王敏，席志文，黃琳娜，惠豐立

（南陽師范學院生命科學與技術(shù)學院，河南南陽473061）

乳糖在牛奶中的含量極為豐富，乳糖酶能將其水解成被人體直接吸收的半乳糖和葡萄糖，為機體的生命活動提供能量。研究表明，很多消費者由于體內(nèi)缺乏乳糖酶，不能將食物中的乳糖分解[1-2]，尤其是飲用牛奶之后會產(chǎn)生如腹痛、腹脹、水樣大便、嘔吐等不適癥狀。乳糖不耐受癥在嬰幼兒中也較為常見，腹瀉嬰兒和新生兒中乳糖不耐受癥分別占46.95%～70.00%和5.17%～27.30%[3-4]。利用乳糖酶生產(chǎn)的低乳糖制品不僅其營養(yǎng)成分有利于人體吸收，而且乳制品的風味和品質(zhì)也能得到很大改良。因此乳糖酶在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域都有很高的應(yīng)用價值。

乳糖酶的來源非常廣泛，動物、植物、微生物均可產(chǎn)生乳糖酶，隨著發(fā)酵技術(shù)的不斷進步，微生物表達乳糖酶具有較大的潛能。目前微生物法生產(chǎn)存在酶表達量低、胞內(nèi)分泌乳糖酶使得后續(xù)純化工藝復(fù)雜和酶回收率低等缺點，導致其無法進行大規(guī)模的生產(chǎn)和應(yīng)用[5-7]。自2005年米曲霉全基因組的破譯以來，結(jié)合基因工程技術(shù)使得米曲霉在食品領(lǐng)域的應(yīng)用更加廣泛[8-9]。歐軍[10]研究表明，米曲霉原始菌株可胞外分泌乳糖酶，耐高溫，酶學性質(zhì)好，但酶活性較低，僅有2.34 U/mL。李淑娟[11]將黑曲霉Asperillus DL116乳糖酶基因電轉(zhuǎn)到畢赤酵母中，甲醇誘導發(fā)酵12 d后，乳糖酶活性達到271.15 U/mL。張偉等[12]將亮白曲霉乳糖酶基因電轉(zhuǎn)至畢赤酵母中，在5 L發(fā)酵罐中利用甲醇誘導表達乳糖酶，120 h后酶活性達到3 600 U/mL。侯重文等[13]將米曲霉乳糖酶基因在畢赤酵母中表達，并對其培養(yǎng)基進行優(yōu)化，搖瓶發(fā)酵72 h后酶活達到672 U/mL。但畢赤酵母在發(fā)酵過程中溶氧和甲醇需求量高，且甲醇有毒、易燃，存在非常大的安全隱患。采用基因工程等技術(shù)手段，構(gòu)建適宜的乳糖酶基因表達體系，是實現(xiàn)乳糖酶工藝化生產(chǎn)的關(guān)鍵[14]。目前酵母菌是工業(yè)上最常用的真核表達系統(tǒng)，其產(chǎn)物多為胞外分泌，對后續(xù)的加工處理有很大的便利。因此，尋求更加有效的表達系統(tǒng)，直接進行胞外高效分泌表達乳糖酶，對減少后續(xù)純化工藝、降低生產(chǎn)成本具有重要意義，也為乳糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)[15-16]。

近年來，乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）表達體系統(tǒng)受到人們的青睞，獲得了包括美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）在內(nèi)的眾多機構(gòu)的安全認證，證明其表達的乳糖酶和凝乳酶具有極高的安全性[17]。乳酸克魯維酵母工程菌有著超強的胞外分泌表達能力，其工業(yè)發(fā)酵規(guī)模已超過100m3，和其他酵母表達系統(tǒng)相比，乳酸克魯維酵母表達載體pKLAC1帶有非抗生素篩選標記基因乙酰胺酶基因（amdS）[18-19]，篩選和發(fā)酵的過程中均不需要添加抗生素或誘導劑，是表達乳糖酶的理想載體。此外，乳酸克魯維酵母的營養(yǎng)適應(yīng)性較強，為后期發(fā)酵工藝優(yōu)化提供了便利的條件。該研究將米曲霉乳糖酶基因轉(zhuǎn)化到乳酸克魯維酵母表達系統(tǒng)中，得到直接胞外分泌表達的乳糖酶基因工程菌株，為乳糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體

乳酸克魯維酵母GG799：由南陽師范學院能源微生物多樣性實驗室保存；表達載體pKLAC1：NEW England Biolabs公司。

1.1.2 試劑

質(zhì)粒小量提取試劑盒：康寧生命科學有限公司；DNA產(chǎn)物純化試劑盒：Thermo Scientific公司；SacⅡ酶（20 000 U/mL）酵母基本碳源（yeast carbon base，YCB）培養(yǎng)基、乙酰胺溶液（100×）：NEB；酵母基因組DNA抽提試劑盒：生工生物工程有限公司。

鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG）、鄰-硝基苯酚（o-nitro phenol，ONP）、碳酸鈉顆粒、冰醋酸、氫氧化鈉顆粒、95%乙醇、蒸餾水、二硫蘇糖醇（dl-dithiothreitol，DTT）、醋酸鋰、正丁醇、乙醇、丙酮、苯胺、二苯胺、磷酸、無水葡萄糖、乳糖、半乳糖等常用藥品與試劑均是國產(chǎn)分析純或國外進口分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基（luria-bertani culture，LB）：蛋白胨 1%、酵母粉0.5%、氯化鈉1%；YEPD培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YEPD）：酵母粉 1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%。

發(fā)酵培養(yǎng)基：乳糖4%、玉米漿5%、酵母粉6%、硫酸鎂0.1%、硫酸錳0.03%。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備

Gel DOC XR型凝膠成像系統(tǒng)：BioRad公司；Electroporator 2510型電轉(zhuǎn)儀：Eppendorf公司；DYY-12型電泳儀：北京六一儀器廠；TC-512型PCR擴增儀：Techne公司；TU-1900型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器公司；超微量分光光度計：Thermo公司；R124CN型分析天平：奧豪斯儀器有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 目的基因的合成

根據(jù)米曲霉乳糖酶基因序列和乳酸克魯維酵母GG799密碼子的偏愛性，設(shè)計了編碼乳糖酶蛋白的lacA DNA序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并構(gòu)建于載體pKLAC1中。

1.2.2 重組質(zhì)粒的提取及SacⅡ酶切

將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌過夜培養(yǎng)，用小劑量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，通過濃度為1%（10 g/L）的瓊脂糖凝膠電泳對提取質(zhì)粒進行檢測。將成功提取的重組質(zhì)粒pKLAC1-lacA用SacⅡ酶酶切2 h，用普通DNA純化試劑盒來進行回收，通過濃度為1%（10 g/L）的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段的大小。

1.2.3 電轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母GG799[19-20]

利用醋酸鋰∶DTT=1∶9（體積比）制備乳酸克魯維酵母GG799感受態(tài)細胞，通過電脈沖法（電壓為2500V）將線性化的質(zhì)粒DNA片段轉(zhuǎn)化到乳酸克魯維酵母GG799感受態(tài)細胞中。電擊后的酵母細胞立即加入1 mL預(yù)冷的1 mol/L山梨醇溶液中，并收集電轉(zhuǎn)后的酵母溶液。在30℃水浴鍋中處理2 h，離心收集菌體，重懸于1 mL無菌水中，均勻涂布在含有5 mmol/L乙酰胺的YCB平板上，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d～5 d。

1.2.4 標準曲線的制作[21-22]

ONP標準溶液的配制：稱取139.0 mg ONP，先用10 mL濃度為95%乙醇溶解，然后轉(zhuǎn)移至1000 mL容量瓶，蒸餾水定容搖勻。分別準確移取ONP標準制備液 2、4、6、8、10、12、14 mL 至 100 mL 容量瓶中，分別加入25 mL濃度為10%碳酸鈉溶液，再用濃度為0.1 mol/L、pH值為5.2醋酸緩沖液定容，搖勻[22-23]。420 nm處測定每個稀釋液的吸光值，用蒸餾水作空白對照。以420 nm處吸光值為橫坐標，鄰硝基苯酚的濃度為縱坐標，繪制標準曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 乳糖酶酶活標準曲線Fig.1 Standard curve of lactase activity

酶活力單位的定義：一個酶活單位（U）為在反應(yīng)溫度60℃，pH值為5.2的條件下，每分鐘將ONPG分解為1 μmolONP所需的酶量。

1.2.5 高表達菌株的篩選

挑取YCB平板上長勢良好的單菌落接種到48孔板中，微孔板恒溫振蕩器在28℃、600 r/min發(fā)酵96 h。離心獲取發(fā)酵上清液，將上清液用0.1 mol/L、pH值為5.2醋酸鈉緩沖液適量稀釋，ONPG（0.037g/L）2 mL提前預(yù)熱10 min，加入稀釋的發(fā)酵上清液500 μL，60℃保溫15 min，加入2.5 mL10%碳酸鈉溶液終止反應(yīng)并顯色，最加入20 mL蒸餾水稀釋，用分光光度計檢測420 nm吸光值，篩選出獲得高表達量的重組菌株。

1.2.6 重組酵母菌株的PCR鑒定

酵母基因組DNA抽提試劑盒提取重組酵母菌株細胞的全基因組，用全細胞聚合酶鏈式反應(yīng)（poly merase chain reaction，PCR）方法驗證目的基因與宿主細胞染色體整合的情況。以重組酵母菌株基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板，單拷貝整合子的鑒定用引物為：Prochy-inter 1（5`-TACCGACGTATATCAAGCCCA-3`）和Prochy-inter2（5`-ATCATCCTTGTCAGCGAAAGC-3`），多拷貝整合子的鑒定用引物為：Prochy-inter 2（5`-ATCATCCTTGTCAGCGAAAGC-3`）和 Prochy-inter 3（5`-CAGTGATTACATGCATATTGT-3`）。PCR條件為：95℃ 5 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.7 重組酵母菌株的搖瓶表達

挑取重組酵母菌株的單菌落接種于裝有5 mL YEPD液體培養(yǎng)基的試管中，在28℃、200 r/min條件下培養(yǎng)18 h獲得種子液。將種子液全部接種于裝有45 mL/250 mLYEPD液體培養(yǎng)基的搖瓶中，相同條件下培養(yǎng)120 h。每隔12 h取樣，5 000 r/min、離心10 min，菌體適當稀釋用于測定重組菌株的生物量（OD600），發(fā)酵上清液用于測定乳糖酶活力。

1.2.8 十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE）分析表達產(chǎn)物

配制SDS-PAGE溶液：5%的濃縮膠和12%的分離膠，在發(fā)酵時間分別為 12、24、36、48、60、72 h 進行取樣，將發(fā)酵液上清與上樣緩沖液按3∶1體積比混合，沸水浴中加熱10 min，離心去除雜質(zhì)，用考馬斯亮藍染液染色2 h，過夜脫色。

1.2.9 薄層層析法（thin layer chromatography，TLC）檢測重組菌株分泌乳糖酶水解乳糖的產(chǎn)物

展開劑∶水∶乙醇∶正丁醇體積比為 2∶3∶5；顯色劑：配置苯胺—二苯胺顯色液溶液（A液：0.1二苯胺溶于2.5 mL丙酮溶液中；B液：100 μL苯胺溶液溶于2.4 mL丙酮溶液中；然后將A、B液混合，并加入500 μL磷酸，加入磷酸后會產(chǎn)生白色沉淀，搖勻至白色沉淀消失，4℃保存，用于顯色備用[23-24]。配置1%葡萄糖，1%乳糖，1%半乳糖，及1%葡萄糖和半乳糖的混合物。將發(fā)酵120h發(fā)酵液上清與1%乳糖按體積比為1∶1混合，40℃水浴4 h，沸水終止發(fā)應(yīng)，室溫25℃條件下冷卻，備用。

在距硅膠板底部1.5 cm處用鉛筆劃一細橫線，等距離間隔畫出5個標記，放入105℃烘箱中活化30 min，將活化后硅膠板放在足夠干燥的桌面上快速點樣，樣品劑量為3 μL，再將硅膠板烘干。取出硅膠板放入層析缸中，密封隔絕空氣。展開劑自下而上在硅膠板上展開，當展開層的前沿移至硅膠板前沿0.5 cm處，停止展層，取出層析板用電吹風機吹干，均勻的噴灑上顯色劑，放在烘箱中85℃烘干，時刻觀察顏色變化，直至條帶顯色明顯。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2010軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所有試驗數(shù)據(jù)均為3次或3次以上重復(fù)試驗的平均值；并利用Excel 2010軟件繪制作圖。

圖2 lacA天然序列及其優(yōu)化后DNA序列比較Fig.2 Comparison of original and optimized sequences for lacA

2 結(jié)果與討論

2.1 目的基因的合成

根據(jù)乳酸克魯維酵母GG799密碼子的偏愛性，改造米曲霉lacA基因序列的678個基因位點，設(shè)計全長2 982 bp的lacA成熟蛋白編碼序列，如圖2所示。與原始序列相比較，堿基GC含量由原來的51.4%下降至39.2%。改造后的lacA基因能更穩(wěn)定的在乳酸克魯維酵母中高效表達。去除優(yōu)化序列中的引物序列，改造后的乳糖酶基因一共編碼988個氨基酸，表達出的蛋白分子量理論值約為110 kDa。

2.2 重組表達載體pKLAC1-lacA及SacⅡ酶切鑒定

提取已獲得轉(zhuǎn)化子的大腸桿菌中的質(zhì)粒，試驗結(jié)果如圖3所示，圖中泳道“1”出現(xiàn)兩條目的條帶，說明成功提取重組質(zhì)粒。對所提取的質(zhì)粒用SacⅡ酶切，用普通DNA純化試劑盒純化后，產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，試驗結(jié)果如圖4所示，在泳道“1”和“2”中分別出現(xiàn)相同的兩條特異條帶，片段大小接近10 kb和3 kb，說明目的基因成功構(gòu)建在質(zhì)粒pKLAC1中。

圖3 重組表達載體pKLAC1-lacA的提取鑒定Fig.3 Extraction and identification of recombinant expression vector pKLAC1-lacA

圖4 重組表達質(zhì)粒pKLAC1-lacA的SacⅡ酶切鑒定Fig.4 Identification of the recombinant plasmid pKLAC1-lacA by SacⅡdigestion

2.3 多拷貝整合重組菌株的鑒定

用SacⅡ?qū)χ亟M質(zhì)粒pKLAC1-lacA進行線性化處理，以電轉(zhuǎn)化方法將線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)入乳酸克魯維酵母GG799，利用含5 mmol/L乙酰胺的YCB培養(yǎng)基富集篩選整合有表達框的陽性轉(zhuǎn)化子。利用多個表達框插入鑒定整合引物進行全細胞PCR鑒定，分別擴增出了兩條特異性條帶，大小分別約1.9 kb和2.3 kb（圖5），該試驗結(jié)果進一步證實lacA基因片段已成功整合到乳酸克魯維酵母GG799的基因組中，而且菌株lacA-1為多拷貝整合表達框的重組菌株。

圖5 重組工程菌株lacA-1多拷貝整合表達框的PCR鑒定Fig.5 Identification of multi-copy transformants by PCR

2.4 重組菌株生物量及產(chǎn)酶活性

重組菌株lacA-1進行搖瓶發(fā)酵，每隔12 h取樣，測定生物量和乳糖酶活性。重組菌株lacA-1用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵，96 h后進入穩(wěn)定生長期，菌液OD600維持在80左右。產(chǎn)酶曲線滯后于生長曲線，在72 h后產(chǎn)酶量開始呈現(xiàn)明顯上升，120 h進入穩(wěn)定期，乳糖酶酶活為120.65 U/mL，如圖6所示。

圖6 重組菌株lacA-1生長曲線及產(chǎn)酶活力曲線Fig.6 Growth and activity curve of recombinant strain lacA-1

2.5 重組菌株表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析

將乳酸克魯維酵母GG799和經(jīng)轉(zhuǎn)化后篩選的重組菌株lacA-1在發(fā)酵培養(yǎng)基中每隔12 h取樣，取樣6次，離心、取上清，并對樣品進行預(yù)處理，上樣15 μL，進行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖7所示。與空載乳酸克魯維酵母GG799相比，重組菌株lacA-1樣品在分子量約在120 kDa～130 kDa處出現(xiàn)特異性條帶，隨著發(fā)酵時間的增加也呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，而空載乳酸克魯維酵母在此處沒有特異性條帶出現(xiàn)。該乳糖酶蛋白分子量略高于計算所得的米曲霉乳糖酶蛋白理論值。這應(yīng)該是由于該基因片段存在多個糖基化位點，在分泌表達時發(fā)生了糖基化[25-26]，導致該蛋白表觀分子量略高于其理論值。

圖7 不同時間重組工程菌株lacA-1發(fā)酵上清液SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of recombinant K.lactis strain lacA-1 in different times

2.6 乳糖水解產(chǎn)物的TCL分析

以葡萄糖、半乳糖、及兩者的混合物作為對照，處理后的乳糖水解產(chǎn)物分別點樣，顯色，檢測發(fā)酵液的水解產(chǎn)物。由圖8可知，標記為（1）的泳道可看出乳糖溶液被發(fā)酵液水解為葡糖糖和半乳糖，說明該重組菌株lacA-1胞外分泌了乳糖酶，并具有生物活性。

圖8 重組工程菌株lacA-1發(fā)酵液水解乳糖產(chǎn)物的TCL分析Fig.8 TCL detection of hydrolysis lactose of recombinant strain lacA-1

3 結(jié)論

本研究中利用乳酸克魯維酵母GG799為表達系統(tǒng)，將目的基因片段lacA在大腸桿菌中克隆至載體pKLAC1中，獲得乳糖酶基因工程菌。該載體pKLAC1中的真菌乙酰胺酶基因（amdS）可高效篩選整合有表達框的酵母菌，不需要添加任何抗生素。與畢赤酵母表達系統(tǒng)相比，畢赤酵母表達系統(tǒng)在發(fā)酵過程中需要大量甲醇誘導，甲醇為有毒有機物，需要后期除雜，增加了生產(chǎn)流程[27]。該工程菌不僅安全性高，而且能夠胞外分泌乳糖酶，在發(fā)酵過程中不需要添加任何誘導物，工業(yè)化生產(chǎn)中將發(fā)酵液進行超濾即可獲得純酶液，減少了后期處理工藝，能有效降低生產(chǎn)成本，提高酶的回收率。

米曲霉乳糖酶基因具有相對耐熱、耐酸、穩(wěn)定性高等優(yōu)點，本研究首次將優(yōu)化的米曲霉的乳糖酶基因片段lacA電轉(zhuǎn)到乳酸克魯維酵母GG799中，獲得了高效胞外分泌表達乳糖酶的重組菌株lacA-1。利用薄層層析法檢測該菌株分泌的乳糖酶具有生物活性。由SDS-PAGE電泳分析表達重組菌株lacA-1產(chǎn)物可知，該菌株所分泌的乳糖酶蛋白分子量略高于理論值，其原因在于該基因存在糖基化位點，在表達過程中發(fā)生了一定程度的糖基化，從而使其表觀分子量大于理論值。由發(fā)酵液的SDS-PAGE電泳圖像可知，該蛋白分泌表達量較高，通過后期培養(yǎng)基優(yōu)化及發(fā)酵工藝優(yōu)化有望實現(xiàn)乳糖酶的高效表達。綜上所述，本研究通過基因工程手段成功構(gòu)建一株可胞外分泌、安全性高的乳糖酶工程菌株，實現(xiàn)了米曲霉乳糖酶基因在乳酸克魯維酵母表達體系中的胞外分泌表達，為乳糖酶在食品、醫(yī)藥等工業(yè)化上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。