李發(fā)紅 韓 娜 江 楠 許 茜

青島市婦女兒童醫(yī)院(266034)

高齡產(chǎn)婦身體機(jī)能下降易伴發(fā)各種并發(fā)癥，妊娠期高血壓疾病是其常見的一種并發(fā)癥[1]。嚴(yán)重威脅母嬰身體健康[2]。目前高齡并發(fā)妊娠期高血壓疾病的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，一般認(rèn)為，與胎盤氧化應(yīng)激釋放一系列炎癥因子，進(jìn)而引起血管內(nèi)皮細(xì)胞及胎盤損傷有關(guān)[3]。Klotho是新發(fā)現(xiàn)的一種抗衰老基因[4]，在高血壓等多種疾病狀態(tài)下，表達(dá)發(fā)生明顯變化，表達(dá)水平與疾病的發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[5]。然而Klotho在高齡并發(fā)妊娠期高血壓疾病產(chǎn)婦胎盤中的表達(dá)及與妊娠結(jié)局的關(guān)系，目前尚鮮有報道?；诖?，本研究通過檢測高齡并發(fā)妊娠期高血壓疾病產(chǎn)婦胎盤組織中Klotho表達(dá)情況，并探討其與妊娠結(jié)局的關(guān)系，旨在為臨床診斷及預(yù)測妊娠結(jié)局提供參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料

回顧性選取2017年1月—2018年10月本院婦產(chǎn)科接收的妊娠期高血壓疾病產(chǎn)婦，年齡≥35歲為觀察組，年齡<35歲為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②產(chǎn)婦及其家屬均自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①自身免疫缺陷等疾?。虎谟形鼰?、喝酒等嚴(yán)重不良嗜好；③伴嚴(yán)重肝腎等重要器官障礙性疾?。虎苡袗盒阅[瘤等疾病。本研究通過本院倫理委員會審查。

1.2 治療方法

所有產(chǎn)婦入院后均給予常規(guī)檢查。①降壓，視具體情況進(jìn)行擴(kuò)容、利尿；②對于精神緊張、睡眠不佳的產(chǎn)婦可給予地西泮鎮(zhèn)靜劑(2.5～5.0mg)鎮(zhèn)靜；③若產(chǎn)婦出現(xiàn)子癇、血壓控制不良及其他嚴(yán)重并發(fā)癥時建議產(chǎn)婦終止妊娠。具體方法：前期進(jìn)行鎮(zhèn)靜、解痙，首先將20 ml的25%硫酸鎂溶入20 ml的10%葡萄糖注射液中，緩慢靜脈推注5～10 min，再將60 ml的25%硫酸鎂加入500 ml的5%葡萄糖注射液中，靜脈滴注1～2 g/h，隨后進(jìn)行降壓、利尿、擴(kuò)容治療，在抽搐控制2 h后，可考慮終止妊娠。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察妊娠期并發(fā)癥發(fā)生情況：胎膜早破、胎盤早剝、早產(chǎn)、產(chǎn)后出血、HELLP綜合征；圍產(chǎn)兒情況：胎兒生長受限、胎兒窘迫、新生兒窒息、新生兒畸形、新生兒死亡等發(fā)生情況。

1.4 胎盤蛋白檢測

胎盤娩出后在無菌條件下取臍帶附著處至胎盤母體另一面中央?yún)^(qū)1/2處的胎盤組織，生理鹽水沖洗后放入滅菌的凍存管中，液氮保存待測。

1.4.1KlothomRNAqRT-PCR法檢測胎盤Klotho mRNA水平，RNA提取試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miScript SYBR Green PCR Kit均購自賽默飛世爾科技有限公司。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃：10 s；60 ℃：30 s；95 ℃：30 s，共40個循環(huán)。Klotho及內(nèi)參GAPDH的引物序列見表1。采用2-△△CT法對Klotho水平進(jìn)行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4.2Klothowestern blotting法檢測胎盤Klotho蛋白水平，提取胎盤組織中蛋白質(zhì)并測定濃度，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度，變性后-20℃保存。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜2 h，封閉1 h，Klotho多克隆抗體一抗過夜(4℃)，鼠抗山羊二抗孵育1 h，ECL液顯色，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，凝膠定量分析軟件分析Klotho蛋白相對表達(dá)量。GAPDH作為蛋白內(nèi)參對照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組一般情況

觀察組78例，年齡(36.5±1.4)歲(35～40歲)，孕周(34.7±4.2)周(29～41周)；初產(chǎn)婦49例，經(jīng)產(chǎn)婦29例。對照組152例，年齡(28.6±4.1)歲(23～34歲)，孕周(38.6±1.7)周(36～41周)；初產(chǎn)婦94例，經(jīng)產(chǎn)婦58例。觀察組孕周低于對照組(P<0.05)，其他資料比較無差異(P>0.05)。

2.2 兩組胎盤Klotho表達(dá)

觀察組胎盤Klotho mRNA(4.56±1.13)、Klotho蛋白表達(dá)水平(1.07±0.34)均高于對照組(2.21±0.75、0.51±0.16)(t=18.819、16.991，P=0.000)，見圖1。

圖1 兩組胎盤Klotho蛋白表達(dá)

2.3 兩組妊娠并發(fā)癥情況

產(chǎn)后出血、HELLP綜合征的發(fā)生率兩組比較無差異(P>0.05)，胎膜早破、胎盤早剝、早產(chǎn)的發(fā)生率觀察組高于對照組(P<0.05)，見表2。

2.4 兩組圍產(chǎn)兒情況

胎兒窘迫、新生兒窒息、新生兒畸形發(fā)生率兩組無差異(P>0.05)，圍產(chǎn)期胎兒生長受限、新生兒死亡發(fā)生率觀察組高于對照組(P<0.05)，見表3。

表2 兩組產(chǎn)婦妊娠并發(fā)癥情況比較[例(%)]

表3 兩組圍產(chǎn)兒情況比較[例(%)]

2.5 觀察組不同妊娠結(jié)局產(chǎn)婦Klotho表達(dá)情況

根據(jù)不同妊娠結(jié)局將觀察組產(chǎn)婦分組，發(fā)生妊娠并發(fā)癥及不良圍產(chǎn)兒為不良結(jié)局組32例，正常妊娠結(jié)局為正常結(jié)局組(46例)。不良結(jié)局組胎盤Klotho mRNA(4.96±1.01)、Klotho蛋白(1.35±0.42)表達(dá)水平高于正常妊娠組(4.28±0.95、0.88±0.29)(t=4.530、16.895，P=0.014、0.000)。

2.6 胎盤Klotho蛋白水平預(yù)測不良妊娠結(jié)局

胎盤Klotho蛋白水平診斷不良妊娠結(jié)局的曲線下面積為0.779，診斷分界點(diǎn)為1.106，靈敏度為89.1%，特異度為62.5%，準(zhǔn)確度為78.2%；以胎盤Klotho蛋白水平≥1.106作為不良妊娠結(jié)局的預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)，其陽性預(yù)測值為77.4%，陰性預(yù)測值為80.0%。見圖2。

3 討論

妊娠期高血壓疾病多發(fā)生于妊娠20周后，可能與胎盤形成不良、氧化應(yīng)激等因素有關(guān)[7]。嚴(yán)重時甚至可致產(chǎn)婦出現(xiàn)抽搐、昏迷等嚴(yán)重癥狀[8]。治療不及時可能致孕婦及圍生兒死亡[9]。改善高齡產(chǎn)婦并發(fā)妊娠期高血壓疾病預(yù)后，密切監(jiān)測母胎情況及早采取診治措施，可降低不良結(jié)局發(fā)生。

圖2 Klotho預(yù)測不良妊娠結(jié)局ROC曲線

胎盤是妊娠期母體與胎兒進(jìn)行物質(zhì)交換、能量代謝的樞紐[10]。妊娠期胎盤及臍帶出現(xiàn)病理變化是母嬰不良結(jié)局的主要原因，且與妊娠并發(fā)癥密切相關(guān)[11]。Klotho蛋白由胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌，其表達(dá)與血管鈣化、高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病、腎病及腫瘤等多種疾病有關(guān)。Dekker等[12]研究表明，妊娠期糖尿病患者胎盤中β-Klotho表達(dá)上調(diào)。邵文佳等[13]研究表明，在妊娠期糖尿病患者胎盤組織中Klotho表達(dá)上調(diào)，且可能與巨大兒發(fā)生機(jī)制有關(guān)。本研究結(jié)果顯示高齡組產(chǎn)婦胎盤Klotho mRNA、Klotho蛋白水平均高于對照組，提示Klotho表達(dá)上調(diào)可能與高齡并發(fā)妊娠期高血壓疾病的發(fā)生有關(guān)。

隨著年齡的增長，女性內(nèi)分泌調(diào)節(jié)能力、生殖功能逐漸降低，血管內(nèi)皮受損程度逐漸增加，出現(xiàn)血管痙攣、子宮供血不足、胎盤缺氧等現(xiàn)象，最終引發(fā)高血壓等并發(fā)癥[14]。俞曉敏等[15]研究表明，高齡是妊娠期高血壓疾病發(fā)生的危險因素，其妊娠期糖尿病、高血壓、胎膜早破及產(chǎn)后出血等發(fā)生率均高于非高齡組，新生兒窒息、早產(chǎn)兒及圍生兒死亡等圍生兒不良結(jié)局的發(fā)生率高于非高齡組。蔡彥等[16]研究表明，高齡產(chǎn)婦并發(fā)妊娠期高血壓疾病組孕胎膜早破、早產(chǎn)、胎膜早剝發(fā)生率及胎兒生長受限發(fā)生率和新生兒死亡率均顯著高于非高齡產(chǎn)婦并發(fā)妊娠期高血壓疾病組。本研究觀察組孕周低于對照組，可見產(chǎn)婦年齡越高，發(fā)生妊娠期高血壓疾病危險性越高，此外，結(jié)果還顯示觀察組胎膜早破、胎盤早剝、早產(chǎn)的發(fā)生率高于對照組，圍產(chǎn)期胎兒生長受限、新生兒死亡的發(fā)生率高于對照組，提示高齡產(chǎn)婦并發(fā)高血壓疾病發(fā)生不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險升高。

本研究合并妊娠期高血壓疾病高齡產(chǎn)婦中，不良妊娠組胎盤Klotho mRNA、Klotho蛋白表達(dá)水平高于正常妊娠組，提示胎盤中Klotho表達(dá)水平可能與妊娠結(jié)局有關(guān)。Loichinger等[17]研究表明，發(fā)生先兆子癇疾病產(chǎn)婦血漿中α-klotho表達(dá)上調(diào)，說明α-klotho水平異?？赡軈⑴c先兆子癇的病理生理學(xué)過程，可能作為預(yù)測先兆子癇的生物學(xué)指標(biāo)。本研究胎盤Klotho蛋白水平診斷不良妊娠結(jié)局的曲線下面積為0.779，診斷分界點(diǎn)為1.106，靈敏度為89.1%，特異度為62.5%，提示其診斷不良妊娠結(jié)局具有較高靈敏度及特異度，當(dāng)水平≥1.106時則預(yù)示不良妊娠結(jié)局，應(yīng)密切關(guān)注產(chǎn)婦臨床情況，盡早進(jìn)行宮內(nèi)治療，必要時可終止妊娠，降低多種并發(fā)癥發(fā)生率。

綜上所述，胎盤Klotho表達(dá)與高齡產(chǎn)婦并發(fā)妊娠期高血壓疾病妊娠結(jié)局有關(guān)，可能作為早期預(yù)測不良妊娠結(jié)局的生物指標(biāo)。然而，本研究僅探討了高齡并發(fā)妊娠期高血壓疾病產(chǎn)婦胎盤Klotho表達(dá)情況及其與妊娠結(jié)局的關(guān)系，其具體生物學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚，仍需進(jìn)一步深入研究。