彭青，李榮麗，湯佩琦，葉兵兵

（四川民族學院農(nóng)學院，四川 康定 626001）

藏豬是世界上少有的高原型豬種，是我國寶貴的地方品種資源，主要分布于四川、甘肅、云南、西藏、青海等高寒地區(qū)[1]。藏豬生活在高海拔地區(qū)，能夠適應惡劣的氣候環(huán)境，具有耐寒冷、抗病能力強、耐粗飼等特點，其肉質(zhì)鮮美，具有很好的市場前景。隨著藏豬人工養(yǎng)殖的擴大，一些細菌性疾病越來越突出，腹瀉就是影響藏豬生長發(fā)育的重要因素之一。本文筆者及其團隊對甘孜州畜科所及當?shù)剞r(nóng)戶飼養(yǎng)的藏豬腹瀉物進行了細菌的分離鑒定及藥敏試驗，為藏豬腹瀉的有效防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料采集 在甘孜州康定地區(qū)藏豬保種場及當?shù)剞r(nóng)戶無菌采集藏豬腹瀉物樣本30份。

1.2 試劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基、瓊脂糖、革蘭氏染劑、細菌DNA試劑提取盒、27F和14R上下游引物、Mix、ddH2O、藥敏試劑片等，均購自成都某生物科技有限公司。

1.3 儀器 恒溫培養(yǎng)箱、恒溫振蕩箱、臺式離心機、PCR基因擴增儀、電泳儀、光學顯微鏡等。

1.4 試驗方法

1.4.1 細菌分離 在超凈工作臺上，將采集來的腹瀉病料接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在37℃恒溫振蕩箱中增菌培養(yǎng)18～24h；用平板劃線法將擴增菌液分別接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，并編號；接種完成后將培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h；根據(jù)菌落形態(tài)及顏色特點分離純化培養(yǎng)24h。

1.4.2 鏡檢 挑取分離純化的單個菌落進行革蘭氏染色、鏡檢。

1.4.3 細菌DNA模板制備 將純化后的細菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在37℃恒溫振蕩箱中培養(yǎng)18～24h，將培養(yǎng)得到的菌液用細菌DNA提取試劑盒提取細菌的DNA。

1.4.4 PCR 擴增 取 ddH2O 3.2 μL，Mix 5 μL，27F和14R上下游引物各0.4μL，細菌DNA 1μL，共10μL進行PCR擴增。擴增條件：94℃預變性4 min；94℃變性 50 s、56℃退火 45 s、72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。取反應產(chǎn)物1μL用瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)EB染色后置于紫外燈下觀察并拍照。

1.4.5 藥敏試驗 將分離得到的混合菌株采用K-B紙片擴散法進行藥敏試驗：用無菌鑷子依次將藥敏試劑片貼于MH瓊脂培養(yǎng)基上，并做好標記；然后放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈的直徑[2]。

2 結果與分析

2.1 細菌生長情況 在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上普遍存在兩種菌落，分別是紅色或粉紅色、圓形、表面光滑的菌落和透明或半透明的圓形菌落。如圖1所示。

2.2 鏡檢結果 在10×100倍油鏡下觀察可見兩端鈍圓的革蘭氏陰性短小桿菌，有的呈多種形態(tài)，散在或成對排列（見圖2），可初步鑒定為大腸桿菌和變形桿菌[3]。

2.3 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果 見圖3。

圖1 細菌生長情況

圖2 鏡檢結果

圖3 PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果

表1 混合菌藥敏試驗結果

2.4 藥敏試驗結果 由表1可知，混合菌對頭孢曲松極度敏感，對丁胺卡那霉素高度敏感，對恩諾沙星、新霉素、氟苯尼考、慶大霉素、強力霉素、四環(huán)素低度敏感，對復方新諾明、鏈霉素、氨芐西林、青霉素有耐藥。

3 小結

3.1 本試驗通過對藏豬腹瀉物進行細菌分離、培養(yǎng)、鏡檢、PCR測序，得到腹瀉物中的細菌主要是大腸桿菌和變形桿菌。

3.2 藥敏試驗表明，混合菌對頭孢曲松極度敏感，對丁胺卡那霉素高度敏感，對恩諾沙星、新霉素、氟苯尼考、慶大霉素、強力霉素、四環(huán)素低度敏感，對復方新諾明、鏈霉素、氨芐西林、青霉素有耐藥。故在臨床防治時應避免使用復方新諾明、鏈霉素、氨芐西林、青霉素這類的抗生素，適當性使用頭孢曲松、丁胺卡那霉素，并且交替使用不同的抗生素以免耐藥。

3.3 由于試驗時間、空間等的限制，本次采集的樣本較少，不能代表本地區(qū)的所有情況，若要說明本地區(qū)的整體情況，還需采集更多的樣本進行進一步研究。本試驗結果僅供參考，不可作為臨床用藥的依據(jù)。