沈巖爾，賈懷杰，王曉霞，陳國華，何小兵，房永祥，薛慧文，景志忠

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，甘肅 蘭州 730046；3.蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)研究所，甘肅 蘭州 730000)

羊傳染性膿包性皮炎(contagious ecthyma，CE)俗稱羊口瘡(Orf)[1]，是由羊口瘡病毒(orf virus，ORFV)引起的一種急性、高度接觸性、嗜上皮性人獸共患病[2-6].主要感染綿羊和山羊，尤以羔羊或幼齡羊易感，口、唇、舌和乳房等部位形成以丘疹、水皰、膿包和痂皮為主要病理過程為特征[7-8].該病很少引起動物死亡，除非發(fā)生宿主免疫抑制或者繼發(fā)感染，但也有報道稱可引起幼齡山羊高達(dá) 93%的病死率[9-10].羊口瘡呈世界性流行，廣泛存在于所有養(yǎng)羊的國家或地區(qū).我國的東北、西北、西南等多個省市自治區(qū)均有該病的發(fā)生.該病毒抵抗力強(qiáng)、傳染性高，羊群一旦被感染則不宜清除，給畜牧業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，廣泛影響我國養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展[11].近年來，有關(guān)人感染該病毒的臨床病例報道不斷增加[12-13]，除了多種反芻動物和一些野生動物外，也不斷有人發(fā)生感染的報道[14].因此，該病的暴發(fā)和流行嚴(yán)重威脅世界養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展和人類的健康.

ORFV為線性雙鏈DNA病毒，基因組的大小為134～139 kb之間，G+C含量約為63%[4,11,15]，與其他痘病毒科成員一樣，ORFV基因組中間是大的中心編碼區(qū)，兩端為反向末端重復(fù)序列(inverted terminal repeat， ITR)[16-18].ORFV的中心編碼區(qū)(ORF009～ORF111)為保守區(qū)，主要編碼病毒復(fù)制、組裝和釋放所必須的相關(guān)蛋白及與病毒的毒力、免疫調(diào)節(jié)及宿主范圍因子等相關(guān)蛋白.ORF019基因位于ORFV基因組的中心保守區(qū)域，第19個開放閱讀框，約編碼84 ku大小蛋白.本試驗通過對該基因的克隆，利用生物信息學(xué)技術(shù)對核苷酸和其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行了分析和預(yù)測，以及構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-ORF019，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行原核表達(dá)，并進(jìn)行純化及反應(yīng)原性鑒定，為進(jìn)一步開發(fā)ORFV診斷試劑奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌株、菌株和載體

ORFV/QH02/2010分離株、pET-32a(+)原核表達(dá)載體均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室分離、鑒定和保存；大腸埃希菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均購自南京諾唯贊生物科技有限公司.

1.2 載體、工具酶及其他試劑

1.3 方法

1.3.1 引物的設(shè)計與合成 參考GenBank中登錄的ORFV OV-SA00株的基因組序列(登錄號：AY386264)，根據(jù)編碼ORF019基因序列，運(yùn)用Oligo 6.0生物信息學(xué)分析軟件，針對基因設(shè)計1對特異性引物，上游引物序列：5′-CGGGATCCATGCTGCAGCTGCTCAAGAGAT-3′；下游引物序列：5′-CCCAAGCTTTTTTCTGAACCCGCGATTATTG T-3′，其中下劃線部分為BamHⅠ、HindⅢ酶切位點，預(yù)計擴(kuò)增片段大小為2 178 bp，以上引物由西安擎科生物技術(shù)有限公司合成.

1.3.2 病毒DNA的提取及ORF09基因的PCR擴(kuò)增 取200 μL ORFV/QH02/2010分離株細(xì)胞培養(yǎng)物，按照GeneJET病毒RNA/DNA提取試劑盒說明書提取ORFV基因組DNA.以提取的病毒基因組DNA為模板，利用合成的ORF019基因的上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.反應(yīng)體系：5×Prime STAR GXL Buffer 20 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 8 μL，上、下游引物各1.5 μL，DNA模板2 μL，Prime STAR GXL DNA Polymerase 2 μL，用RNase Free ddH2O補(bǔ)至50 μL.擴(kuò)增條件：95 ℃ 預(yù)變性 5 min，98 ℃ 變性10 s，55 ℃ 退火15 s，68 ℃延伸2 min，共進(jìn)行35個循環(huán)；最終72 ℃ 再延伸 10 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠檢測后，并利用DNA膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物.

1.3.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 將PCR產(chǎn)物和pET-32a(+)載體分別利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定、純化回收、T4連接酶進(jìn)行連接后，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5 α 感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切鑒定.最后，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送往擎科(西安)生物技術(shù)有限公司測序.

1.3.4ORFVORF019基因及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析 參考GenBank上公布的羊口瘡ORF019基因序列，利用DNASTAR軟件MegAlign程序中Clustal W方法對測序結(jié)果進(jìn)行分析，ORFV參考毒株信息見表1.

表1 參考毒株

1.3.5 重組表達(dá)菌的誘導(dǎo)表達(dá)鑒定 將測序正確的pET-32a-ORF019重組質(zhì)粒和pET-32a(+)空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)pLys感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，接種到10 mL含Amp 抗性的LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃過夜培養(yǎng).取過夜培養(yǎng)的菌液以1∶100的比例接種到10 mL含有LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至D600值約為0.6時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，22 ℃誘導(dǎo)表達(dá) 4～6 h 收菌.在誘導(dǎo)前、后分別取出1 mL菌液，進(jìn)行SDS-PAGE檢測，分析目的蛋白的表達(dá)情況.同時設(shè)置未誘導(dǎo)pET-32a-ORF019重組質(zhì)粒和pET-32a(+)空質(zhì)粒作為對照.

1.3.6 重組蛋白的純化 擴(kuò)大培養(yǎng)陽性種子菌2 000 mL，并以上述條件進(jìn)行誘導(dǎo)后，4 ℃ 6 500 r/min離心10 min，收集菌體沉淀于50 mL離心管中，PBS洗滌菌液3次，最后用10～15 mL PBS重懸菌體沉淀，超聲破碎裂解菌體(超聲5 s，間歇5 s，總超聲時間為30 min).超聲后的液體于4 ℃、10 000 r/ min 離心20 min，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE檢測，確定該重組蛋白的表達(dá)形式.如果是以包涵體形式表達(dá)，則將收集的沉淀用8 mol/L尿素4℃過夜溶解，離心取上清，再與鎳瓊脂糖凝膠FF混合，于搖床4 ℃孵育過夜，按照鎳瓊脂糖凝膠說明書進(jìn)行蛋白純化.將純化的重組蛋白溶液裝入透析袋中依次用含有6、4、2 mol/L和不含尿素的PBS溶液進(jìn)行透析，每個濃度透析24 h，將透析好的樣品進(jìn)行濃縮、-20 ℃保存.

1.3.7 重組蛋白的Western-blot 檢測 將誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，PVDF膜與厚濾紙浸泡于電轉(zhuǎn)液內(nèi)，用濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到PVDF膜上；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用含有5%的脫脂奶粉封閉2 h，之后用TBST洗滌3次，加入1∶1 000 稀釋的兔源His標(biāo)簽抗體，4 ℃孵育過夜，同時設(shè)置對照組，再用TBST洗3次，每次10 min；然后用1∶10 000稀釋的HPR標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫下孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，加ECL顯色液顯色.

2 結(jié)果與分析

2.1 ORF019基因的PCR擴(kuò)增及其重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在2 000～3 000 bp見可見一條特異性條帶，與預(yù)期目的片段大小一致(圖1)，重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，得到一條特異性片段與目的基因大小一致(圖2)，結(jié)果表明ORF019基因的ORF被完整的插入到表達(dá)載體中，讀碼框正確，因此重組質(zhì)粒命名為pET-32a-ORF019.

2.2 ORFV ORF019基因及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果

測序結(jié)果與GenBank中登錄的副痘病毒屬的成員進(jìn)行了一致性分析，發(fā)現(xiàn)ORFV QH02/2010株ORF019基因與ORFV國內(nèi)外毒株的核苷酸序列一致94.8%～97.8%，其中與德國分離株D1707株(HM133903)的一致性最高為97.8%，與國內(nèi)分離株NA1/11株(KF234407)的一致性96.8%；與其他副痘病毒屬的痘病毒的一致性為73.1%～91.3%(圖3).

M：DL 5 000 DNA marker ；1：PCR產(chǎn)物 PCR products.M:DL 5000 DNA marker;1:PCR product.圖1 ORF019基因PCR擴(kuò)增Figure 1 PCR electrophoresis of ORF019 gene

M：DNA Marke；1：重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物Double digestion products of recombinant plasmid.M:DL 2000 DNA Marker;1:Recombinant plasmid PCR product.圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Figure 2 Eneyme identification of recombinant plasmid

利用DNASTAR LaserGen 7.1 Megalign軟件，對ORFV與脊椎動物痘病毒亞科各屬代表毒株E2L蛋白的氨基酸序列利用Clustal W法對多序列直系同源性分析，結(jié)果顯示(表1)，脊椎動物痘病毒亞科的不同屬之間，E2L蛋白的氨基酸序列一致性在17.8%～79.1%之間，其中ORFV與其他脊椎動物痘病毒亞科的9株代表毒株的氨基酸序列一致性偏低，在17.8%～29.5%之間.

圖3 副痘病毒屬ORF019基因一致性分析Figure 3 Consistency analysis of ORF019 gene of Parapoxvirus

圖4 脊椎動物痘病毒亞科E2L蛋白的一致性分析Figure 4 Consistency analysis of subfamily E2L protein of vertebrate poxvirus

2.3 重組蛋白的表達(dá)與鑒定

SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，與對照空載體pET-32a菌液相比，重組質(zhì)粒pET-32a-ORF019的

誘導(dǎo)菌在大小為100 ku左右有1條較粗的蛋白條帶(圖5).而未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒的菌液和空載體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌均未出現(xiàn)相同的條帶.

2.4 融合蛋白的可溶性分析

pET-32a-ORF019經(jīng)誘導(dǎo)超聲破菌之后，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE電泳.結(jié)果顯示重組蛋白主要存在于沉淀中(圖6)，表明融合蛋白主要以包涵體的形式存在.

2.5 重組ORF019蛋白的純化

經(jīng)鎳親和層析柱純化，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，經(jīng)鎳親和層析柱純化，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，洗脫濃度在300、400 mmol/L時重組蛋白pET-32a-ORF019被洗脫下來，流穿液和200 mmol/L洗脫液中蛋白含量比較高，但含有少量的雜帶(圖7).

M：蛋白質(zhì)Marker；1：pET-32a-ORF019 IPTG誘導(dǎo)后；2：pET-32a-ORF019 IPTG誘導(dǎo)前；3：pET-32a IPTG 誘導(dǎo)后；4：pET-32a IPTG誘導(dǎo)前.M:Protein Marker；1：pET-32a-ORF019 after IPTG induction；2：pET-32a-ORF019 before IPTG induction；3：After pET-32a IPTG induction;4:Before pET-32a IPTG induction圖5 His-ORF019重組蛋白的 SDS-PAGE 電泳Figure 5 SDS-PAGE electrophoresis of His-ORF019 recombinant protein

M：蛋白質(zhì)Marker；1：pET-32a-ORF019誘導(dǎo)超聲后的沉淀；2：pET-32a-ORF019誘導(dǎo)超聲后的上清.M：Protein Marker；1：pET-32a-ORF019 induces post-ultrasound precipitation；2：pET-32a-ORF019 induces supernatant after ultrasound.圖6 重組 pET-32a-ORF019 蛋白的可溶性分析Figure 6 Soluble analysis of recombinant pET-32a-ORF019 protein

M：蛋白質(zhì)Marker；1：pET-32a-ORF019的上樣液；2：pET-32a-ORF019蛋白過Ni柱純化的流穿液；3～7：依次是Ni-Native-50、Ni-Native-100、Ni-Native-200、Ni-Native-300、Ni-Native-400過柱后收集的蛋白.M：protein Marker；1：pET-32a-ORF019 loading solution；2：pET-32a-ORF019 protein through Ni column purified flow through solution；3～7：Ni-Native-50,Ni-Native-100,Ni-Native-200,Ni-Native-300,Ni-Native-400 collected proteins.圖7 重組 pET-32a-ORF019 蛋白的純化Figure 7 Purification of the recombinant pET-32a-ORF019 protein

2.6 重組ORF019蛋白的Western-blot分析

Western-blot檢測結(jié)果顯示；重組質(zhì)粒pET-32a-ORF019誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白在約100 ku處有特異的陽性條帶，而陰性對照則無任何特異性的條帶(圖8).說明ORF019蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)且具有良好的反應(yīng)原性.

M：蛋白Marker； 1：pET-32a-ORF019 IPTG誘導(dǎo)后；2：pET-32a-ORF019誘導(dǎo)前；3：pET-32a(+)IPTG誘導(dǎo)后；4：pET-32a(+)誘導(dǎo)前.M：Protein Marker；1：pET-32a-ORF019 after IPTG induction；2：before pET-32a-ORF019 induction；3：After pET-32 a (+) IPTG induction；4：Before pET-32a (+) induction.圖8 pET-32a-ORF019 蛋白 Western-blot 檢測Figure 8 Western-blot detection of pET-32a-ORF019 protein

3 討論

ORFV QH02/2010株ORFV019基因在ORFV不同毒株間一致性比較高，該基因具有相對較高的保守性，在副痘病毒屬和脊椎動物痘病毒之間的一致性比較低.研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)傳代的衰減過程中，就會伴隨著基因組的重新排列或者基因片段的丟失，這種現(xiàn)象已經(jīng)在許多的痘病毒上證實，同樣在ORFV上同樣也有基因組片段刪除的報道[15,19-20].因此堿基的缺失或者重排而導(dǎo)致ORFV QH02/2010株與德國分離株D1701親緣性最高.結(jié)合痘苗病毒(vaccinia virus，VACV)的E2L基因的研究，其存在于成熟的病毒粒子中，且E2L蛋白的缺失會導(dǎo)致病毒粒子轉(zhuǎn)運(yùn)的嚴(yán)重抑制，并會使病毒毒力降低[21].ORF019編碼蛋白與VACV E2L蛋白的結(jié)構(gòu)相似，從而推測ORF019基因分子參與了細(xì)胞融合，對病毒粒子的轉(zhuǎn)運(yùn)有抑制作用.目前對于ORF019編碼蛋白的研究尚未系統(tǒng)開展，因此，本研究旨在通過對ORFVORF019基因的克隆及其系列分析，進(jìn)一步明確其在副痘病毒屬(Parapoxvirus)成員，以及與脊椎動物痘病毒亞科其他痘病毒間的保守性，并通過其在原核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)，獲取重組表達(dá)產(chǎn)物，為進(jìn)一步研究ORFVORF019基因編碼蛋白的生物學(xué)功能和對疫苗的研究奠定基礎(chǔ).

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET32a-ORF019，在原核表達(dá)系統(tǒng)對ORF019編碼的蛋白進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)和純化，其重組蛋白的大小約為100 ku，證實其以包涵體的形式存在.用Western-blot證實ORF019編碼蛋白具有良好的反應(yīng)原性.