段明慧，阮培均，方婷，鄒濤，王永，成忠均，葛發(fā)歡，*

（1.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510006；2.中山大學(xué)南沙研究院，廣東廣州511458；3.畢節(jié)市中藥研究所，貴州畢節(jié)551700）

薔薇屬植物在國內(nèi)約有95種，主要分布于北溫帶至亞熱帶高山地區(qū)。其花香怡人，果實(shí)酸甜可口、富含多種維生素。薔薇果具有較高的綜合利用價(jià)值，因其營養(yǎng)價(jià)值豐富，可作為食用果并加工成系列產(chǎn)品[1-2]，其中部分品種具有藥用價(jià)值可對人體起到保健養(yǎng)生作用[3]，如金櫻子就是常用的中藥材。但多數(shù)薔薇果屬于野生或半野生狀態(tài)，甚至有些仍處于未被研究開發(fā)的狀態(tài)，限制了其利用與發(fā)展。

毛葉薔薇（Rosa mairei Levl.）俗稱糖瑯果、昭通山石榴，系薔薇科薔薇屬野生植物，分布于貴州、四川、云南、西藏等地。毛葉薔薇為矮小灌木，生長于海拔1 400 m～2 800 m坡陽處或闊葉林、混交林的林緣。其花為淡黃色小花，香氣清新，接近于玫瑰花香[4]。一些相關(guān)文獻(xiàn)對其花中香氣成分進(jìn)行了研究，得出其花可作為一種植物香料被開發(fā)利用[5]。毛葉薔薇成熟果實(shí)為鮮紅色，常作為野果被食用，但目前針對其果實(shí)的相關(guān)研究較少。毛葉薔薇其分布廣泛，資源豐富，但仍然沒有對其進(jìn)行良好的開發(fā)利用。本文對毛葉薔薇成熟鮮果進(jìn)行營養(yǎng)成分及抗氧化活性研究，可為毛葉薔薇果實(shí)的綜合開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛葉薔薇果（Rosa mairei Levl.），采摘時(shí)間：2017年6月，采摘地點(diǎn)：貴州省畢節(jié)市，由貴州省畢節(jié)市中藥研究所阮培均研究員鑒別；維生素C（100425-201504）、蘆?。?00080-201409）、沒食子酸（110831-201605）：中國藥品生物制品檢定所；牛血清白蛋白（A104912）、鄰苯二甲醛、芴甲氧羰酰氯：阿拉丁試劑公司；鋁等多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（GSB 04-1767-2004）：國家有色金屬及電子材料分析測試中心；乙腈（色譜級）：德國默克公司；總抗氧化能力測定試劑盒（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）：碧云天生物技術(shù)有限公司；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼 （2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、福林酚試劑（Folin－Ciocalteu）：美國Sigma公司；硫酸、苯酚、硫酸銅、硫酸鉀、鹽酸、磷酸氫二鈉、過硼酸鈉、過氧化氫、95%乙醇、三氯化鋁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、丙酮、碳酸氫鈉、氯化鈉（均為分析純）：廣州分析試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600紫外-可見光分光光度計(jì)：日本島津公司；UltiMate 3000高效液相色譜儀：美國戴安公司；XS205 DualRange分析天平：梅特勒-托力多儀器有限公司；RE-501恒油水油浴鍋：上海予華儀器有限公司；Agilent 7700x ICP-MS電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：美國安捷倫公司；WX-8000微波消解儀：上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司；k9860凱氏定氮儀：海能儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

稱取新鮮毛葉薔薇果200g，清洗晾干，勻漿，過濾，取濾液并于4℃冰箱保存，供營養(yǎng)成分及抗氧化活性試驗(yàn)。

1.3.2 營養(yǎng)成分含量測定

1.3.2.1 多糖含量測定

采用分光光度法測定[6]，取1mL樣品液，置于10mL具塞試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，再加入硫酸5 mL，搖勻，置沸水浴中加熱20 min，取出，置冰浴中冷卻5 min，以相應(yīng)試劑為空白，檢測波長為488 nm。

1.3.2.2 蛋白含量測定

采用凱式定氮法測定[7]，取烘干后樣品0.1 g與催化劑5 g（硫酸銅0.5 g+硫酸鉀4.5 g）加入消化管底部，加入濃硫酸8 mL，放入消化爐中進(jìn)行消化先210℃加熱30 min，然后升溫420℃加熱2 h。將消化完成后的樣品利用凱氏定氮儀中進(jìn)行蛋白含量測定。

1.3.2.3 維生素C含量測定

采用高壓液相色譜（high pressure liquid chromatography，HPLC）方法測定，將濾液稀釋到適宜濃度，進(jìn)行HPLC測定，色譜柱為：依利特Hypersil ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相 A：0.05 mol/L磷酸；流動相B：甲醇；流動相比例為：A ∶B=95∶5（體積比）；流速 1.0 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL，柱溫 30 ℃；檢測波長254 nm。

1.3.2.4 水分含量測定

采用恒重法進(jìn)行，取適量鮮果，放入干燥箱內(nèi)80℃烘24 h以上，稱量至恒重。水分含量/%=（恒重前樣品質(zhì)量-恒重后樣品質(zhì)量）/恒重前樣品質(zhì)量×100。

1.3.2.5 氨基酸含量測定

采用HPLC方法測定，并做適當(dāng)修改[8]，取適量鮮果（1.6 g），加 6 mol/L的鹽酸（4 mL）置于安瓿瓶中，封口，放入恒溫烘箱于110℃水解反應(yīng)約10 h，冷卻，再把安瓿瓶中的樣品用水轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)盟芙舛ㄈ?5 mL，搖勻，過濾，進(jìn)行測定分析。色譜柱為：Agilent HPH-C18（24.6 mm×100 mm，5 μm），流動相 A：甲醇 ∶乙腈 ∶水=45∶45∶10（體積比），流動相B：10 mmol Na2HPO4+10 mmol NaBO3（pH=8.2），梯度洗脫條件：0～13.4 min，98%～43%B；13.4 min～15.5 min，43%～0%B；15.5 min～17.7 min，0%B；17.7 min～18.2 min，0～98%B；18.2 min～20 min，98%B；流速1.2 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL，柱溫 40 ℃，檢測波長：一級氨基酸：激發(fā)波長=340 nm，發(fā)射波長=450 nm；二級氨基酸：脯氨酸，激發(fā)波長=266 nm，發(fā)射波長=305 nm；衍生化試劑：一級氨基酸：鄰苯二甲醛（20 mg/mL）；二級氨基酸：芴甲氧羰酰氯（1 mg/mL）。

1.3.2.6 微量元素含量測定

取適量鮮果（1 g）于聚四氟乙烯消解管中，加入4 mL濃硝酸，1 mL過氧化氫，放置30 min后，放入微波消解儀中消解。消解完全后，消解液轉(zhuǎn)移到25 mL比色管中，并用超純水定容到刻度，同法制備全流程空白。在電感耦合等離子體質(zhì)譜儀上測定[9]。高頻發(fā)生器輸出功率：1.55 kW；反饋功率＜10 W；采樣深度：8 mm；霧化器：MicroMist；霧化室溫度：2 ℃；等離子體氣（氬氣）：15.0 L/min，載氣（氬氣）：0.8 L/min，補(bǔ)償氣（氬氣）：0.4 L/min；碰撞氣：氦氣，4.3 mL/min（He模式）。

1.3.2.7 總黃酮含量測定

取適量濾液（1 mL）液于10 mL容量瓶中，加入0.3 mL 5%NaNO2溶液，振動后放置6 min，加入0.3 mL 10%Al（NO3）3溶液，振動后放置6 min，加入4 mL 4%NaOH溶液，加入水至刻度，振動后放置15 min，即得。在紫外波長510 nm進(jìn)行掃描[10]。

1.3.2.8 總酚含量測定

取適量濾液（40 μL），加入稀釋10倍福林酚試劑1.8 mL，振動后室溫放置5 min，加入1.2 mL 7.5%碳酸鈉溶液，振動后室溫避光放置1.5 h，即得。在紫外波長765 nm進(jìn)行掃描[11]。

1.3.3 抗氧化活性測定

1.3.3.1 DPPH自由基的清除率測定

分別吸取適當(dāng)濾液，以超純水稀釋的體積分?jǐn)?shù)為100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.13%及 1.56%的樣品液，在避光的條件下，取分別取樣品液（0.1 mL）加入1.4 mL乙醇，再與1 mL 0.004%DPPH溶液混合，混合均勻后放置70 min，反應(yīng)完成后在紫外波長517 nm處對反應(yīng)液進(jìn)行測定[12]。計(jì)算公式：

抗氧化能力（Ip）/%=[（AB-AA）/AB]×100

式中：AB及AA為70 min后空白及待測樣的吸光值。

1.3.3.2 FRAP總抗氧化能力測定

分別吸取適當(dāng)濾液，以超純水稀釋的體積分?jǐn)?shù)為100%、50%、25%及12.5%的樣品液，按照FRAP試劑盒的說明配制成FRAP工作液。取分別吸取樣品液10 μL與200 μL的FRAP工作液均勻混合，在37℃條件下反應(yīng)5 min，在紫外波長593 nm處進(jìn)行吸光度測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛葉薔薇果實(shí)的主要營養(yǎng)成分含量

針對毛葉薔薇可食用果實(shí)進(jìn)行主要營養(yǎng)成分含量測定，包括有蛋白質(zhì)含量，多糖含量，維生素C含量，水分含量及花青素含量等。具體試驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.1.1 蛋白質(zhì)的含量

蛋白質(zhì)為人體所必須的營養(yǎng)素，是構(gòu)成果實(shí)營養(yǎng)成分的重要組成，是一切生命的物質(zhì)基礎(chǔ)[15-16]。對比動物蛋白質(zhì)成分來說，植物中的蛋白質(zhì)往往具有較低的飽和脂肪及膽固醇，更有利于人體的健康。從表1中可以看出，小果薔薇果實(shí)中蛋白質(zhì)含量最高，其次為香蕉中蛋白質(zhì)含量。毛葉薔薇果實(shí)（0.5%）、金櫻子果實(shí)（0.6%）則與其他水果如蘋果、西瓜、柑橘中蛋白質(zhì)含量相近。

2.1.2 多糖的含量

糖為果實(shí)中的主要組成成分，同時(shí)其也是人體所需能量的主要供給源[1]。多糖含量為果品風(fēng)味品質(zhì)的主要指標(biāo)[17]。與表1中其他水果對比，毛葉薔薇果實(shí)中多糖含量相對較低，其果實(shí)甜度亦相對較低。適宜糖尿病患者食用。

2.1.3 水分的含量

水分為果實(shí)中重要組成成分，雖不可當(dāng)作營養(yǎng)素，但其可影響果實(shí)的鮮度、硬度及口感，具有十分重要的生理意義[1]。與此同時(shí)果實(shí)中水分的含量亦可影響果實(shí)是否容易腐敗變質(zhì)，對于保證果實(shí)的運(yùn)輸及保鮮期起著重要的作用[18]。從表1中可以看出，對比薔薇科薔薇屬果實(shí)，毛葉薔薇果實(shí)中水分含量最高為91%，小果薔薇與金櫻子果實(shí)水分含量相近。相對于其他兩種薔薇科果實(shí)來說，毛葉薔薇果實(shí)色澤更為鮮艷，口感更為脆爽。但相對不宜運(yùn)輸，易腐敗變質(zhì)，其可能為限制毛葉薔薇果實(shí)開發(fā)利用的主要原因。

2.1.4 維生素C的含量

維生素C又稱抗壞血酸，為一種活性較強(qiáng)的天然還原劑。維生素C可參與人體重要的生命活動，其可防止自由基對人體產(chǎn)生的氧化損傷，提高人體免疫力及機(jī)體應(yīng)急能力、參與膠原蛋白合成、預(yù)防動脈硬化及治療壞血病等[18]。人體內(nèi)無法自身合成維生素C，需從食物中獲取維生素C。天然維生素C在吸收及功效上均優(yōu)于合成類抗氧化劑。隨著人們保健意識的增強(qiáng)，對天然維生素C的需求日益增高，尋求天然維生素C資源成為當(dāng)前研究人員關(guān)注的一個(gè)重要問題。金櫻子在薔薇科薔薇屬果實(shí)中具有較高維生素C含量。從表1中可以得出，毛葉薔薇果實(shí)中維生素C含量雖低于金櫻子，但其高于小果薔薇果實(shí)及日常食用水果（蘋果、西瓜、柑橘、香蕉）。毛葉薔薇果實(shí)可作為一種富含維生素C資源被開發(fā)成日常食用水果，進(jìn)行綜合利用。

2.2 毛葉薔薇果實(shí)的氨基酸含量

毛葉薔薇果實(shí)的氨基酸含量見表2。

表2 毛葉薔薇果實(shí)的氨基酸含量Table 2 The amino acid content and composition of Rosa mairei Levl. mg/100 g

氨基酸為組成生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本單位，其中人體必需氨基酸為人體不能合成或合成速度無法滿足機(jī)體所需，必須通過食物來攝取。經(jīng)測定，毛葉薔薇果實(shí)中含量16種氨基酸（如表2）。氨基酸總量為323.9 mg/100 g，其中人體必需氨基酸含量為占氨基酸含量41%以上。賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸及亮氨酸含量相對較高。從毛葉薔薇果實(shí)測定的氨基酸組成及含量可以看出，其具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。

2.3 毛葉薔薇果實(shí)的礦質(zhì)元素含量

礦質(zhì)元素是人體生長發(fā)育的必需元素，其只能通過從食物吸收獲得，因而食物中礦質(zhì)元素含量亦可作為評價(jià)其品質(zhì)的指標(biāo)。毛葉薔薇果實(shí)的礦質(zhì)元素含量見表3。

從表3中可以得出，毛葉薔薇果實(shí)中含富含K、Ca、Mg、P 含量分別為 1 180、321、118、150 mg/kg，含 Na含量為13.5 mg/kg，屬于典型的高鉀低鈉食物，適宜高血壓患者以及預(yù)防高血壓的健康人群食用。微量元素與人體的健康及疾病均有這密切的關(guān)系，它的含量在一定范圍內(nèi)可保持機(jī)體健康，若微量元素?cái)z入量超過機(jī)體所需范圍時(shí)，機(jī)體正常功能將會受到不良影響。重金屬元素砷、汞、鉛、鎘以及氟和亞硝酸鹽等有害物質(zhì)會影響果實(shí)質(zhì)量安全。國家無公害食品水果、蔬菜的質(zhì)量安全限量要求（As≤0.10 mg/kg，Hg、Cd、F 均 ≤0.05 mg/kg，Pb≤0.5 mg/kg，NaNO2≤4.0 mg/kg），毛葉薔薇果實(shí)質(zhì)量安全指標(biāo)完全符合該標(biāo)準(zhǔn)，屬于可食安全范圍[9，13]。

表3 毛葉薔薇果實(shí)的礦質(zhì)元素含量Table 3 Different elements and element contents of Rosa mairei Levl.

2.4 毛葉薔薇果實(shí)總黃酮、總酚及抗氧化活性研究

人體內(nèi)氧化代謝反應(yīng)會產(chǎn)生各種自由基，過量的自由基可與游離或結(jié)合狀態(tài)下的不飽和脂肪酸作用，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞生物膜，從而對機(jī)體產(chǎn)生一定的危害，如疾病的發(fā)生和衰老。因此，通過食用的方式向機(jī)體中引入一些外源性的自由基清除劑是非常必要的。

天然水果中不僅含有蛋白質(zhì)、糖、氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，還含有許多生物活性成分，如酚類化合物和黃酮類化合物等，其均為較好的自由基清除能力，具有一定保護(hù)人體健康的功能。因此，研究天然水果中總酚、總黃酮含量及其抗氧化活性具有重要的意義。分別對毛葉薔薇果汁中總黃酮、總酚含量進(jìn)行測定，同時(shí)通過DPPH自由基清除率及FRAP總抗氧化能力的測定試驗(yàn)考察其抗氧化能力。

2.4.1 毛葉薔薇果總酚、總黃酮含量測定

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，植物中酚酸類成分及黃酮類成分均具有較好的自由基清除能力，是近些年來天然抗氧化劑研究的熱點(diǎn)之一。植物的抗氧化活性亦跟其內(nèi)總酚總黃酮含量存在一定的關(guān)系。采用沒食子酸為當(dāng)量對照，測定標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.514 8x+0.024 5，R2=0.999 1（式中：y為吸光度值；x為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度），毛葉薔薇果中總酚含量為972.076 GAE μg/mL，其總酚含量高于儲大可等[20]測定市面上14種果汁總酚含量，高于季露等[21]測定不同柑橘品種果汁總酚酸含量。采用蘆丁為當(dāng)量對照，測定標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=11.579x+0.004 2，R2＝0.999 8（式中：y為吸光度值；x為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度），毛葉薔薇果中總黃酮含量為296.917 RE μg/mL，其總黃酮含量高于季露等[21]測定不同柑橘品種果汁總黃酮含量。說明毛葉薔薇果具有含量相對高的總酚酸及總黃酮含量。

2.4.2 毛葉薔薇果體外抗氧化能力測定

本文分別采用兩種不同體外抗氧化方法（DPPH自由基清除能力法及FRAP總抗氧化能力測定法）評估毛葉薔薇果汁的體外抗氧化活性。

DPPH自由基清除能力法是一種常用于測定天然植物活性成分體外抗氧化活性的方法，具有操作簡單、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。DPPH自由基在乙醇溶液中呈紫色，且在517 nm處有較強(qiáng)吸收。當(dāng)在DPPH溶液中加入自由基清除劑時(shí)，DPPH的單電子被配對，溶液顏色變淺，最大吸收波長處的吸光度變小，吸光度的變小程度與配對電子數(shù)成劑量關(guān)系[22]。因此，對DPPH自由基的清除能力越大，其抗氧化能力越強(qiáng)。圖1為不同稀釋倍數(shù)毛葉薔薇濾液對DPPH自由基清除率的效果。

圖1 毛葉薔薇果DPPH自由基清楚能力測定Fig.1 DPPH radical-scavenging activities of Rosa mairei Levl.

從結(jié)果中可以看出，隨著毛葉薔薇果濾液體積分?jǐn)?shù)的增加DPPH自由基清除率逐漸提高，毛葉薔薇果濾液體積為50%時(shí)其自由基清除率可達(dá)90%以上，其結(jié)果與1 mg/mL維生素C體積分?jǐn)?shù)為50%效果相當(dāng)，且趨于穩(wěn)定。試驗(yàn)結(jié)果可以說明，毛葉薔薇濾液DPPH自由基清除能力與1 mg/mL濃度的維生素C效果相近，有較好的體外抗氧化能力。

圖2為不同體積分?jǐn)?shù)毛葉薔薇果濾液FRAP總抗氧化能力測定結(jié)果。

FRAP總抗氧化能力測定法其原理基于氧化還原反映，在酸性條件下，F(xiàn)e3+與TPTZ絡(luò)合形成復(fù)合物，在有還原性物質(zhì)存在時(shí)，可將復(fù)合物Fe3+還原為Fe2+，使得溶液變?yōu)樗{(lán)色，在593 nm處有最大吸收，吸光度的變化與還原物質(zhì)的含量呈劑量關(guān)系。從結(jié)果中可以看出隨著濾液體積分?jǐn)?shù)的增加FRAP測定結(jié)果越高，說明其內(nèi)包含還原性物質(zhì)越多。當(dāng)毛葉薔薇果濾液體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)其FRAP總抗氧化能力測定結(jié)果為8.184 mmol/mL FeSO4，水溶性維生素 E（1mg/mL）結(jié)果為1.937mmol/mLFeSO4，毛葉薔薇果濾液的FRAP總抗氧化能力是陽性對照水溶性維生素E（Trolox）4.2倍。說明毛葉薔薇果具有相對較高的總抗氧化能力。

圖2 毛葉薔薇果FRAP總抗氧化能力測定Fig.2 FRAP assay of different Rosa mairei Levl.

3 結(jié)論

本文對毛葉薔薇果其營養(yǎng)成分進(jìn)行測定，包括水分含量，蛋白質(zhì)含量，多糖含量，氨基酸含量，礦質(zhì)元素含量，維生素C含量及花青素含量等。其結(jié)果表明，毛葉薔薇果富含多種營養(yǎng)成分，適宜作為一種新型水果資源被開發(fā)。同時(shí)本文對毛葉薔薇果總黃酮含量、總酚酸含量及體外抗氧化活性進(jìn)行了研究。從結(jié)果中可以看出毛葉薔薇果擁有相對較高的總黃酮及總酚酸含量，且具有良好的抗氧化活性，其DPPH自由基清楚效果與維生素C（1 mg/mL）效果相近，F(xiàn)RAP總抗氧化能力測定其結(jié)果遠(yuǎn)高于陽性對照Trolox（1 mg/mL），說明毛葉薔薇果可作為一種天然抗氧化資源被深度開發(fā)利用。