劉超，陳俊榮，于春濤

（滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河北滄州061001）

黃芪是豆科植物蒙古黃芪或莢膜黃芪的根，具有補氣固表、利水退腫、托毒排膿、生肌等功效[1]。黃芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）是從中藥黃芪中提取的生物活性成分之一，具有增強免疫系統(tǒng)功能、抗炎癥、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老、降血糖等作用，在糖尿病和心血管疾病防治中也起著重要作用[2]。對于黃芪發(fā)酵方式的研究以液體發(fā)酵為主，固體發(fā)酵的研究相對較少。固體發(fā)酵具有操作簡便，能耗低，發(fā)酵過程易控制，對無菌要求相對較低，不易發(fā)生大面積污染等優(yōu)點[3-4]。黃芪中的有效成分黃芪甲苷經(jīng)食藥用真菌固體發(fā)酵后發(fā)生一定程度的轉(zhuǎn)化，且具有增效作用[5-6]。黃芪渣經(jīng)固體發(fā)酵后可有效降解纖維素，促進黃芪甲苷的析出，在動物飼料生產(chǎn)中具有重要意義[7-8]。用于黃芪固體發(fā)酵的菌種較廣泛，有靈芝、桑黃、香菇、蟲草菌、乳酸菌、芽孢桿菌等。黑曲霉是重要的發(fā)酵工業(yè)菌種，可生產(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、檸檬酸、葡糖酸和沒食子酸等，還可利用黑曲霉得到苷元[9]。

本文以黃芪粗多糖的含量為響應(yīng)值，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用統(tǒng)計軟件Design-Expert中響應(yīng)面法的Box-Behnken模式，對黑曲霉固體發(fā)酵黃芪工藝進行研究[10-11]，為黃芪的開發(fā)與利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BS 223S分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KN-130萬能粉碎機：長沙康寧電子科技有限公司；超凈工作臺：海爾股份有限公司；MJ-78A全自動滅菌鍋：施都凱儀器設(shè)備有限公司；HWS恒溫恒濕培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司；756S/759S紫外可見分光光度計：上海棱光技術(shù)有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；101A-2恒溫鼓風(fēng)干燥箱：常州金壇良友儀器有限公司；ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智誠科技有限公司。

1.2 材料

黃芪：安國藥材市場，經(jīng)鑒定為蒙古黃芪；黑曲霉：滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥物研究所；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；D-無水葡萄糖（99.9%）：中國食品藥品檢定研究院；其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 菌種培養(yǎng)

配制PDA瓊脂斜面培養(yǎng)基，在超凈工作臺上將保藏的黑曲霉菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌種管內(nèi)黑曲霉長滿孢子，即得活化菌種。從PDA斜面培養(yǎng)基上取適量的黑曲霉孢子，用無菌水制成1×108孢子/mL的懸濁液，取1 mL接種于100 mL PDA液體培養(yǎng)基中，并于28℃、160 r/min培養(yǎng)24 h，得種子液用于接種發(fā)酵[12]。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物制備

將黃芪干燥，粉碎，精確稱量50.0 g黃芩藥材粉末，置入250 mL錐形瓶，加入75 mL蒸餾水，混勻，121℃高壓滅菌20 min，即得含水量60%的黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基。按一定接種比例將黑曲霉菌液接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在一定溫度下恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時間后取出，用于多糖含量的測定。

2.3 發(fā)酵工藝單因素試驗

2.3.1 發(fā)酵時間對黃芪多糖含量的影響

按5%接種量將種子液接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)，發(fā)酵時間分別為 3、5、7、9、11 d ，測定發(fā)酵產(chǎn)物多糖含量。

2.3.2 發(fā)酵溫度對于黃芪多糖含量的影響

按5%接種量將種子液接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng) 7 d，發(fā)酵溫度分別為 20、24、28、32、36 ℃，測定發(fā)酵產(chǎn)物多糖含量。

2.3.3 接種量對于黃芪多糖含量的影響

按接種量分別為1%、3%、5%、7%、9%，將種子液接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)7 d，測定發(fā)酵產(chǎn)物多糖含量。

2.4 響應(yīng)面分析試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度這3個因素為自變量。根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計原理，進行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，因素水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表Table 1 Factors and levels of the response surface design

2.5 黃芪多糖含量測定

準(zhǔn)確稱取減壓、干燥至恒重的葡萄糖20 mg，置入100 mL的量瓶，加水配制成0.2 mg/mL的葡萄糖溶液。分別吸取對照品溶液 1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0 mL，置入25.0 mL量瓶，加水稀釋至刻度，各精密吸取2.0 mL，置入具塞試管，加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，再垂直迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻。室溫靜置10 min，沸水浴15 min，冷卻后在490 nm波長處測吸光度。根據(jù)測定的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品梯度稀釋500倍，稀釋后取2 mL置入具塞管，用同樣的方法測定吸光度，計算發(fā)酵樣品中多糖含量[13-14]。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗結(jié)果

3.1.1 發(fā)酵時間對黃芪多糖含量的影響

發(fā)酵時間對黃芪多糖含量的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵時間對多糖含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on polysaccharides content

由圖1可見，發(fā)酵前期主要為菌體增長階段，中后期主要為代謝物質(zhì)積累階段，7 d前發(fā)酵液中多糖含量隨發(fā)酵時間的增長而增高，至7 d時達最高。但當(dāng)發(fā)酵時間再增加時，多糖含量卻有略微下降。分析原因為培養(yǎng)前期，發(fā)酵培養(yǎng)基中營養(yǎng)充足，菌體生長達到一定階段產(chǎn)生大量多糖，但隨著培養(yǎng)基的不斷消耗，出現(xiàn)營養(yǎng)供給不足現(xiàn)象，黑曲霉菌體生長消耗部分多糖，使其含量下降。

3.1.2 發(fā)酵溫度對黃芪多糖含量的影響

發(fā)酵溫度對黃芪多糖含量的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對多糖含量的影響Fig.2 Effect of temperature on polysaccharides content

由圖2可見，溫度對黃芪發(fā)酵產(chǎn)物中多糖含量的影響明顯，低溫和高溫都不適于代謝產(chǎn)物的積累。當(dāng)溫度低于28℃時，多糖含量隨溫度的升高而逐漸增加，超過28℃后，多糖含量下降，尤其超過32℃后，多糖含量下降明顯。此結(jié)果說明黑曲霉發(fā)酵黃芪的適宜溫度為28℃左右，高溫和低溫都不適合黑曲霉發(fā)酵。

3.1.3 接種量對黃芪多糖含量的影響

接種量對黃芪多糖含量的影響見圖3。

由圖3可見，隨著接種量的不斷增加，黑曲霉發(fā)酵黃芪多糖含量逐漸增大，接種量為5%時，多糖含量達最大，然后隨接種量的增大，多糖含量開始逐漸降低。分析原因為：接種量小于5%時，隨接種量的增加，發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉數(shù)量不斷增加，多糖產(chǎn)量增高。當(dāng)接種量大于5%時，發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉數(shù)量過多，需氧量增大，對培養(yǎng)基營養(yǎng)成分消耗加快，導(dǎo)致多糖含量下降。結(jié)果表明黑曲霉產(chǎn)黃芪多糖的最佳接種量為5%。

圖3 接種量對多糖含量的影響Fig.3 Effect of inoculum concentration on polysaccharides content

3.2 發(fā)酵工藝響應(yīng)面分析試驗

3.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立及顯著性檢驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量3個因素為自變量，以黃芪多糖含量為響應(yīng)值，采用Design-Expert回歸分析軟件進行三因素三水平的試驗設(shè)計，共包含17組試驗方案。響應(yīng)面分析試驗和結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis

分析表2中17個試驗點的響應(yīng)值，對表2試驗數(shù)據(jù)進行綜合分析，各因素對多糖含量的影響可用如下回歸方程表示：多糖含量Y=85.47+1.42×A+2.07×B+1.11×C+0.53×AB-0.29×AC-1.73×BC-5.49×A2-6.38×B2-9.59×C2。

回歸分析見表3。

通過對模型進行方差分析可見：P模型＜0.000 1，表明模型差異極顯著；多糖含量失擬項P=0.964 9，表明失擬不顯著，所選用的二次回歸模型是適當(dāng)?shù)模粚δＰ瓦M行回歸方程系數(shù)顯著性檢驗，得到模型一次項B（P＜0.01）差異極顯著，一次項 A、C（P＜0.05）差異顯著，其影響強弱的排序為：發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞接種量。

3.2.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面曲面圖和等高線圖，響應(yīng)面圖形能直觀地反映各因素及其交互作用對響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值Y與試驗因素A、B、C相對應(yīng)構(gòu)成的三維空間曲線圖，試驗結(jié)果見圖4。

表3 擬合二次多項式模型的方差分析Table 3 Variance analysis of response surface quadratic mode

圖4 各因素交互作用對多糖含量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour line showing the effects of two factors on polysaccharides contents

響應(yīng)面的曲線圖中，各因素間交互作用越強，曲線走勢越陡，其影響越顯著；交互作用越小，曲線走勢越平滑，其影響越小。由圖4可見，發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和接種量3個因素相互之間的交互作用較強，隨著任意兩個變量的增加均呈上升趨勢，當(dāng)達到某一峰值后，曲面下降，通過響應(yīng)面圖能夠觀察出最高點。

3.2.3 驗證試驗

通過對回歸模型方程求解，得出黃芪固體發(fā)酵多糖最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵時間7.27 d，發(fā)酵溫度28.65℃，接種量5.08%，在此條件下多糖預(yù)計含量為85.75mg/g。為了便于試驗，把發(fā)酵參數(shù)進行調(diào)整如下：發(fā)酵時間7.3 d，發(fā)酵溫度28.5℃，接種量5%，進行3組平行試驗，所得多糖的含量的分別為84.87、85.24、83.10 mg/g，其平均值84.74 mg/g，與理論值誤差為1.57%，表明該回歸方程可用于實踐。

4 結(jié)論

黃芪多糖是黃芪中重要的活性成分之一，具有來源豐富、價格低廉、長期使用對組織細(xì)胞毒副作用小、殘留低的特點，在人類和動物疾病防治方面具有廣闊的前景。本文采用Design-Expert軟件，以黃芪粗多糖的含量為響應(yīng)值，在單因素試驗基礎(chǔ)上，優(yōu)化了黑曲霉固體發(fā)酵黃芪工藝。通過響應(yīng)面分析得到多糖含量和發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量因素的模型方程，各因素影響強弱順序為：發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞接種量，由模型得最佳發(fā)酵工藝條件及預(yù)測多糖含量為85.75 mg/g。調(diào)整發(fā)酵參數(shù)為發(fā)酵時間7.3 d，發(fā)酵溫度28.5℃，接種量5%，進行驗證試驗，經(jīng)過3組平行試驗，所得多糖含量平均值84.74 mg/g，與理論值接近，表明該模型可較好地應(yīng)用于黃芪固體發(fā)酵工藝的優(yōu)化。