紀秀鳳，劉海春，呂長鑫，*，于泳渤，魯子銘，王維民，姜淑艷，勵建榮，*

（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州121013；2.河北省科技工程學校，河北保定071000；3.大連中超食品有限公司，遼寧大連116400；4.遼寧燕邦農業(yè)有限公司，遼寧錦州121000）

紅樹莓又稱馬林、托盤和覆盆子等，屬薔薇科懸鉤子屬多年生小灌木[1]，其果實營養(yǎng)豐富、柔嫩多汁、酸甜可口，有著“黃金漿果”和“水果之王”的美譽[2]。紅樹莓果實皮薄汁多不耐貯存，故多被加工成紅樹莓果醬、果汁和果酒等營養(yǎng)保健系列產品，但其加工中產生大量副產物紅樹莓籽約占鮮果質量的10%[3]，常被丟棄而造成資源浪費。研究發(fā)現(xiàn)，紅樹莓籽中含有黃酮、鞣花酸和原花青素等活性成分[4]，其中，原花青素含量較為豐富。原花青素具有防治心血管疾病、降血脂、降血糖和抗癌等活性[5-6]。目前對紅樹莓籽油及黃酮研究較多，而對紅樹莓籽原花青素研究尚少。原花青素提取主要采用纖維素酶、超聲波、微波和超臨界等單一輔助法進行提取，而超聲波與酶復合提取研究較少。超聲波法與酶法相結合，利用酶對紅樹莓籽細胞壁進行降解[7]，同時通過超聲波產生高效空化效應，促使原花青素加速溶出，并避免了原花青素氧化，進而提高得率[8]。人民生活日益富裕的今天，高膽固醇和高血糖疾病威脅著人類健康。膽酸鹽是一種人體合成膽固醇的前體成分，與原花青素結合可排出體外，阻止膽酸鹽吸收，促進膽酸鹽轉化為膽固醇，進而起到降血脂作用[9-11]。本文通過超聲波-酶法輔助法提取紅樹莓籽中原花青素，不僅變廢為寶，且拓寬了原花青素來源。首先，通過響應面法優(yōu)化紅樹莓籽原花青素提取工藝，提高原花青素得率；其次，通過體外模擬紅樹莓籽原花青素結合?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉和膽酸鈉能力，并以考來烯胺為對照，探究紅樹莓籽結合膽酸鹽能力，為其在降血糖方面應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅樹莓籽：大連中超食品有限公司；考來烯胺（醫(yī)藥級）、胰蛋白酶（250 000 U/g，生物試劑）、牛磺膽酸鈉（生物試劑）、甘氨膽酸鈉（生物試劑）、膽酸鈉（生物試劑）：美國Sigma公司；纖維素酶（10萬U/g）：食品級，上海源葉生物科技有限公司；香草醛、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉（分析純）：天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

Centrifuge5804R冷凍離心機：德國艾本德股份公司；UV-2700紫外-可見分光光度計：日本島津有限公司；GT-100高通量組織研磨儀：北京格瑞德曼儀器設備有限公司；SK6210HP上海科導超聲儀器有限公司：江蘇昆山市超聲儀器有限公司；SHA-2冷凍水浴恒溫振蕩器：金壇市瑞華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅樹莓籽原花青素提取

紅樹莓籽于研磨儀1 200 r/min粉碎2 min后，60目過篩，在料液比1∶10（g/mL）的石油醚中40℃脫脂4 h，抽濾取粉備用。精確稱取1.00 g脫脂紅樹莓籽粉于錐形瓶中，加入纖維素酶和乙醇溶液置于超聲波儀器中提取，粗提液75℃滅酶10 min后冷卻至室溫，在6 000 r/min下離心10 min，將上清液定容至50 mL，采用香草醛-鹽酸法在500 nm波長下測定吸光度。

1.3.2 原花青素標準曲線繪制

稱取原花青素25 mg，甲醇定容至25 mL，分別取1、2、3、4、5 mL 上述溶液用甲醇定容至 10 mL，各加入40 g/L香草醛-甲醇溶液6 mL和濃鹽酸3 mL搖勻，30℃水浴避光1 h，以甲醇為空白，測定500 nm處吸光值，以原花青素濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制原花青素標準曲線為：y=1.770 1x-0.007 6，R2=0.999 6。

1.3.3 原花青素測定

取1 mL定容后的紅樹莓籽原花青素提取液于試管中，采用1.3.2方法測定吸光值，計算原花青素得率，見公式（1）：

式中：V為濃縮液定容體積，mL；C為濃縮液原花青素濃度，mg/mL；M為紅樹莓籽粉質量，mg；N為樣品稀釋倍數(shù)。

1.3.4 單因素試驗

針對紅樹莓籽脫脂粉，分別進行提取溫度（25、30、35、40、45℃）、乙醇濃度（60%、65%、70%、75%、80%）、料液比 [1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）、酶添加量（0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%）、超聲功率（160、170、180、190、200 W）和提取時間（20、30、40、50、60 min）6組單因素試驗，通過原花青素得率，確定各單因素適宜提取條件。

1.3.5 響應面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素結果，選取各因素參數(shù)范圍內紅樹莓籽原花青素得率變化范圍較大的4個因素進行響應面優(yōu)化。因此，以提取時間（A）、料液比（B）、酶添加量（C）和超聲功率（D）作為考察因素，以提取率為響應值，采用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken設計試驗，見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.6 紅樹莓籽原花青素體外結合膽酸鹽能力評價

1.3.6.1 膽酸鹽標準曲線繪制

配制濃度分別為 0.003、0.015、0.030、0.045、0.060、0.075 mmol/L甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c和膽酸鈉標準溶液（pH值為6.3的0.1 mol/L磷酸緩沖液配制），取2 mL于試管中，加入6 mL質量分數(shù)60%的H2SO4溶液，70℃水浴20 min后，冰浴5 min，在387 nm下測定吸光度，以膽酸鹽含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線[12]。?；悄懰徕c：y=13.897x+0.011 9，R2=0.999 5；甘胺膽酸鈉：y=11.847x+0.0551，R2=0.999 3；膽酸鈉：y=4.122 7x+0.002 4，R2=0.996 3。

1.3.6.2 原花青素對膽酸鹽吸附動力學試驗

分別稱取20 mg紅樹莓籽原花青素于試管中，加入0.5 mL蒸餾水搖勻，再加入0.5 mL的0.02 mol/L鹽酸溶液，37℃恒溫振蕩消化1 h；用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至6.3，隨后加入5 mL 10 mg/mL胰蛋白酶（pH值為6.3的0.1 mol/L磷酸緩沖液配制），37℃恒溫振蕩消化1 h；分別加入0.3 mmol/L牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉和膽酸鈉4 mL，37℃分別恒溫振蕩20、30、40、60、90 和 120 min；在 6 000 r/min 條件下離心10 min，測定上清液中的膽酸鹽含量，確定膽酸鹽吸附量[13-14]。

1.3.6.3 原花青素對膽酸鹽等溫吸附試驗

分別稱取20 mg紅樹莓籽原花青素于試管中，加入0.5 mL蒸餾水搖勻后，再加入0.5 mL的0.02 mol/L鹽酸溶液，37℃恒溫振蕩消化1 h；采用0.1 mol/L氫氧化鈉將消化液pH值調至6.3，隨后加入5 mL 10 mg/mL胰蛋白酶，37℃恒溫振蕩消化1 h；每個樣品中分別加入 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 的 0.3 mmol/L?；悄懰徕c溶液，再以同種方式分別向樣品中加入0.3 mmol/L的甘氨膽酸鈉溶液和膽酸鈉溶液；37℃恒溫振蕩1 h；在6 000 r/min條件下離心10 min，測定上清液中的膽酸鹽含量，確定膽酸鹽吸附量[9，15]。

1.3.6.4 原花青素對膽酸鹽結合試驗

分別稱取 20、40、60、80、100 mg 紅樹莓籽原花青素于試管中，以60 mg考來烯胺作對照，加入0.5 mL蒸餾水混合均勻，再加入0.5 mL的0.02 mol/L鹽酸溶液，37℃恒溫振蕩消化1 h；用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至6.3，隨后加入5 mL 10 mg/mL的胰蛋白酶，37℃恒溫振蕩消化1 h；每個樣品中加入4.0 mL 0.3 mmol/L?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉和膽酸鈉溶液，37℃恒溫振蕩1 h；在6 000 r/min條件下離心10 min，測定上清液中的膽酸鹽含量，確定膽酸鹽結合率[15-16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”形式表示，采用Microsoft Word 2003軟件對數(shù)據(jù)進行整理繪圖，SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，顯著性水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 紅樹莓籽原花青素提取單因素試驗結果與分析

2.1.1 提取溫度對原花青素得率影響分析

提取溫度對原花青素得率影響見圖1。

圖1 提取溫度對原花青素得率影響Fig.1 Effects of hydrolysis temperature on the extraction of proanthocanidins

由圖1可知，當提取溫度在25℃～35℃時，原花青素得率顯著上升（P＜0.05），是因供給酶促反應能量加強，酶解破壁作用加強；當溫度高于35℃后，原花青素得率顯著下降（P＜0.05），是因溫度過高抑制酶促反應，其次在超聲空化作用下溫度過高加快了原花青素分解，故選取適宜提取溫度為35℃。

2.1.2 乙醇濃度對原花青素得率影響分析

乙醇濃度對原花青素得率影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對原花青素得率影響Fig.2 Effects of ethanol concentration on the extraction of proanthocanidins

由圖2可知，乙醇濃度在60%～75%時，原花青素得率顯著增加（P＜0.05）；當乙醇濃度高于75%后，原花青素得率逐漸下降，但差異不顯著（P＞0.05），是因乙醇濃度過高促使纖維素酶失活；其次，醇和脂溶性雜質溶出，與原花青素競爭乙醇-水分子，導致原花青素得率降低[17]，故選擇適宜乙醇濃度為75%。

2.1.3 料液比對原花青素得率影響分析

料液比對原花青素得率影響見圖3。

圖3 料液比對原花青素得率影響Fig.3 Effects of solid-liquid ratio on the extraction of proanthocanidins

由圖3可知，隨液料比增大，原花青素得率逐漸升高，但料液比在 1∶15（g/mL）～1∶30（g/mL）內得率變化差異顯著（P＜0.05），高于 1∶30（g/mL）后差異不顯著（P＞0.05），考慮溶劑成本及后續(xù)濃縮的高效性[18]，選擇適宜液料比為 1∶30（g/mL）。

2.1.4 酶添加量對原花青素得率影響分析

酶添加量對原花青素得率影響見圖4。由圖4可知，當纖維素酶添加量低于0.8%時，原花青素得率顯著升高（P＜0.05），是因纖維素酶與底物充分結合加速破壞了紅樹莓籽細胞壁[7]；酶添加量高于0.8%后，原花青素得率迅速下降，且差異顯著（P＜0.05），是因酶相對底物過飽和，酶作用受到抑制，故選擇適宜纖維素酶添加量為0.8%。

圖4 酶添加量對原花青素得率影響Fig.4 Effects of celluase addition on the extraction of proanthocanidins

2.1.5 超聲功率對原花青素得率影響分析

超聲功率對原花青素得率影響見圖5。由圖5可知，超聲功率在160 W～180 W時，原花青素得率逐漸增大，但無顯著性差異（P＞0.05）；超聲功率在180 W～190 W時，原花青素得率增加顯著（P＜0.05），是因隨超聲波空化效應和振動作用增強，促進細胞壁破裂，利于原花青素溶出；超聲功率高于190 W后，得率有所降低，但差異不顯著（P＞0.05），是因超聲功率增強，溶劑體系機械振動效應加強，引起提取液溫度升高，原花青素有效成分被破壞，導致得率降低[19-20]。故選擇超聲波功率為190 W。

圖5 超聲功率對原花青素得率影響Fig.5 Effects of ultrasonic power on the extraction of proanthocanidins

2.1.6 提取時間對原花青素得率影響分析

提取時間對原花青素得率影響見圖6。由圖6可知，提取時間在20 min～40 min內，原花青素得率顯著增加（P＜0.05），是因提取時間過短，纖維素酶尚未完全破壞紅樹莓籽細胞壁，原花青素不能充分溶于乙醇溶液；提取時間超過40 min后，原花青素得率顯著下降（P＜0.05），是因原花青素活性基團與纖維素酶等蛋白酶反應；其次，超聲時間過長，溶質和溶劑間熱效應增強，破壞了原花青素結構，導致得率降低[21]。故選擇最適提取時間為40 min。

圖6 提取時間對原花青素得率影響Fig.6 Effects of extraction time on the extraction of proanthocanidins

2.2 響應面優(yōu)化復合穩(wěn)定劑結果分析

2.2.1 模型建立與顯著性分析

由單因素結果可知，在所選因素范圍內，提取溫度、乙醇濃度、料液比、酶添加量、超聲功率和提取時間原花青素得率最高值與最低值差分別為1.14、2.42、4.18、2.71、6.63、3.73 mg/g，因此，選取對紅樹莓籽原花青素得率變化較大的料液比（A）、酶添加量（B）、超聲功率（C）和提取時間（D）作為考察因素單因素，通過Box-Behnken設計得到29組試驗，每組試驗原花青素得率見表2。利用響應面軟件對表2數(shù)據(jù)進行分析，得到響應面試驗模型回歸系數(shù)及顯著性檢驗結果見表3。

表2 響應面試驗設計方案及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗結果Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

續(xù)表2 響應面試驗設計方案及結果Continue table 2 Experimental design and results for response surface analysis

對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到以原花青素得率為響應值的二次回歸方程為：得率=16.23+0.74A-0.005 8B-0.32C-0.40D-1.80AB+023AC+1.11AD-0.79BC+0.052BD-0.57CD-2.49A2-2.10B2-3.11C2-1.74D2。該試驗模型 P＜0.000 1，失擬性 P=0.984 3＞0.05，模型極顯著，失擬相不顯著，說明在該試驗選擇的因素條件范圍內各因素間存在較強的交互作用。本試驗R2=0.984 8，R2Adj=0.969 6，CV=3.1%，RSN=25.983，說明二次回歸方程擬合度較好，置信度較高，能較好的反應各因素對紅樹莓籽原花青素得率的影響。各因素對原花青素得率影響依次為 A＞D＞C＞B。因素 A、D、A2、B2、C2、D2和交互項 AB、AD、BC、CD 對原花青素得率影響極顯著，C對原花青素得率影響顯著，AC、BD對原花青素得率影響不顯著。

圖7 各因素間交互作用對紅樹莓籽原花青素得率響應面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of red raspberry seed on dissolution quantity of flavonoids

2.2.2 響應面交互作用分析

各因素交互作用對原花青素得率影響如圖7所示，等高線圖和響應面圖直觀地反映了得率隨各因素的變化情況。圖7a1、7b1和7c1等高線圖均較扁，且圖7a2、7b2和7c2中響應面圖坡度陡峭度依次變緩，圖7d1等高線相對略圓，7d2響應面坡度相對較平緩，故交互項對原花青素得率影響大小依次為：AB＞AD＞BC＞CD，交互作用均極顯著，且料液比、酶添加量、超聲功率和提取時間對紅樹莓籽原花青素得率影響均顯著，與模型系數(shù)顯著性檢驗結果一致。由圖7a2、7b2、7c2和7d2可知，當其它因素取零水平時，隨酶添加量、料液比、超聲功率及提取時間單一變量的增大，紅樹莓籽原花青素得率均呈先升高后降低趨勢，故在所選因素參數(shù)范圍內均存在極值，可對紅樹莓籽原花青素提取最佳工藝進行預測。

2.2.3 驗證試驗結果分析

由響應面模型優(yōu)化得出紅樹莓籽原花青素最優(yōu)提取條件：料液比 1∶31（g/mL）、酶添加量 0.8%、超聲功率190 W、提取時間39 min，原花青素得率為16.30 mg/g。為驗證優(yōu)化結果可靠性，進行3組平行驗證試驗，實際測得紅樹莓籽原花青素得率為（16.42±0.11）mg/g，與理論值相差0.74%，說明該模型與實際擬合效果較好，適用于紅樹莓籽原花青素提取。

2.3 紅樹莓籽原花青素體外結合膽酸鹽能力評價

2.3.1 原花青素對膽酸鹽吸附動力學分析

紅樹莓籽原花青素對膽酸鹽吸附動力曲線如圖8所示。紅樹莓籽原花青素對牛黃膽酸鈉吸附平衡量最高，甘氨膽酸鈉次之，膽酸鈉最低，是因?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉均為結合型膽酸鈉，?；悄懰徕c側鏈末端磺酸基和甘氨膽酸鈉側鏈末端羧基比膽酸鈉側鏈末端羧基易離子化暴露活性基團[22]。原花青素在30 min左右達到膽酸鹽吸附平衡，但膽酸鈉吸附量略有升高。說明紅樹莓籽原花青素對3種膽酸鹽均具有一定結合能力，且與膽酸鹽結合速度較快。

圖8 紅樹莓籽原花青素對膽酸鹽的吸附動力曲線Fig.8 The adsorption kinetics of proanthocyanidins from red raspberry seeds to bile salts

2.3.2 原花青素結合膽酸鹽等溫吸附曲線

紅樹莓籽原花青素對膽酸鹽吸附情況如圖9所示，隨膽酸鹽初始濃度增大，紅樹莓籽原花青素對膽酸鹽吸附量均呈上升趨勢，對?；悄懰徕c吸附量略高于甘氨膽酸鈉，但均遠高于膽酸鈉，是因?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉均為結合型膽酸鹽，?；悄懰徕c側鏈基團的磺酸基相對甘氨膽酸鈉側鏈甘氨酸羧基極性較大，解離性強，利于暴漏活性位點，進而與紅樹莓籽原花青素結合量較高，而膽酸鈉側鏈基團為羧基，解離性弱于甘氨酸羧基[15]。

圖9 膽酸鹽吸附等溫線Fig.9 The adsorption isothermals of bile salts

2.3.4 原花青素結合膽酸鹽能力所示

紅樹莓籽原花青素與膽酸鹽結合能力如圖10，隨原花青素濃度增大，對膽酸鹽結合率逐漸增大，但原花青素濃度在20 mg/mL～40 mg/mL內與膽酸鈉和甘氨膽酸鈉結合率均無顯著性變化（P＞0.05），在60 mg/mL～100 mg/mL內與膽酸鈉結合率無顯著性差異（P＞0.05），與甘氨膽酸鈉結合率顯著性增加（P＜0.05）；原花青素濃度在20 mg/mL～100 mg/mL內與牛磺膽酸鈉結合率顯著性增加（P＜0.05）。以60 mg/mL考來烯胺作對照，原花青素對膽酸鈉、甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉結合率相當于同劑量考來烯胺結合率的54.50%、71.79%和72.34%，說明原花青素有較好的結合膽酸鹽能力。原花青素結合部分膽酸鹽后，膽酸鹽含量降低，促使肝臟中膽固醇轉化為膽酸鹽以維持體內膽汁酸的動態(tài)平衡，故肝臟中膽固醇含量隨之降低，起到降血脂作用[23]。該結果表明紅樹莓籽原花青素有較好的體外降血脂活性。

圖10 不同濃度原花青素與酸鈉結合能力Fig.10 Effect of shear rate on viscosity at different storage time

3 結論

采用超聲波-酶法輔助提取紅樹莓籽原花青素，通過單因素篩選出對原花青素得率影響較大的料液比、酶添加量、超聲功率和提取時間四因素進行響應面優(yōu)化，確定最佳提取條件為：料液比1∶31（g/mL）、酶添加量 0.8%、超聲功率 190 W、提取時間39 min，原花青素得率為16.42 mg/g，較大幅度程度地提高了原花青素得率，說明工藝具有一定實際應用意義。

紅樹莓籽原花青素與膽酸鹽結合30 min達到吸附平衡；原花青素結合?；悄懰徕c能力最強，對膽酸鈉、甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c結合率相當于同劑量考來烯胺結合率的54.50%、71.79%和72.34%，說明紅樹莓籽原花青素具有良好的體外結合膽酸鹽能力，為開發(fā)天然降脂藥物提供實驗基礎。此外，紅樹莓籽原花青素結合膽酸鹽具體機理還需進一步研究。