尹 躍，安 巍，趙建華，王亞軍，樊云芳，曹有龍

（寧夏農(nóng)林科學(xué)院 國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川750002）

黑果枸杞Lycium ruthenicum是茄科Solanaceae枸杞屬Lycium植物，主要分布在中國(guó)西北地區(qū)［1］，野生種質(zhì)資源非常豐富，耐干旱耐鹽堿；其果實(shí)富含類黃酮、花青素、多糖、酚酸和脂肪酸等生物活性物質(zhì)，具有預(yù)防多種疾病的功效［2］，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。目前，對(duì)黑果枸杞果實(shí)活性物質(zhì)的研究較多［2-3］。也有研究利用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）［4］，簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增多態(tài)性（ISSR）［5］和相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）［6］標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)價(jià)，但鮮有利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記的報(bào)道。SSR標(biāo)記是基于生物基因組中由1～6個(gè)核苷酸組成的串聯(lián)重復(fù)序列特性開發(fā)的分子標(biāo)記，具有多態(tài)性豐富、高通量檢測(cè)、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用遺傳圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助育種、種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性分析等［7-10］領(lǐng)域。由于缺乏基因組信息，基于基因組測(cè)序開發(fā)黑果枸杞SSR標(biāo)記成本高，步驟繁瑣［11-12］，SSR標(biāo)記在黑果枸杞種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用受到限制。同時(shí)，美國(guó)生物技術(shù)信息中心（NCBI）中公布的黑果枸杞表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）極少，除了CHEN等［16］研究了基于鹽脅迫下黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組表達(dá)序列標(biāo)簽-簡(jiǎn)單重復(fù)序列（EST-SSR）標(biāo)記開發(fā)之外，基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序黑果枸杞EST-SSR標(biāo)記開發(fā)尚未見報(bào)道。EST-SSR來(lái)源于表達(dá)的基因組區(qū)域，可直接反映相關(guān)基因多樣性，在不同物種間具有良好的通用性；隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)方法快速發(fā)展，基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序已開發(fā)刺梨Rosa roxburghii，中國(guó)櫻桃Cerasus pseudocerasus，馬鈴薯Solanum tuberosum等［13-15］多種植物的SSR標(biāo)記。本研究以前期黑果枸杞抗旱轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，利用生物信息學(xué)方法批量開發(fā)EST-SSR標(biāo)記，并分析其分布特點(diǎn)、組成特征，以期為黑果枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性分析研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)源

取1年生黑果枸杞持續(xù)干旱脅迫下的葉和根，提取RNA后進(jìn)行轉(zhuǎn)綠組測(cè)序（無(wú)參，HiSeqTM2500，北京諾禾致源生物信息科技有限公司），共12個(gè)樣本，計(jì)80 G數(shù)據(jù)。利用Trinnity等軟件［17］對(duì)測(cè)序的數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和組裝，獲得213 058條單基因簇（unigene）作為背景數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2 植物材料及DNA提取

用于SSR引物篩選及評(píng)價(jià)的24份枸杞種質(zhì)資源（表1）均來(lái)自寧夏農(nóng)林科學(xué)院國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心枸杞種質(zhì)資源圃（38°38′49″N， 106°9′10″E）。 利用天根試劑盒（DP5-02， 天根）提取基因組DNA。

1.3 轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)鑒別及引物設(shè)計(jì)

使用MISA軟件（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）搜索Unigene序列的SSR位點(diǎn)。搜索標(biāo)準(zhǔn)為：重復(fù)單元長(zhǎng)度1～6 bp，單核苷酸重復(fù)次數(shù)≥10次，二核苷酸重復(fù)次數(shù)≥6次，三、四、五、六核苷酸重復(fù)次數(shù)≥5次，復(fù)合型SSR位點(diǎn)堿基間隔≤100 bp。

采用BatchPrimer 3軟件（https://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/）對(duì)獲得的SSR位點(diǎn)批量設(shè)計(jì)引物。引物設(shè)計(jì)參數(shù)為：引物長(zhǎng)度18～27 bp（最佳22 bp），GC為40%～70%（最適50%），退火溫度為50～60℃（最適55℃），PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為100～300 bp，其他參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。

1.4 EST-SSR引物篩選及驗(yàn)證

隨機(jī)挑選128對(duì)引物，在上游引物 5′端添加18 bp的 M13通用引物序列（TGTAAAACGACGGCCAGT），3′端保持不變，用FAM熒光集團(tuán)修飾后，由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

PCR擴(kuò)增體系（15.0 μL）：DNA模板1.0 μL，M13通用熒光引物0.1 μL，上游引物和下游引物各0.4 μL， 2×TaqPCR Master Mix 7.5 μL， 雙蒸水 5.6 μL。 PCR 擴(kuò)增在 ABI-2720（應(yīng)用生物系統(tǒng)公司， 美國(guó)）上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 5 min；95℃ 30 s，60～45℃ 30 s，72℃ 30 s，15個(gè)循環(huán)；95℃ 30 s，50℃30 s，72℃30 s，20個(gè)循環(huán)；72℃7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)ABI3730XL DNA（應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國(guó)）檢測(cè)，用LIZ500作為分子量?jī)?nèi)標(biāo)。

表1 供試種質(zhì)材料信息Table 1 Information of twenty-four materials used in this study

1.5 數(shù)據(jù)分析

以SSR出現(xiàn)頻率和SSR平均分布距離描述EST-SSR。公式如下：①SSR出現(xiàn)頻率fc＝c/n×100%，其中c為搜索到的SSR數(shù)量（個(gè)），n為無(wú)余EST數(shù)量（個(gè)）。②SSR平均分布距離fN＝N/c，其中N為無(wú)余EST數(shù)量的總堿基數(shù)（個(gè)）。由GeneMapper 4.0軟件獲得擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小，用DataFormater 2.7軟件［18］將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為PowerMarker v3.25軟件［19］的輸入格式，計(jì)算等位基因數(shù)（number of alleles，NA）、主效等位基因頻率（major allele frequency,fMA）、 期望雜合度（expected heterozygosity，HE）、 觀察雜合度 （observed heterozygosity，HO）和多態(tài)信息量（polymorphism information content，CPI）。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的分布特點(diǎn)

利用MISA軟件對(duì)黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的213 058條Unigene（序列總長(zhǎng)度為262 643 598 bp）序列進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)其中56 170條Unigene序列中含有73 896個(gè)SSR位點(diǎn)，其中13 611條Unigene含有2個(gè)或2個(gè)以上EST-SSR位點(diǎn)?？傮w上，SSR發(fā)生頻率為26.36%，平均3.55 kb出現(xiàn)1個(gè)SSR位點(diǎn)。SSR類型豐富，單核苷酸至六核苷酸重復(fù)類型均存在；單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復(fù)出現(xiàn)頻率占優(yōu)勢(shì)，分別占總SSR的74.33%，13.30%和11.81%；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)類型數(shù)量較少，分別占總數(shù)的0.49%，0.03%和0.04%（表2）。

表2 黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組SSR數(shù)量、類型和頻率Table 2 Frequencies of the different SSR repeat motif types observed in the Lycium ruthenicum transcriptome

2.2 轉(zhuǎn)錄組SSR基序重復(fù)類型和頻率特征

從黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組SSR核苷酸基序重復(fù)類型來(lái)看，73 896個(gè)SSR位點(diǎn)共有84種重復(fù)基元，單核苷酸至六核苷酸重復(fù)分別有2，4，10，26，18和24種。從出現(xiàn)的頻率來(lái)看（表3）：占優(yōu)勢(shì)的前3種重復(fù)單元類型是單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復(fù)基元；單核苷酸重復(fù)基元以A/T為主，占該類型SSR位點(diǎn)總數(shù)的95.64%；二核苷酸主要以AG/CT為主，占二核苷酸總數(shù)的40.42%，其次是AT/AT，AC/GT和CG/CG，分別所占比例為35.37%，23.74%和0.46%；三核苷酸重復(fù)單元以AAC/GTT，AAG/CTT，AAT/ATT，ATC/ATG和ACC/GGT為主，占所有三核苷酸重復(fù)單元的75.88%；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)單元類型較為分散，出現(xiàn)頻率相對(duì)較低，僅為0.56%。

表3 黑果枸杞EST-SSR中重復(fù)基元的類型、數(shù)量及頻率Table 3 Number and frequencies of repeat motif types in Lycium ruthenicum

2.3 SSR引物有效性及多態(tài)性檢測(cè)

為檢測(cè)所開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記的可用性，對(duì)56 170條Unigene序列的73 896個(gè)EST-SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，共得到引物12 674對(duì)。隨機(jī)挑選128對(duì)（包括二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸），以表型性狀差異較大的 ‘黑果枸杞’ ‘寧杞1號(hào)’ ‘寧杞菜1號(hào)’和 ‘中國(guó)枸杞’的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中74對(duì)引物能擴(kuò)增出清晰的擴(kuò)增產(chǎn)物，引物擴(kuò)增有效率為57.8%；其中28對(duì)引物具有多態(tài)性，多態(tài)性引物占有效引物的37.8%。圖1為引物L(fēng)M-02對(duì)4份種質(zhì)的基因型圖。

2.4 SSR位點(diǎn)遺傳多樣性分析

以篩選的28對(duì)多態(tài)性引物對(duì)24份枸杞種質(zhì)作遺傳多樣性分析。共檢測(cè)到等位基因256個(gè)，各引物檢測(cè)到的等位基因?yàn)?～19個(gè)，平均為9.1個(gè)；共檢測(cè)到基因型數(shù)303個(gè)；主效等位基因頻率變化范圍為0.188～0.729，平均值為0.432；觀察雜合度為0.167～0.833，平均值為0.439；期望雜合度為0.433～0.904，平均值為0.712，多態(tài)信息量為0.395～0.897，平均值為0.678。由Botstein理論［20］判定（表4），在開發(fā)出的28個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中有24個(gè)高度多態(tài)位點(diǎn)（CPI≥0.5），4個(gè)中度多態(tài)位點(diǎn)（0.25≤CPI＜0.5）。

3 討論

本研究搜索了黑果枸杞的213 058條Unigene序列，發(fā)現(xiàn)其中的56 170條中含有73 896個(gè)SSR位點(diǎn)，發(fā)生頻率為26.36%；高于中國(guó)櫻桃Cerasus pseudocerasus（15.62%）［14］，馬鈴薯Solanum tuberosum（3.43%）［15］， 夏蠟梅Sinocalycanthus chinensis（21.25%）［16］， 馬尾松Pinus massoniana（4.69%）［23］和中間錦雞兒Caragana intermedia（14.78%）［24］， 低于藍(lán)靛果忍冬Lonicera caeruleavar.edulis（32.51%）［25］， 山桐子Idesia polycarpa（35.00%）［26］， 普通油茶Camellia oleifera（39.67%）［27］和芙蓉李Prunus salicina（54.51%）［28］?？梢姡煌锓N轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率不同，出現(xiàn)差異的原因除了物種本身差異，還可能與分析數(shù)據(jù)庫(kù)大小、SSR挖掘工具及搜索條件有關(guān)［13］。

從重復(fù)單元頻率來(lái)看，黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組的SSR主要類型為單核苷酸重復(fù)基序（74.33%），其次為二核苷酸重復(fù)（13.30%）和三核苷酸重復(fù)（11.81%）。研究發(fā)現(xiàn)：多數(shù)植物中EST-SSR以二核苷酸和三核苷酸為主，但主要的重復(fù)基序類型不同［29］。推測(cè)原因可能與SSR搜索參數(shù)設(shè)置有關(guān)，多數(shù)植物在進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索時(shí)并未將單核苷酸重復(fù)設(shè)置為搜索對(duì)象［13-14］。

本研究從213 058條Unigene序列中鑒定出73 896個(gè)SSR位點(diǎn)，豐富了黑果枸杞EST-SSR標(biāo)記的數(shù)量。為了進(jìn)一步評(píng)估這些EST-SSR引物的質(zhì)量，從設(shè)計(jì)到的12 674對(duì)EST-SSR引物中隨機(jī)挑選出128對(duì)引物，54對(duì)引物未能擴(kuò)增出產(chǎn)物，原因可能是擴(kuò)增產(chǎn)物中存在大量?jī)?nèi)含子或引物設(shè)計(jì)不合理［30-31］；有74對(duì)引物成功擴(kuò)增出產(chǎn)物，引物擴(kuò)增有效性達(dá)57.8%，表明開發(fā)的引物質(zhì)量較高，對(duì)后續(xù)黑果枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助育種等均有應(yīng)用價(jià)值。

圖1 4個(gè)樣本在LM-02位點(diǎn)的基因型Figure 1 Genotypes of 4 samples at LM-02 site

表4 28對(duì)EST-SSR引物對(duì)枸杞種質(zhì)的遺傳多樣性檢測(cè)Table 4 Genetic diversity of 24 wolfberry germplasm revealed by 28 EST-SSR markers