徐 錚 劉寒梅

1.天津市紅橋醫(yī)院(300131)；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院

子宮內(nèi)膜異位癥(EMT)是一種較常見(jiàn)的良性婦科病[1]。常發(fā)于育齡婦女，主要臨床表現(xiàn)為慢性盆腔疼痛、痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、不孕和性交不適等[2]。EMT可發(fā)生類似惡性腫瘤的復(fù)發(fā)性、侵襲性和轉(zhuǎn)移性等行為[3]。發(fā)病原因主要是子宮內(nèi)膜碎片經(jīng)月經(jīng)逆行種植[4]。由于癥狀和青春期少女月經(jīng)失調(diào)相似，常被誤診或推遲8～10年才被確診，盡早診斷和治療生物標(biāo)志的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用非常重要[1]。Fillppi等[5]研究發(fā)現(xiàn)EMT發(fā)生與血管形成有關(guān)。有研究[2，6-7]表明sp1、FGF2、VEGF水平與血管生成相關(guān)，但表達(dá)在EMT患者的臨床意義尚不清楚。本研究探究EMT患者血清和組織中sp1、FGF2、VEGF的表達(dá)及臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇2015年6月—2017年3月本院收治因子宮內(nèi)膜異位癥行腹腔手術(shù)患者60例為觀察組，因輸卵管性不孕行腹腔鏡手術(shù)且未發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜異位病灶患者15例為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《子宮內(nèi)膜異位癥的診治指南》[8]中EMT的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)腹腔鏡和術(shù)后病理確診為卵巢內(nèi)膜異位癥患者；②所有患者月經(jīng)周期規(guī)則正常；③術(shù)前近3個(gè)月未接受任何激素或免疫抑制治療；④患者及家屬知情并自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有惡性腫瘤并發(fā)癥；②患有內(nèi)分泌、代謝及免疫性疾病；③ 輸卵管結(jié)扎；④患有心腦腎等重要器官疾病。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批。

1.2 方法

腹腔鏡手術(shù)前空腹取靜脈血離心取上清備用。腹腔鏡手術(shù)時(shí)觀察組取卵巢內(nèi)異位囊腫囊壁及正常子宮內(nèi)膜組織0.5 cm×0.5cm，對(duì)照組取正常子宮內(nèi)膜組織0.5 cm ×0.5cm，生理鹽水洗凈后液氮速凍5 min備用。

使用德國(guó)QiaGen公司生產(chǎn)試劑盒提取血清總RNA，RNAiso Plus試劑盒(TaKaRa公司)提取內(nèi)膜組織總RNA。檢測(cè)總RNA的純度及完整性。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)將2 μL純凈無(wú)降解總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照TaKaRa公司SYBR Green PCR master mix試劑說(shuō)明加配反應(yīng)體系。每個(gè)樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。體系加配完成后，放入Bio-Rad 熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt算法計(jì)算血清和組織中sp1、FGF2、VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

內(nèi)膜組織樣本以10%中性福爾馬林緩沖液固定后進(jìn)行石蠟包埋并封片觀察。隨機(jī)取10個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行病理切片觀察并統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。按照陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：<5%為0分，5%～20%為1分，21%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；按照染色程度評(píng)分：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，褐黃色為3分。取兩組積分乘積，≤2分為陰性，>2分為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

觀察組60例，年齡(29.41±11.26)歲(26～37)歲。對(duì)照組15例，年齡(28.32±10.41)歲(25～37)歲。兩組一般資料比較無(wú)差異(P>0.05)。

2.2 sp1、FGF2、VEGF mRNA水平比較

觀察組血清sp1、FGF2、VEGF mRNA水平高于對(duì)照組(P<0.05)。sp1、FGF2、VEGFmRNA水平異位內(nèi)膜>在位內(nèi)膜>正常內(nèi)膜(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 血清及內(nèi)膜組織中各蛋白水平比較

*與正常內(nèi)膜比較#與在位內(nèi)膜比較P<0.05

2.4 sp1、FGF2、VEGF蛋白陽(yáng)性率比較

sp1、FGF2、VEGF蛋白主要定位于細(xì)胞核，陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞呈棕黃色。見(jiàn)圖1。sp1、FGF2、VEGF蛋白陽(yáng)性率異位內(nèi)膜>在位內(nèi)膜>正常內(nèi)膜(P<0.05)。見(jiàn)表3。

sp1蛋白正常內(nèi)膜(A)在位內(nèi)膜(B)異位內(nèi)膜(C)；FGF2蛋白正常內(nèi)膜(D)在位內(nèi)膜(E)異位內(nèi)膜(F)；VEGF蛋白正常內(nèi)膜(G)在位內(nèi)膜(H)異位內(nèi)膜(I)圖1 免疫組化分析各蛋白在不同內(nèi)膜中表達(dá)(SP，×400)

表3 各蛋白不同內(nèi)膜中陽(yáng)性率比較 [例(%)]

*與正常內(nèi)膜比較#與在位內(nèi)膜比較P<0.05

2.5 R血清各蛋白水平對(duì)內(nèi)膜異位癥的診斷價(jià)值

血清sp1診斷子宮內(nèi)膜異位癥的ROC曲線下面積為0.846(95%CI為0.771～0.926，P<0.05)，截?cái)嘀禐?.42，此時(shí)敏感度為72.8%、特異度為85.9%、約登指數(shù)為0.601；血清FGF2診斷子宮內(nèi)膜異位癥的曲線下面積為0.831(95%CI為0.737～ 0.915，P<0.05)，截?cái)嘀禐?.34，此時(shí)敏感度為63.8%、特異度為97.6%、約登指數(shù)為0.623；血清VEGF診斷子宮內(nèi)膜異位癥的曲線下面積為0.886(95%CI為0.831～0.942，P<0.05)，截?cái)嘀禐?.24，此時(shí)敏感度為72.9%、特異度為82.4%、約登指數(shù)為0.596。3項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)的曲線下面積為0.975(95%CI為0.951～0.998，P<0.05)，敏感度為93.2%、特異度為91.1%、約登指數(shù)為0.884。

2.6 血清各蛋白水平相關(guān)性分析

子宮內(nèi)膜異位癥患者血清sp1FGF2表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.547,P<0.05)，與VEGF表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.564,P<0.05)；血清FGF2和VEGF表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.547,P<0.05)。

3 討論

EMT是一種復(fù)雜的常見(jiàn)婦科病，其發(fā)病機(jī)制主要有經(jīng)血逆流種植學(xué)說(shuō)、誘導(dǎo)學(xué)說(shuō)、體腔上皮化生學(xué)說(shuō)、遺傳及免疫學(xué)說(shuō)和干細(xì)胞學(xué)說(shuō)等[9]。臨床多認(rèn)為子宮內(nèi)膜異位病灶形成的生理過(guò)程主要有黏附、侵襲和血管形成三個(gè)主要步驟，MET具有腫瘤類似的生理特征[10]，同時(shí)血管形成在發(fā)病過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。血管形成是異位種植生長(zhǎng)的前提，異位種植生長(zhǎng)是在原有的毛細(xì)血管動(dòng)脈端或靜脈端血管叢中生長(zhǎng)新的血管，毛細(xì)血管外基質(zhì)降解，血管生成素活躍，形成血管芽胚，連通新生血管導(dǎo)致發(fā)病。EMT癥狀與青春期女性月經(jīng)失調(diào)相似，易發(fā)生漏診及誤診，尋找EMT發(fā)病過(guò)程中新的小分子標(biāo)記物，并探索其在發(fā)病中的臨床功能，對(duì)EMT早期診斷和治療有重要意義。

sp1是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，位于其染色體C末端3個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)能與靶基因啟動(dòng)子的GC結(jié)構(gòu)域發(fā)生特異性結(jié)合，直接調(diào)控多數(shù)靶基因表達(dá)上調(diào)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、腫瘤的形成和發(fā)展過(guò)程[11]。與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[12]。於永愛(ài)等[13]研究表明sp1在上皮性卵巢癌組織中表達(dá)上調(diào)與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Su等[7]研究發(fā)現(xiàn)，sp1在卵巢癌中高表達(dá)促進(jìn)腫瘤血管生成和癌細(xì)胞侵襲。本研究中EMT患者血清sp1mRNA水平升高，在EMT異位及在位內(nèi)膜組織中表達(dá)升高，與洪霞霞等研究結(jié)果一致[9]，表明sp1水平與EMT發(fā)病有關(guān)，提示檢測(cè)血清和組織中sp1mRNA水平對(duì)監(jiān)測(cè)EMT發(fā)病有重要意義。免疫組化結(jié)果顯示sp1蛋白陽(yáng)性率異位內(nèi)膜>在位內(nèi)膜>正常內(nèi)膜(P<0.05)，表明sp1在異位及在位組織中的表達(dá)趨勢(shì)與其在血清中表達(dá)趨勢(shì)一致，提示檢測(cè)血清sp1mRNA水平可反映sp1在組織中的表達(dá)情況。ROC分析結(jié)果顯示，血清sp1 mRNA表達(dá)水平對(duì)EMT疾病診斷有一定的參考價(jià)值，但其靈敏度較低。

FGF2是一種堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移等過(guò)程，能促進(jìn)血管生成、胚胎發(fā)育、器官分化和傷口愈合等機(jī)體生命活動(dòng)[14]。有研究[15]表明外源性FGF2可顯著抑制細(xì)胞凋亡、遷移，顯著提高對(duì)缺血性損傷的修復(fù)。突變FGF2基因能抑制信號(hào)傳導(dǎo)和血管生成過(guò)程[6]，提示FGF2在血管生成過(guò)程發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)GF2 mRNA水平在EMT患者血清中表達(dá)上調(diào)，與李萬(wàn)斌等[16]研究FGF2在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)趨勢(shì)一致，同時(shí)，EMT患者內(nèi)膜組織中FGF2水平高于對(duì)照組的正常內(nèi)膜組織，與FGF2在血清中的表達(dá)趨勢(shì)一致，表明血清FGF2水平可代替FGF2在組織中的水平。ROC分析結(jié)果顯示，檢測(cè)血清中FGF2 mRNA水平可作為EMT診斷參考指標(biāo)之一，但靈敏度和準(zhǔn)確度不高。

VEGF是重要的血管生成因子，可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖，誘導(dǎo)新血管生成[2]。有研究表明VEGF在卵巢癌中高表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)腫瘤中血管形成參與卵巢癌腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)侵襲過(guò)程[7]。本研究結(jié)果顯示VEGF在EMT患者血清和內(nèi)膜組織中均表達(dá)上調(diào)，與袁源等研究結(jié)果一致[17]。VEGF水平異位內(nèi)膜>在位內(nèi)膜>正常內(nèi)膜，表明血清中VEGF趨勢(shì)與內(nèi)膜異位及在位組織中一致，提示檢測(cè)血清中VEGF水平可反映異位及在位內(nèi)膜組織中VEGF蛋白水平，為內(nèi)膜是否發(fā)生異位提供參考。ROC分析結(jié)果表明血清VEGF水平可為EMT診斷提供重要的參考，但靈敏度較低。

sp1、FGF2、VEGF各蛋白的表達(dá)趨勢(shì)一致，可能參與了EMT疾病發(fā)生過(guò)程，本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，sp1、FGF2、VEGF兩兩之間呈正相關(guān)，Su等[7]研究發(fā)現(xiàn)sp1通過(guò)調(diào)控VEGF促進(jìn)腫瘤侵襲過(guò)程；Chang等[18]研究發(fā)現(xiàn)FGF2通過(guò)Ras-Raf-ERK-sp1通路調(diào)控巢蛋白在C6腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)。提示sp1可能調(diào)控FGF2和VEGF表達(dá)參與EMT疾病發(fā)生及發(fā)展過(guò)程。經(jīng)ROC分析結(jié)果顯示，3項(xiàng)聯(lián)合可顯著提高診斷效率，對(duì)篩查出的EMT患者重點(diǎn)監(jiān)測(cè)，及早采取有效治療。

綜上所述，sp1、FGF2、VEGF在EMT患者血清和蛋白中均表達(dá)上調(diào)，與EMT病程進(jìn)展相關(guān)，推測(cè)sp1可能通過(guò)調(diào)控FGF2和EMT表達(dá)促進(jìn)EMT病程發(fā)展。以sp1、FGF2、VEGF為生物新靶點(diǎn)可為EMT診斷和治療提供新思路，但具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探究。