮出色水解活性的關(guān)鍵特征為其專屬的二硫鍵DS1和獨(dú)特的亞結(jié)合位點(diǎn)II，可將其作為參考標(biāo)準(zhǔn)用于潛在PET水解酶的篩選；

(2)酶底物結(jié)合位點(diǎn)處的殘基以及能穩(wěn)定結(jié)合位點(diǎn)空間結(jié)構(gòu)的殘基，可能對(duì)維持酶的水解活性具有重要影響。此外，降低酶表面結(jié)合位點(diǎn)處的帶電性可作為酶結(jié)構(gòu)改造的依據(jù)，通過增強(qiáng)酶與疏水性PET的結(jié)合，進(jìn)而提高其水解活性；

(3)目前的PETase水解實(shí)驗(yàn)主要以低結(jié)晶度的PET薄膜為底物，但許多PET廢棄物為高結(jié)晶度制品，這可能對(duì)PETase的有效降解構(gòu)成挑戰(zhàn)，由于PET在較高溫度下結(jié)晶度下降，設(shè)計(jì)耐熱的PET水解酶可能有助于提高PET的降解效率；

(4)已發(fā)現(xiàn)的PETase底物包括PET、PEF和對(duì)硝基苯酯等，但該酶不能降解脂肪族聚酯，表明PETase可能是一種芳香族聚酯酶。PETase新底物的發(fā)現(xiàn)，以及通過酶結(jié)構(gòu)的改造拓寬底物范圍(如萘基酯)，將提高PETase的應(yīng)用價(jià)值；

(5)PETase水解活性的發(fā)揮與外界條件息息相關(guān)，探索適宜的溫度、濃度和添加劑等反應(yīng)條件，或者提高酶對(duì)不利條件的耐性，將有助于推進(jìn)該酶的工業(yè)化應(yīng)用進(jìn)程。