■馬國強(qiáng) 張清月 胡 耀 趙艷麗 郭曉宇 閆素梅

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

我國是一個(gè)羊絨生產(chǎn)大國，長期以來是畜牧產(chǎn)業(yè)出口創(chuàng)匯的一個(gè)重要來源，2012年羊絨產(chǎn)量大約占全球的70%左右[1]。近年來隨著羊絨價(jià)格的下跌，羊肉需求量的不斷增加，同時(shí)伴隨著草原生態(tài)環(huán)境的惡化，草場載畜量的限制等因素，使得舍飼育肥絨山羊逐漸成為新的經(jīng)濟(jì)增長點(diǎn)[2]。但在由放牧轉(zhuǎn)為舍飼過程中，日糧的的改變可能會引起瘤胃內(nèi)微生物區(qū)系的變化，加之舍飼日糧可溶性碳水化合物濃度高，有效纖維不足，可能會引起pH值下降，導(dǎo)致酸中毒等消化功能障礙，影響機(jī)體健康和生產(chǎn)性能[3]。因此，開發(fā)一種能夠提高機(jī)體抵抗力，促進(jìn)動(dòng)物生長的飼料添加劑尤為重要。

黑沙蒿，又名沙蒿、油蒿，是蒿屬植物中的一個(gè)品種。作為一種中草藥添加劑，其功能多樣，富含各種多糖、黃酮類、有機(jī)酸等有機(jī)活性物質(zhì)，全草均可入藥[4]。有研究發(fā)現(xiàn)黑沙蒿具有抑制細(xì)菌、提高機(jī)體免疫力、促進(jìn)動(dòng)物發(fā)育等功能[5]，且具有芳香氣味，可一定程度上改善飼料風(fēng)味[6]。因其不易殘留，出現(xiàn)抗藥性和毒副作用幾率較低，飼用更為安全穩(wěn)定，具有被開發(fā)為一種新型綠色飼料添加劑的潛力。但目前關(guān)于黑沙蒿的研究多集中于單胃動(dòng)物以及其對免疫、抗氧化功能等的影響，關(guān)于黑沙蒿對反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵性能影響的報(bào)道鮮少。鑒于此，本試驗(yàn)通過體外發(fā)酵培養(yǎng)，在日糧中添加不同比例的黑沙蒿，探究其對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響，為黑沙蒿在絨山羊生產(chǎn)中的科學(xué)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)分5個(gè)組，即對照組、試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組、試驗(yàn)3組和試驗(yàn)4組，分別在其發(fā)酵底物中添加0%、1%、2%、3%、4.5%的沙蒿原粉（沙蒿等量替代發(fā)酵底物中的混合粗料）。每個(gè)組設(shè)3、6、9、12 h與24 h 5個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)6個(gè)重復(fù)。體外發(fā)酵底物的精粗比為30∶70，粗料由谷草、燕麥、苜蓿組成。每個(gè)發(fā)酵瓶中添加1 g底物，接種60 ml人工瘤胃液。待培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行取樣及樣品處理。體外發(fā)酵底物的組成與營養(yǎng)水平見表1。

1.2 體外培養(yǎng)操作

選取3只年齡相同、體況相近且健康的阿爾巴斯白絨山羊作為瘤胃液供體羊，于早晨飼喂前用瘤胃液采樣器通過口腔采集瘤胃液。采集到的瘤胃液經(jīng)一層紗布過濾到提前充滿CO2的保溫瓶中保存，采集完畢后立即放入39℃水浴中保存。將采集好的瘤胃液與配置好的培養(yǎng)液混合均勻，制成人工瘤胃液，持續(xù)通入CO2，待由紅色變?yōu)闊o色時(shí)，再將其依次分配到裝有底物的各個(gè)培養(yǎng)瓶中。在培養(yǎng)瓶中接種人工瘤胃液之前，培養(yǎng)瓶中預(yù)先通滿CO2，在接種人工瘤胃液之后，再通入CO21～2 s，蓋好瓶塞之后立即將其轉(zhuǎn)移到氣浴搖床中，溫度為39.0℃，搖床速率為120 r/min。待各時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)結(jié)束后，立即將發(fā)酵瓶置于冰上進(jìn)行冷卻，以確保各發(fā)酵瓶同時(shí)終止發(fā)酵。再按照順序依次進(jìn)行取樣。

表1 體外發(fā)酵底物的基礎(chǔ)日糧組成與營養(yǎng)水平

體外培養(yǎng)液的配置參考Menke等(1988)[7]的方法。由瘤胃液與人工培養(yǎng)液以1∶2的比例配制而成。人工培養(yǎng)液包含緩沖溶液、微量元素溶液、常量元素溶液、刃天青溶液、還原劑溶液等,在采集瘤胃液前配制,并提前充入CO2于39℃水浴中加熱。

1.3 測試指標(biāo)與測定方法

測試指標(biāo)包括體外培養(yǎng)3、6、9、12、24 h時(shí)間點(diǎn)的pH值、NH3-N、菌體蛋白(BCP)濃度，原蟲數(shù)量和產(chǎn)氣量。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，待培養(yǎng)完畢之后，將發(fā)酵瓶內(nèi)液體搖勻，打開瓶塞之后，倒出少許發(fā)酵液，立即用pH計(jì)測其pH值。NH3-N濃度參照馮宗慈等（2010）[8]改進(jìn)的比色法，采用水楊酸-次氯酸鈉法測定，用酶標(biāo)儀在700 nm波長下進(jìn)行吸光度檢測，將測得的吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸公式，計(jì)算樣品中的NH3-N濃度。菌體蛋白（BCP）濃度參考趙發(fā)盛等[9]方法測定，采用差速離心法對體外培養(yǎng)液中的細(xì)菌進(jìn)行分離，將分離后菌體采用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford等，1976）測定蛋白含量[10]。

原蟲計(jì)數(shù)參考王洪榮等[11]的方法采用染色鏡檢法進(jìn)行測定。將用2層紗布過濾后的瘤胃液置于血球計(jì)數(shù)板上用光學(xué)顯微鏡對其進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)記錄上下兩個(gè)計(jì)數(shù)室各自四角和中間的5個(gè)大方格內(nèi)原蟲的數(shù)量，然后對其進(jìn)行平均計(jì)算。

計(jì)算公式：實(shí)際濃度(個(gè)/ml)=上下板總數(shù)(個(gè))×104

產(chǎn)氣量的測定采用美國Ankom RFS氣體自動(dòng)記錄系統(tǒng)記錄體外培養(yǎng)液中24 h內(nèi)的產(chǎn)氣量[12]。計(jì)算公式：

式中：VX——產(chǎn)生氣體的體積（ml）；

Vj——模塊瓶內(nèi)液面上部空間的體積（ml）；

Ppsi——GMS軟件記錄的累計(jì)壓力（psi）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.0軟件的統(tǒng)計(jì)程序進(jìn)行單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果P＜0.05表示組間差異，0.05＜P＜0.10表示組間差異趨于顯著，P＞0.10表示組間差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑沙蒿對體外發(fā)酵培養(yǎng)液pH值的影響

表2 黑沙蒿添加水平對體外培養(yǎng)液中的pH值的影響

由表2可知，發(fā)酵3 h與6 h，黑沙蒿的不同添加水平對體外發(fā)酵培養(yǎng)液中的pH值有顯著影響（P=0.035、P=0.005）。其中在發(fā)酵3 h，試驗(yàn)1～3組的pH值均顯著高于對照組，且在數(shù)值上試驗(yàn)2與3組最高；在發(fā)酵6 h，試驗(yàn)1與4組的pH值顯著高于對照組，且試驗(yàn)4組顯著高于試驗(yàn)1組，試驗(yàn)2、3組與對照組差異不顯著。在發(fā)酵9、12、24 h，黑沙蒿的不同添加水平對體外發(fā)酵培養(yǎng)液中的pH值均沒有顯著影響（P＞0.10）。

2.2 黑沙蒿對體外發(fā)酵培養(yǎng)液中NH3-N含量的影響

表3 不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)各黑沙蒿添加水平體外培養(yǎng)液中的NH3-N濃度（mg/100 ml）

由表3可知，在發(fā)酵3、6、9、12、24 h，黑沙蒿的不同添加水平對NH3-N的濃度均有顯著影響（P＜0.05）。其中，在發(fā)酵3 h，試驗(yàn)2～4組的NH3-N濃度顯著低于對照組；在發(fā)酵6 h后，試驗(yàn)1、3組與4組的NH3-N濃度顯著高于對照組，以試驗(yàn)3組較高；在發(fā)酵9 h，試驗(yàn)3、4組的NH3-N濃度顯著高于對照組；在發(fā)酵12、24 h，試驗(yàn)1～4組的NH3-N濃度顯著高于對照組，且在發(fā)酵24 h，試驗(yàn)3組顯著高于試驗(yàn)2組。

2.3 黑沙蒿對體外發(fā)酵培養(yǎng)液中BCP含量的影響

表4 黑沙蒿添加水平對體外發(fā)酵培養(yǎng)液中BCP含量的影響（mg/100 ml）

由表4可知，在發(fā)酵3、6、9、24 h，黑沙蒿的不同添加水平對體外培養(yǎng)液中BCP的含量均有顯著影響（P＜0.05）。在發(fā)酵3 h，試驗(yàn)3、4組的BCP含量顯著高于對照組與試驗(yàn)1、2組；在發(fā)酵6 h，試驗(yàn)1～4組的BCP含量顯著高于對照組；在發(fā)酵9 h，試驗(yàn)1、3、4組的BCP含量顯著高于對照組；在發(fā)酵24 h，試驗(yàn)1～3組的BCP含量均顯著高于對照組，試驗(yàn)4組與對照組無顯著差異，且顯著低于試驗(yàn)3組。

2.4 黑沙蒿對體外培養(yǎng)液中原蟲數(shù)量的影響

由表5可知，在發(fā)酵3、6、12 h和24 h，黑沙蒿的不同添加水平對原蟲的數(shù)量有顯著影響（P＜0.05）。在發(fā)酵3 h，試驗(yàn)2組顯著高于對照組與試驗(yàn)1、4組；在發(fā)酵6 h，試驗(yàn)2、3組顯著低于對照組與試驗(yàn)1、4組；在發(fā)酵12 h，試驗(yàn)1～3組顯著低于對照組與試驗(yàn)4組，且試驗(yàn)3組最低，顯著低于試驗(yàn)1與2組；在發(fā)酵24 h，試驗(yàn)2～4組顯著低于對照組，試驗(yàn)1組與對照組差異不顯著。

表5 不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)各黑沙蒿添加水平體外發(fā)酵培養(yǎng)液中原蟲的數(shù)量（×104個(gè)/ml）

2.5 黑沙蒿對體外發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)氣量的影響

由表6可知，在發(fā)酵所有時(shí)間點(diǎn)，黑沙蒿的不同添加水平對體外產(chǎn)氣量均有顯著影響（P＜0.05）。其中在發(fā)酵3 h，試驗(yàn)4組顯著高于對照組、試驗(yàn)1與3組；在發(fā)酵6 h，試驗(yàn)2與4組顯著高于對照組。在發(fā)酵9 h和12 h，所有試驗(yàn)組顯著高于對照組，且在發(fā)酵12 h，試驗(yàn)4組顯著低于試驗(yàn)2、3組；在發(fā)酵24 h，試驗(yàn)2～4組顯著高于對照組。

表6 黑沙蒿添加水平對體外產(chǎn)氣量的影響（ml）

3 討論

pH值是反應(yīng)瘤胃發(fā)酵水平的一個(gè)重要指標(biāo)，瘤胃中pH值的正常變動(dòng)范圍為5.5～7.5，瘤胃細(xì)菌繁殖最適pH值范圍6～7，微生物蛋白質(zhì)合成最適pH值范圍為6.3～7.4[13]。pH值的改變可顯著影響瘤胃微生物的活性，進(jìn)而影響微生物各種酶的活性。姜衛(wèi)紅等[14]研究指出，纖維素分解型細(xì)菌受pH值的改變影響最大，而淀粉型分解細(xì)菌對pH值的改變不敏感[15]。pH值一般受日糧的性質(zhì)、口腔唾液的分泌量以及瘤胃內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸的生成與吸收等諸多因素影響[16]，但在體外培養(yǎng)試驗(yàn)中，因?yàn)闆]有唾液的分泌以及代謝產(chǎn)物的外排作用，因此影響瘤胃液pH值變化的主要因素是CO2、各種有機(jī)酸以及NH3-N的釋放與轉(zhuǎn)化。NH3-N的含量在一定程度上反映了瘤胃微生物降解氮源飼料的速率及其對游離NH4+的轉(zhuǎn)化效率，進(jìn)而反映了在特定日糧組成下，蛋白質(zhì)降解與合成的平衡狀態(tài)[17]。有研究指出瘤胃中微生物對NH3-N的最適濃度一般為6～30 mg/100 ml。一般情況下瘤胃液中的NH3-N濃度處于動(dòng)態(tài)平衡，但NH3-N水平不僅受日糧中含氮飼料占比的影響，同時(shí)受蛋白降解率、瘤胃微生物對NH3-N的利用速率和瘤胃對NH3-N的吸收速率以及日糧能量水平等因素影響[18]。BCP的含量直接反映瘤胃中細(xì)菌的數(shù)量，并且反應(yīng)微生物蛋白的合成效率。陳喜斌等[19]指出可降解N轉(zhuǎn)化為BCP的效率受NH3-N濃度、蛋白降解速度及微生物可利用能量的影響。瘤胃中的原蟲與細(xì)菌處于動(dòng)態(tài)平衡中，原蟲以細(xì)菌為食物來源，對細(xì)菌的氮代謝有重要的調(diào)節(jié)作用。原蟲不能直接利用氮素，只有通過吞噬細(xì)菌而獲得氨基酸氮，從而合成自身蛋白。有研究表明，適當(dāng)?shù)慕档土鑫钢性x的數(shù)量，可提高瘤胃細(xì)菌的數(shù)量，增加對蛋白的合成效率[20]。產(chǎn)氣量可直接反映瘤胃降解代謝二氧化碳、甲烷及各種揮發(fā)性氣體的產(chǎn)量，可間接反映飼料有機(jī)物質(zhì)的消化率，產(chǎn)氣量越高，飼料在瘤胃內(nèi)的發(fā)酵活動(dòng)越劇烈。

本試驗(yàn)對比各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，各試驗(yàn)組pH值與NH3-N濃度呈先下降后上升，BCP含量與原蟲數(shù)量呈先上升后下降，產(chǎn)氣量呈一直上升的趨勢，與劉凱玉等的結(jié)果相一致[21]。這可能是在發(fā)酵初期微生物以增殖代謝為主，微生物的數(shù)量增加，增強(qiáng)了對培養(yǎng)液中的NH3-N利用，降低培養(yǎng)液中NH3-N濃度。因原蟲以吞噬細(xì)菌獲得自生營養(yǎng)物質(zhì)，所以細(xì)菌數(shù)量的提高，也促進(jìn)了原蟲數(shù)量的增殖。在發(fā)酵后期，微生物活性逐漸下降，可能以分解代謝為主，對NH3-N的利用減少，所以NH3-N濃度逐漸上升，BCP含量逐漸下降，導(dǎo)致pH值升高，原蟲數(shù)量下降。

本試驗(yàn)結(jié)果得出，各處理組的pH值在5.73～6.72之間，NH3-N濃度在11.61～35.57 mg/100 ml之間，盡管均在正常范圍之內(nèi)，但添加黑沙蒿可減緩發(fā)酵3 h后體外培養(yǎng)液中pH值的降低趨勢，并降低了NH3-N的濃度，其中以添加3%與4.5%效果較顯著；BCP的結(jié)果正好呈相反變化。這說明添加黑沙蒿可增強(qiáng)發(fā)酵初期的微生物對NH3-N的利用，增加BCP的濃度。添加黑沙蒿可提高發(fā)酵6～24 h后的pH值、NH3-N濃度、BCP含量及產(chǎn)氣量，降低了原蟲的數(shù)量，并綜合多項(xiàng)指標(biāo)以添加3%的試驗(yàn)3組效果較好。有研究指出添加蒿屬植物可抑制纖毛蟲的增殖[22]，因此本試驗(yàn)可能是由于黑沙蒿的添加，抑制了原蟲的繁殖，減輕原蟲與細(xì)菌之間的拮抗作用，促進(jìn)細(xì)菌增殖，提高細(xì)菌蛋白及總微生物蛋白產(chǎn)量[23]。微生物數(shù)量的增加，提高了分解代謝產(chǎn)生的揮發(fā)氣體，進(jìn)而增加了產(chǎn)氣量。本試驗(yàn)結(jié)果為黑沙蒿在絨山羊生產(chǎn)中的合理使用提供了理論依據(jù)，但其作用機(jī)理需要進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

①添加黑沙蒿可抑制原蟲的繁殖，降低體外發(fā)酵發(fā)酵液中的原蟲數(shù)量；促進(jìn)微生物活性，提高體外發(fā)酵液中BCP的含量；在發(fā)酵后期可提高NH3-N含量，增強(qiáng)絨山羊體外瘤胃的發(fā)酵功能。

②綜合各指標(biāo)，通過添加黑沙蒿對體外各時(shí)間點(diǎn)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響，在各處理組中，以試驗(yàn)3組（3%）的添加水平對體外發(fā)酵的促進(jìn)效果最佳。