畢曉麗，張書芬，應璐，張愛芝，張少華，周子焱，邢家溧，李湘江

（寧波市食品檢驗檢測研究院，浙江寧波 315000）

0 引 言

B族維生素是維持人體正常機能與代謝活動不可或缺的水溶性維生素，在人體中若攝入不夠或過量，都易引起機體的相應疾病[1-2]。嬰幼兒配方乳粉作為嬰幼兒生長發(fā)育的主要營養(yǎng)來源，國家強制標準[3-4]中規(guī)定了在嬰幼兒配方乳粉中允許添加的8種B族維生素，并給出了限量范圍。

目前我國標準體系中的檢測方法基本都是針對單一的維生素進行檢測分析的[5-8]，而嬰幼兒配方乳粉中通常會同時添加多種維生素。文獻報道的B族維生素多組分聯(lián)合檢測對象主要為維生素片、保健品[9-13]，基質相對簡單，一般多組分聯(lián)合測定使用單一檢測器，且聯(lián)合測定的目標化合物種類較少[14-17]。本文針對嬰幼兒配方乳粉，通過優(yōu)化前處理和色譜條件，利用DAD和FLD串聯(lián)，建立了一種定性準確、靈敏度高，同時測定維生素B2、B3(煙酸、煙酰胺)和B6（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺）的方法。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

核黃素、煙酸、煙酰胺、鹽酸吡哆醛，鹽酸吡哆醇，鹽酸吡哆胺標準品(購置德國Dr.Ehrenstorfer公司)；鹽酸(分析純)，異丙醇（色譜純），氫氧化鈉(分析純)，甲醇(色譜純)，高氯酸(分析純)，辛烷磺酸鈉(色譜純)，超純水。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260 infinity II高效液相色譜儀(工作站chemstation C.01.07 SR 3,配有DAD和FLD檢測器)、FE28酸度計、Mettler-ME204電子天平、KS-300EI超聲儀。

1.3 標準貯備液的配制

準確稱取100.0 mg核黃素標準品，用2 mL（1∶1，體積比）鹽酸溶液溶解后用水定容至100 mL，在0～4℃避光條件下保存。

分別準確稱取100.0 mg煙酸、煙酰胺，相應的鹽酸吡哆醛、鹽酸吡哆醇、鹽酸吡哆胺標準品，用濃度為0.1 mol/L鹽酸溶液溶解后并定容至100 mL，配成質量濃度為1.0 mg/mL的標準貯備液，在0～4℃避光條件下保存。

1.4 樣品的制備

稱取待測樣品5 g（精確到0.01 g）于50 mL燒杯中，加入25 mL 45～50℃的溫水，渦旋混勻，超聲10 min，靜置冷卻至室溫。然后用濃度為2.5 mol/L鹽酸調節(jié)試樣溶液的pH值至1.7±0.1，放置約1 min后，再用濃度為2.5 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)試樣溶液的p H值至4.5±0.2，混勻，轉移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度后混勻,經濾紙過濾，濾液過0.45μm微孔濾膜，上機待測。

1.5 液相色譜條件

色譜柱：Waters T3柱(250 mm×4.6 mm,5μm)；柱溫：30℃；DAD檢測器，F(xiàn)LD檢測器（見表1），進樣量20μL。流動相A：辛烷磺酸鈉1.5 g，異丙醇20 mL，甲醇70 mL，用水溶解并定容到1 000 mL后，用60%高氯酸調pH值至2.5±0.1，流動相B：甲醇。梯度洗脫程序如表2所示。

表1 檢測器波長變化參數

表2 梯度洗脫參數

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

水溶性維生素存在游離態(tài)和結合態(tài)兩種，游離態(tài)的可以直接用水提取出來，而對于嬰幼兒配方奶粉這樣的復雜基質，結合態(tài)的水溶性維生素通常被基質中的蛋白質或糖等化合物偶聯(lián)或包裹[19]，因此需通過一定的前處理方法在保證維生素結構穩(wěn)定的情況下，將目標物提取出來。

本文選擇用熱水浸泡，超聲波加快樣品分散的方法，使游離態(tài)的維生素進入到提取液中。再優(yōu)化蛋白質沉淀方法將結合態(tài)維生素提取出來，由于傳統(tǒng)的亞鐵氰化鉀與乙酸鋅沉淀蛋白質法會縮短色譜柱的使用壽命，本文主要對等電點沉淀的條件進行了探討。

奶粉中的蛋白質主要為酪蛋白和乳清蛋白，等電點為4.6到4.8，GB5009.89中采用了4.5作為蛋白質沉淀的等電點。由于目前嬰幼兒配方奶粉中一般添加了大量的金屬元素會使溶液中的陽離子偏多，可能會造成等電點有所偏移。所以實驗中考察了pH值為4.1，4.3，4.5，4.7，4.9，5.1對沉淀效果的影響；從沉淀效果來看，p H為4.1、4.3、4.5、4.7時均能達到比較好的澄清效果，上機測試回收率也均在95%～104%之間，p H值為4.9和5.1時，沉淀效果較差?？梢娙榉壑械鞍踪|沉淀對pH的要求并不十分嚴苛，在一定范圍內都能達到比較好的沉淀分離效果，本文選取4.5±0.2作為蛋白質沉淀的等電點條件。

2.2 分析條件的選擇和優(yōu)化

2.2.1 流動相和梯度洗脫程序的優(yōu)化

由于B族維生素屬于極性化合物，它們在一定條件下可以解離成為帶電荷的離子，在反相色譜柱上保留比較弱，因此本研究在參照國標的基礎上在流動相中添加辛烷磺酸鈉作為離子對試劑，延長待測目標物的保留時間，增加分離度。

B族維生素的結構特點決定了其受流動相的pH影響比較大。本文用60%高氯酸調節(jié)流動相A的p H,考察了p H=2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5時在聯(lián)合測定中對峰型、出峰時間及分離度的影響。試驗結果表明采用pH 2.0時，煙酰胺與維生素B2峰部分重疊不能實現(xiàn)很好的分離，當p H=2.5時，6種目標物能很好的分離，進行樣品分析時雜質不會對目標物產生干擾，當pH=3.0和3.5時，煙酸、煙酰胺目標物出峰較早，樣品雜質干擾大。當pH=4.0時，吡哆胺的響應值明顯降低，當pH=4.5時，目標物分離的效果不是很佳。因此，確定流動相A的p H值為2.5。

通過調整流動相比例和梯度洗脫程序，更好的實現(xiàn)了目標物的分離。在優(yōu)化后的色譜條件下，DAD與FLD串聯(lián)，對實際嬰幼兒配方乳粉樣品進行分析，色譜圖如圖1所示。

圖1 樣品中各化合物的色譜

由圖1可以看出，DAD和FLD串聯(lián)，同時獲得兩張譜圖，既發(fā)揮了DAD對目標化合物響應的廣譜性，又發(fā)揮了FLD的抗干擾性和靈敏性，同時兩個檢測器檢測結果相互對照印證，能夠對目標化合物準確定性，定量結果也可以相互進行驗證。

2.2.2 雙檢測器波長的優(yōu)化

對于維生素B2、B3和B6，化合物本身的結構決定了其在DAD檢測器上均具有響應，通過變換波長進行優(yōu)化，實現(xiàn)同時檢測。但對于奶粉這種復雜基質，DAD檢測時，雜質干擾多，目標化合物的定性確認和靈敏度方面均具有一定的局限性。FLD是一種特異性的檢測器，在靈敏度上比DAD檢測器要高一到兩個數量級，而且具有良好的選擇性，能夠有效的避免一些不發(fā)熒光成分的干擾。因此在優(yōu)化DAD檢測條件的基礎上，與熒光檢測器串聯(lián)，可以達到去除干擾，提高檢測靈敏度的效果。

在DAD檢測器上對不同化合物進行全波長掃描獲得各化合物的吸收光譜圖，確定各化合物的最大吸收波長。二極管陣列檢測器獲取的UV光譜與其熒光激發(fā)光譜很相近，兩種光譜的區(qū)別主要由光譜分辨率和光源等因素引起，實際應用中可以忽略不計[18]。因此可以利用二極管陣列檢測器得到的UV光譜作為參考確定熒光檢測器的激發(fā)波長，再通過發(fā)射波長全掃，確定檢測的最佳發(fā)射波長程序，通過以上步驟獲得的高靈敏度波長如表3所示。煙酸和煙酰胺分子結構中不含有產生熒光的結構，在熒光檢測器上響應極低，這里對其不做探討。

表3 各化合物最大吸收波長 nm

2.3 線性范圍及檢出限

將煙酸、煙酰胺配成質量濃度為2，4，6，8，10，20μg/mL的標準系列,維生素B2和維生素B6分別配制成質量濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0，3.0，4.0μg/mL準曲線，以3倍信噪比作為方法檢出限。各組分的回歸方程、線性相關系數、檢出限如表4所示。從表4中可以看出，各目標化合物的線性回歸方程相關系數都在0.99978～0.99999之間，除了DAD測定吡哆胺的靈敏度低于國標外，其他組分的檢出限均在0.002 mg/kg都達到或優(yōu)于國家水平。

表4 線性關系及方法檢出限 mg/kg

2.4 精密度及回收率

選取較小本底的嬰幼兒配方奶粉作為基質，對其進行3水平加標，6平行試驗對待測組分進行方法學考察，其中煙酸，煙酰胺采用DAD的檢測數據，其他組分選用FLD的檢測數據。結果顯示各種維生素的回收率均在91.2%～106.4%之間，相對標準偏差小于2%，具體結果如表5所示。

表5 回收率及精密度測定結果（n=6）

2.5 實際樣品分析

對3批不同嬰幼兒配方乳粉按照本文方法進行檢測，每個樣品檢測6次，具體檢測結果見表6。檢測方法的相對標準偏差均在2.5%以下，方法具有較好的重復性。檢測結果和標簽標示的添加值有很好的對應關系。

表6 實際樣品的檢測結果（n=6）

3 結 論

試驗選用FID與DAD檢測器串聯(lián)技術，建立了一種高效液相色譜法同時測定嬰幼兒配方乳粉中維生素B2、B3和B6的方法。通過系統(tǒng)的方法學驗證，該方法相比國標方法具有高靈敏度、高通量的特點，同時雙檢測器串聯(lián)使定性定量結果更準確。