魏元基 李峻昊 王利波 王成龍 戴薇薇

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032

臨床上糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid, GC)被廣泛用于抗炎、抗過(guò)敏、抗中毒、抗休克的治療，但易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[1-3]。GC誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥(glucocorticoid induced osteoporosis, GIOP)是繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的最常見病因。臨床流行病學(xué)研究顯示，在美國(guó)約50%風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者長(zhǎng)期使用GC，治療數(shù)周后，骨量開始流失，最初數(shù)月內(nèi)的骨量丟失迅速，達(dá)5%～15%。長(zhǎng)期接受GC治療(半年以上)的患者骨質(zhì)疏松發(fā)生率高達(dá)30%～50%[3]。

β-蛻皮甾酮(β-Ecdysone，β-Ecd)為牛膝根內(nèi)主要活性成分之一。本研究發(fā)現(xiàn)，β-Ecd有助于改善去勢(shì)小鼠的脊椎骨小梁體積與骨強(qiáng)度，一定劑量的β-Ecd可以提高成骨細(xì)胞的活性而抑制破骨細(xì)胞的活性[4]。骨細(xì)胞在骨組織中占90%～95%，形成遍布骨基質(zhì)的三維骨細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)(osteocyte network)。其被認(rèn)為是機(jī)械應(yīng)力感受細(xì)胞及活躍的旁分泌細(xì)胞。但近年研究表明，骨細(xì)胞可能是骨重塑的調(diào)節(jié)中心，起著包括骨重塑的啟動(dòng)、骨吸收的抑制以及骨形成調(diào)節(jié)等的重要作用[5]。本實(shí)驗(yàn)研究β-Ecd對(duì)Dex誘導(dǎo)的骨細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用，并檢測(cè)Akt1、P-Akt(Thr308)、CX43、Caspase9、Bad、P-Bad蛋白的表達(dá)，以探討β-Ecd作用于骨細(xì)胞可能的分子途徑。為β-Ecd干預(yù)GIOP的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥物和試劑

β-蛻皮甾酮(批號(hào)：10020231，規(guī)格: 99%，分子量: 480.6，上海同田生物技術(shù)有限公司)，地塞米松(批號(hào)：D9184，分子量: 434.5，Sigma公司)，α-MEM 培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(Hyclone 公司)，青鏈霉素(Hyclone公司)，PI3K抑制劑LY294002(LY，編號(hào)：9901S，Cell Signaling Technology 公司)，Annexin V- FITC/PI(編號(hào)：V13241，Thermo fisher公司)，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(編號(hào)：P0010，碧云天公司)，Akt1、P-Akt-T308、CX43、Caspase9、Bad、P-Bad、GAPDH 單克隆兔抗小鼠抗體(Cell Signaling Technology公司)，羊抗兔 IgG-HRP 二抗(Santa Cruz公司)，ECL顯色試劑盒(批號(hào)：P0 018 A，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 儀器

CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)：FORMA STERI-CYCLE i160，Thermo Scientific公司)，生物安全柜(型號(hào)：MSC 1.8，Thermo Scientific公司)，電泳儀與凝膠垂直電泳系統(tǒng)(型號(hào)：Mini Protean，美國(guó) BIO-RAD 公司)，酶標(biāo)儀(型號(hào)：Synergy2，Bio Tek公司)，流式細(xì)胞儀(型號(hào)：C6，BD 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1MLO-Y4骨樣細(xì)胞給藥與分組：MLO-Y4骨樣細(xì)胞以α-MEM培養(yǎng)基(2.5% 胎牛血清+2.5% 小牛血清+1%青鏈霉素)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，分別以Dex、LY(PI3K抑制劑)、不同濃度的β-Ecd進(jìn)行干預(yù)，將細(xì)胞分為6組：①正常組；② 10 μmol/L Dex模型組；③ 10 μmol/L Dex+10 μmol/L β-Ecd組；④ 10 μmol/L Dex+10 μmol/L β-Ecd+50 μmol/L LY294002組；⑤10 μmol/L Dex+0.1 μmol/L β-Ecd組；⑥ 10 μmol/L Dex+0.1 μmol/L β-Ecd+50 μmol/L LY294002組。作用時(shí)間為48 h。

1.3.2Annexin V- FITC/PI 法檢測(cè)凋亡：MLO-Y4骨樣細(xì)胞用0.25%胰酶消化，洗滌，1300g，4 ℃離心5 min，收集。加入 5 μL FITC 標(biāo)記的 Annexin- V 室溫避光15 min，再加入PI，避光反應(yīng)5 min 后，加入5 μL緩沖液(binding buffer)，進(jìn)行流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)(N=3)。

1.3.3Western-Blot檢測(cè)Dex、β-Ecd作用下Akt、P-Akt(Thr308)、CX43、Caspase9、Bad、P-Bad、GAPDH蛋白表達(dá)：提取各組細(xì)胞總蛋白，以BCA法進(jìn)行蛋白定量測(cè)定，變性蛋白，SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入稀釋后的一抗(Akt1、P-Akt(Thr308)、CX43、Caspase9、Bad、P-Bad稀釋比例 為1∶200，GAPDH稀釋比例為1∶400)，置于4 ℃冰箱過(guò)夜，PBST 洗滌8次，每次5 min；將PVDF膜放入含辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的稀釋二抗(HRP Goat anti-Rabbit IgG，對(duì)磷酸化一抗稀釋比例為1∶3000，對(duì)其余一抗稀釋比例為1∶15000)，室溫孵育1 h，PBST洗滌8次，每次5 min。ECL 試劑顯色，凝膠圖像分析儀曝光、拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀Annexin V- FITC/PI 法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果(圖1)顯示：與正常組比較，造模組(10 μmol/L Dex)凋亡率升高；與造模組比較，用藥組(10 μmol/L β-Ecd，0.1 μmol/L β-Ecd)降低了凋亡率；而加入抑制劑LY(第4、6組)凋亡率明顯升高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，第4組(10 μmol/L β-Ecd)凋亡率比第6組(0.1 μmol/L β-Ecd)低。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡結(jié)果Fig.1 Apoptosis results detected with flow cytometry

圖2 MLO-Y4細(xì)胞凋亡率與正常組比較， *P<0.05；與造模組比較，△△ P<0.01。Fig.2 Apoptosis rate of MLO-Y4 cells

2.2 Western-Blot檢測(cè)各組細(xì)胞相關(guān)基因蛋白表達(dá)

與正常組比較，Dex組Akt1、CX43蛋白表達(dá)降低；與造模組(10 μmol/L Dex)比較，β-Ecd(10 μmol/L，0.1 μmol/L)使Akt1、CX43蛋白表達(dá)增強(qiáng)；

與給藥干預(yù)組比較，加入LY后，Akt1、P-Akt(Thr308)、CX43蛋白表達(dá)均降低。

表1 各組細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果Table 1 The results of cell-associated protein expressions in each

注：與正常組比較*P<0.05；與造模組比較△P<0.05。

Caspase9、Bad是促進(jìn)凋亡的因子，Bad磷酸化(P-Bad)則抑制Bad活性。與正常組比較，Dex組Caspase9、Bad表達(dá)增強(qiáng)、P-Bad表達(dá)減弱，提示誘發(fā)凋亡；與造模組(10 μmol/L Dex)比較，β-Ecd(10 μmol/L，0.1 μmol/L)減弱Caspase9的表達(dá)；加入抑制劑LY組(第4、6組)，Caspase9、Bad表達(dá)明顯減弱、P-Bad表達(dá)明顯升高，且第4組、第6組表達(dá)因β-Ecd濃度不同而有差異。

圖3 Western-Blot檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Results of Western-Blot

3 討論

GC廣泛應(yīng)用于臨床，但同時(shí)也伴隨不良反應(yīng)，如導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。目前認(rèn)為，骨形成的抑制和骨細(xì)胞的凋亡在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制中起到一定且關(guān)鍵的作用，而在GC使用期間骨吸收的變化是可變的[6]。過(guò)量的GC抑制Akt蛋白的活性，從而抑制了骨形成[7]；高劑量或者長(zhǎng)時(shí)間使用GC則影響骨的水化、骨內(nèi)血管及骨的強(qiáng)度而導(dǎo)致骨細(xì)胞的凋亡[8]，約25%的患者由于凋亡的細(xì)胞的聚集而發(fā)生骨壞死，從而增加股骨頭塌陷的風(fēng)險(xiǎn)[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高濃度(10 μmol/L)Dex使MLO-Y4骨細(xì)胞凋亡率升高。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，衰老會(huì)導(dǎo)致骨細(xì)胞凋亡增加[10]。牛膝活性成分β-蛻皮甾酮具有明顯的延長(zhǎng)果蠅壽命、降低MDA(malonaldehyde，丙二醛)、升高SOD(superoxide dismutase，超氧化物歧化酶)活性等抗衰老作用[11]。

CX43(骨連接蛋白)是骨細(xì)胞中表達(dá)最豐富的半通道蛋白，由兩個(gè)并列連接子或半通道形成的間隙連接調(diào)節(jié)骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊，因此在骨形成和骨重塑中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Dex可誘導(dǎo)CX43降解，而Akt磷酸化則抑制CX43降解，CX43降解可能導(dǎo)致骨質(zhì)流失[13]。PI3K/Akt信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和凋亡中起重要作用，本研究結(jié)果表明，10 μmol/L地塞米松使MLO-Y4骨細(xì)胞Akt1、CX43蛋白表達(dá)降低，而β-Ecd使Akt1、CX43蛋白表達(dá)升高。LY294002是PI3K/Akt信號(hào)通路特異性抑制劑，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明LY通過(guò)抑制Akt磷酸化而抑制Akt蛋白活性并增加凋亡率[14]。研究發(fā)現(xiàn)，β-Ecd并不能使LY降低的Akt1蛋白表達(dá)升高。由此反證β-Ecd在骨細(xì)胞中可能通過(guò)Akt途徑對(duì)Dex誘導(dǎo)的凋亡起干預(yù)作用。

據(jù)報(bào)道線粒體是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵。激活Bad使線粒體通透性提高，細(xì)胞色素C從膜間隙釋放到細(xì)胞質(zhì)中，最終激活Caspase酶介導(dǎo)的凋亡程序。而P-Bad與分子伴侶蛋白14-3-3結(jié)合，能抑制Bad的表達(dá)[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L Dex抑制骨細(xì)胞Bad蛋白的磷酸化，促進(jìn)Bad、caspase9蛋白的表達(dá)，而一定濃度的β-Ecd干預(yù)則使Caspase9蛋白的表達(dá)降低。表明β-Ecd 可能通過(guò)線粒體凋亡途徑抑制Dex誘導(dǎo)的骨細(xì)胞凋亡。

綜上，牛膝活性成分β-蛻皮甾酮通過(guò)激活骨細(xì)胞中的PI3K/Akt信號(hào)通路，從而干預(yù)Dex誘導(dǎo)的骨細(xì)胞凋亡，該過(guò)程可能依賴于線粒體凋亡途徑。