陳臻浩(綜述) 趙廣雷 石晶晟 蔣 勵(lì) 夏 軍(審校)

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院骨科 上海 200040)

軟骨是脊椎動(dòng)物獨(dú)特和重要的組織。在青少年期,軟骨組織作為軟骨內(nèi)成骨的模板不斷生成骨組織;在成年期,軟骨組織主要留在關(guān)節(jié)內(nèi),形成骨骼的關(guān)節(jié)。關(guān)節(jié)軟骨是由軟骨細(xì)胞、纖維和基質(zhì)構(gòu)成的略帶彈性的堅(jiān)韌組織,起到支持、保護(hù)和緩沖作用。很多關(guān)節(jié)疾病都是由于軟骨損傷所造成,如半月板損傷、退行性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)增生、腰椎間盤突出等。想要對(duì)這些疾病進(jìn)行更深入的理解和探究,需要進(jìn)一步澄清軟骨細(xì)胞分化和基質(zhì)產(chǎn)生的分子機(jī)制。Y染色體性別決定區(qū)(sex-determing region of Y chromosome,SRY)-盒轉(zhuǎn)錄因子9(SRY-box transcription factor 9,Sox9)在軟骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)中極為關(guān)鍵[1-3],參與軟骨多個(gè)分化階段的調(diào)控。本文對(duì)近20年來Sox9調(diào)控軟骨發(fā)育的研究進(jìn)行綜述。

Sox9在軟骨分化中的作用Sox9最早于1993年在一種性別反轉(zhuǎn)畸形疾病(campomelic dysplasia,CD)的研究中被發(fā)現(xiàn),CD綜合征是一種先天性可致死性軟骨發(fā)育異常綜合征[4]。Sox9基因是位于Y染色體上SRY基因的同源基因(17q24.3～q25.1),其編碼產(chǎn)物有509個(gè)氨基酸多肽[5-6],是一種與軟骨形成、性別分化、神經(jīng)系統(tǒng)以及心臟發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。Wagner等[7]和Foster等[8]證實(shí),人類骨骼形態(tài)異常綜合征及軀干發(fā)育異常是由于Sox9基因內(nèi)和基因周圍的雜合突變?cè)斐傻?。這種常染色體顯性疾病在圍產(chǎn)期常導(dǎo)致胎兒呼吸窘迫而死亡,即使出生,患者常常伴隨不成比例的身材矮小、四肢鞠躬、低位耳朵、鼻梁凹陷、馬蹄內(nèi)翻足、長(zhǎng)人中和小頜畸形等臨床特征。除了骨骼缺陷之外,這種疾病常伴有XY性反轉(zhuǎn)和心臟等內(nèi)臟器官的畸形。這一發(fā)現(xiàn)引發(fā)了后續(xù)研究,以探究Sox9在骨骼發(fā)生和其他組織發(fā)育過程中的作用。

Sox9是調(diào)控軟骨分化的主要基因多項(xiàng)研究表明Sox9是激活軟骨細(xì)胞的特異性因子,因此提出了Sox9是軟骨形成的主要調(diào)節(jié)因子,是軟骨形成所必需的。Sox9雜合子缺失的小鼠幾乎完全復(fù)制了人類軀干發(fā)育異常的骨骼異常,并且像許多相同突變的患者一樣,Sox9雜合子缺失的小鼠在出生后不久就死亡[9]。Bi等[10]構(gòu)造了含Sox9胚胎干細(xì)胞,并用來產(chǎn)生小鼠胚胎嵌合體,在這些含Sox9胚胎干細(xì)胞中用LacZ取代了Sox9編碼序列,以便追蹤表達(dá)Sox9無效等位基因的突變細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn),在中期胚胎嵌合體的所有骨骼發(fā)育間充質(zhì)中,這些細(xì)胞與野生型細(xì)胞相混合,但在晚期階段這些細(xì)胞沒有出現(xiàn)在軟骨前體細(xì)胞聚集過程和軟骨原基內(nèi)。即便一些細(xì)胞簇靠近軟骨原基,也不能表達(dá)軟骨標(biāo)記,如Col2a1、Col11a2和Agc1。Akiyama等[3]在骨骼發(fā)生早期使用噬菌體P1的Cre重組酶/loxP重組系統(tǒng)在骨骼發(fā)生的早期階段滅活了小鼠的Sox9基因,發(fā)現(xiàn)在軟骨前體細(xì)胞聚集之前,肢芽間質(zhì)中Sox9的失活會(huì)導(dǎo)致間充質(zhì)細(xì)胞聚集異常以及隨后的軟骨和骨形成阻礙。Sox9可以通過上調(diào)細(xì)胞骨架組裝基因、同型細(xì)胞間黏附和對(duì)異型細(xì)胞排斥的基因(如Sema3c和Sema3d)來確保軟骨前細(xì)胞的凝聚和存活[11]。這些研究充分證實(shí)Sox9在軟骨細(xì)胞分化過程中不可或缺。

除了Sox9,Sox5和Sox6基因在軟骨細(xì)胞分化過程中也起到重要的作用。Smits等[12]和Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn),Sox5和Sox6雙無效小鼠易發(fā)展成嚴(yán)重、廣泛的軟骨發(fā)育不全,而Sox5無效或Sox6無效的小鼠出生時(shí)只存在輕微骨骼受損。在Sox5和Sox6雙突變體中,即使Sox9表達(dá)正常,軟骨細(xì)胞也在軟骨前細(xì)胞聚集階段被阻滯。新的研究發(fā)現(xiàn)Sox6在軟骨形成-骨生成的協(xié)調(diào)中發(fā)揮重要作用。以上小鼠的功能喪失和獲得性實(shí)驗(yàn)證明,Sox9、Sox5和Sox6形成的轉(zhuǎn)錄因子三重組在軟骨形成中起決定性作用[10,13-14]。

Sox9不僅是有效的轉(zhuǎn)錄激活因子,還可抑制非必需基因,如Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt related transcription factor 2,Runx2)基因。然而,這些發(fā)現(xiàn)仍然存在疑問:迄今為止進(jìn)行的ChIP-seq研究發(fā)現(xiàn)Sox9與活性增強(qiáng)劑和啟動(dòng)子強(qiáng)結(jié)合,而不與轉(zhuǎn)錄抑制標(biāo)記的基因組區(qū)域結(jié)合,因此可能是間接機(jī)制,例如Sox9激活轉(zhuǎn)錄抑制因子。另一種轉(zhuǎn)錄活性假說是:在軟骨細(xì)胞中,Sox9是先驅(qū)因子,即一種結(jié)合濃縮染色質(zhì)的因子,并在軟骨細(xì)胞分化時(shí)誘導(dǎo)軟骨特異性基因活化所必需的表觀遺傳修飾[15]。要證明Sox9是決定和維持軟骨細(xì)胞譜系命運(yùn)的軟骨源性先驅(qū)因子,還需要更多的數(shù)據(jù)支持。

Sox9依賴的轉(zhuǎn)錄機(jī)制Sox9通過抑制Runx2和β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性來促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化。在軟骨內(nèi)骨化發(fā)生時(shí),軟骨細(xì)胞來自與成骨細(xì)胞相同的間充質(zhì)祖細(xì)胞。這些被稱為骨軟骨祖細(xì)胞的細(xì)胞具有雙相性,可表達(dá)Sox9、Runx2和β-連環(huán)蛋白。Runx2是決定成骨細(xì)胞命運(yùn)和早期分化的轉(zhuǎn)錄因子[13]。β-連環(huán)蛋白是Wnt經(jīng)典途徑的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)導(dǎo)子,其蛋白質(zhì)水平在成骨前體細(xì)胞中上調(diào),在軟骨前體細(xì)胞中下調(diào)。在骨軟骨祖細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化并抑制成軟骨細(xì)胞分化[16]。Sox9與β-連環(huán)蛋白結(jié)合并抑制β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性,部分是通過誘導(dǎo)β-連環(huán)蛋白的降解[17]。Sox9對(duì)Runx2發(fā)揮顯著的抑制作用,可能通過泛素介導(dǎo)蛋白酶體依賴途徑磷酸化依賴途徑,或通過溶酶體來促進(jìn)Runx2降解[18],其中SCF家族E3泛素連接酶(E3 ubiquitin protein ligase,Skp2)通過蛋白酶體途徑介導(dǎo)Runx2降解。

p300、Smad3、ZNF606、KLF15和DDRGK1等輔助因子可能與Sox9組裝成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物[19-23]。這些因子直接或間接與Sox9結(jié)合,在軟骨細(xì)胞特異性基因上招募Sox9,并與Sox9配合激活轉(zhuǎn)錄。他們的基因喪失突變可以引起軟骨發(fā)育不良。Tan等[24]和He等[25]通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí),GLI因子作為介導(dǎo)Hedgehog信號(hào)傳遞的鋅指蛋白,在增殖和肥大前軟骨細(xì)胞中與Sox9有功能上的相互作用;在向肥大過渡的過程中,JUN和FOSL2形成的激活蛋白1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物與Sox9相互作用;Sox9與FOXA2(forkhead box A2)因子之間的競(jìng)爭(zhēng)可能在調(diào)節(jié)包括Col10a1在內(nèi)的肥大標(biāo)記物中起決定作用。Scleraxis(Scx)是組織特異性堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)節(jié)肌腱和韌帶祖細(xì)胞的分化。Col2a1的表達(dá)受Sox9和Scx的適當(dāng)轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激。Scx與其他bHLH蛋白二聚化的配偶體E47協(xié)同增強(qiáng)Sox9依賴性轉(zhuǎn)錄。共激活物(p300)在Scx和E47協(xié)同作用下,增加Sox9調(diào)節(jié)的軟骨標(biāo)志基因活性,免疫共沉淀分析顯示Scx和E47與Sox9和p300形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。這些結(jié)果表明,Scx和E47可能通過與Sox9相關(guān)的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物結(jié)合,并通過與Col2a1啟動(dòng)子上保守的E盒序列相結(jié)合,來調(diào)節(jié)初期軟骨形成[26]。

Sox9還招募介體復(fù)合體,并將其與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)RNA聚合酶Ⅱ周圍的一般轉(zhuǎn)錄裝置連接起來。Nakamura等[27]證明Sox9、Wwp2和Med25相互作用,他們是中間介導(dǎo)復(fù)合體的組成部分,是軟骨形成中各種因子相互作用的基礎(chǔ)。Matrilin-1(Matn1)為軟骨基質(zhì)蛋白,屬于多結(jié)構(gòu)域銜接蛋白家族,它通過形成膠原依賴和不依賴的細(xì)絲并與聚集蛋白聚糖相互作用來促進(jìn)軟骨基質(zhì)的組裝。為揭示軟骨特異性基因在生長(zhǎng)板中交錯(cuò)表達(dá)的機(jī)制,Nagy等[28]剖析了驅(qū)動(dòng)Matn1基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄機(jī)制。在Matn1近端啟動(dòng)子進(jìn)化保守的順式作用元件限制生長(zhǎng)板增殖區(qū)和前肥大區(qū)的軟骨表達(dá)。近端元件包括與Sox三重組結(jié)合的Pe1元件、結(jié)合Nfi蛋白的SI元件和結(jié)合Sox三重組及其他因子的啟動(dòng)子Ine元件。Sox5/Sox6與Ine相結(jié)合以及Nfi與SI相結(jié)合通過蛋白質(zhì)劑量依賴性方式調(diào)節(jié)Sox9反式激活。結(jié)果表明,Sox招募介體復(fù)合體與保守的Matn1近端元件結(jié)合并且彼此相互作用,從而在軟骨生長(zhǎng)板的特定區(qū)域中微調(diào)基因表達(dá)。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)[29],在早期軟骨形成中高遷移率族1(high mobility group box 1,Hmgb1)過表達(dá)增加了Sox三重組引起的Matn1啟動(dòng)子激活,且在COS-7細(xì)胞中Hmgb1大量表達(dá)促進(jìn)了Sox三重組誘導(dǎo)的Matn1表達(dá)。由此證明,Hmgb1有助于Sox三重組募集到Matn1啟動(dòng)子并促進(jìn)早期軟骨發(fā)生。

Sox9被確定為軟骨形成主要基因之后,大量研究進(jìn)一步揭示Sox9在軟骨形成中的具體機(jī)制。研究顯示Sox9蛋白的翻譯后修飾,包括磷酸化,乙酰化和SUMO化,在軟骨形成中影響Sox9依賴性轉(zhuǎn)錄。 Rho激酶與Sox9相互作用并直接在絲氨酸181處磷酸化[30],而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)增加Sox9絲氨酸211處磷酸化[31]。這種修飾引起了Sox9的核積累,提高了Sox9與DNA結(jié)合的效率,增加了轉(zhuǎn)錄活性。Sox9蛋白也被活化的STAT1蛋白抑制劑(protein inhibitor of activated STAT 1,PIAS1)修飾,但PIAS1是抑制還是刺激Sox9活性尚不清楚[32],需要進(jìn)一步研究來闡明Sox9翻譯后修飾的功能性結(jié)果。

這幾種Sox蛋白在軟骨形成的多個(gè)步驟中都是必需的。Sox9維持從祖細(xì)胞到肥大軟骨細(xì)胞的過程,它與Sox5/Sox6有效地促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化,并在生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞成熟過程中與不同的轉(zhuǎn)錄因子相互作用。

Sox9相關(guān)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控表觀遺傳學(xué)被定義為不涉及根本的DNA信息變化的可遺傳基因調(diào)節(jié)。表觀遺傳也是成軟骨分化的主要調(diào)控機(jī)制之一,在決定其分化方向上起到重要作用。表觀遺傳調(diào)控包括DNA甲基化、組蛋白修飾、微小RNA調(diào)控和染色質(zhì)重塑等[33]。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶分析顯示,包含多個(gè)Sox9結(jié)合序列的染色質(zhì)化DNA模板的組蛋白乙?；赟ox9和p300存在下被激活。E74樣因子3(E74 like ETS transcription factor 3,ELF3)通過抑制Sox9-CBP/p300驅(qū)動(dòng)的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性來調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞中Sox9表達(dá),從而影響軟骨細(xì)胞基質(zhì)的產(chǎn)生[34]。該研究表明Sox9相關(guān)的共激活物p300在軟骨發(fā)生的表觀遺傳學(xué)中是必需的。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)是TGF-β超家族成員之一,通過增強(qiáng)核因子Y(nuclear factor Y,NF-Y)-p300復(fù)合物與Sox9啟動(dòng)子之間的相互作用來刺激Sox9的表達(dá)。BMP2還能在染色質(zhì)的Sox9基因上誘導(dǎo)組蛋白高乙?；痆35]。

KDM4B是含有組蛋白脫甲基酶的Jumonji-C結(jié)構(gòu)域,可選擇性使H3K9me3脫甲基至H3K9me1,同時(shí)保持H3K9me2不變[36]。TGF-β誘導(dǎo)的KDM4B從Sox9基因啟動(dòng)子中除去H3K9me3,從而促進(jìn)Smad2/3結(jié)合到Sox9基因啟動(dòng)子[37]。Hata等[38]將AT豐富的交互區(qū)5b(AT rich interactive domain 5B,Arid5b)識(shí)別為Sox9的轉(zhuǎn)錄共同調(diào)控因子。Arid5b將組蛋白賴氨酸脫甲基酶募集到Sox9靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域,并刺激這些基因的H3K9me2去甲基化來促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化。

微小RNA(microRNA)是一類長(zhǎng)度為21～25 nt的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA,可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶mRNA特異結(jié)合,剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或抑制其翻譯。miRNA-449a對(duì)淋巴增強(qiáng)結(jié)合因子1具有直接抑制作用,進(jìn)而抑制Sox9的表達(dá)量[39]。Thompson等[40]發(fā)現(xiàn)一種小分子GTP酶(RAS like proto-oncogene A,RALA)是miR-140-5p的新靶點(diǎn),在成軟骨分化的早期抑制RALA可以導(dǎo)致Sox9表達(dá)明顯上調(diào)。Sox9基因的3’非編碼區(qū)存在miR-495的結(jié)合位點(diǎn)[41],miR-495能直接結(jié)合到該位點(diǎn)對(duì)Sox9進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)。過度表達(dá)miR-495抑制Sox9和軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá),如Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖和蛋白多糖產(chǎn)物等。Mak等[42]報(bào)道了miRNA-145在人軟骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)。miRNA-145與Sox9 RNA的結(jié)合可降低Sox9蛋白水平。Wa等[43]通過miRNA陣列分析篩選出miR-30b是TGF-β3誘導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞成軟骨分化的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子,其直接靶向Sox9而起作用。這些研究部分闡明了Sox9在軟骨形成中的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。

結(jié)語Sox9在決定軟骨細(xì)胞的命運(yùn)和分化中起著重要作用,多種因子參與Sox9的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物形成。目前對(duì)Sox9與這些因子相互作用的方式和關(guān)系仍有很多未知,Sox9在軟骨發(fā)生過程中的作用譜尚未得到完整解答。Sox9在成為轉(zhuǎn)錄激活劑之前是否是一個(gè)先驅(qū)因子,它能直接抑制相關(guān)基因嗎？有關(guān)Sox9轉(zhuǎn)錄和翻譯后調(diào)控及其對(duì)軟骨發(fā)生的影響等問題同樣沒有得到解答。通過CRISPR/Cas介導(dǎo)的基因組編輯等先進(jìn)技術(shù)進(jìn)一步研究這些問題,對(duì)揭示軟骨發(fā)育分子機(jī)制有重要作用,并可為軟骨退行性疾病中組織再生提供新策略。