梁坤倫,賈存智,孫金豪,王明艷,傅華,毛祝新

(1.黃河科技學院, 河南 鄭州 450063；2.蘭州大學草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院，甘肅 蘭州 730020；3.陜西省西安植物園, 陜西省植物研究所, 陜西 西安 710061)

青藏高原地域遼闊，環(huán)境氣候獨特，植物資源豐富，是我國重要的畜牧業(yè)生產(chǎn)基地[1]。多年來，由于氣候變化和超載放牧等原因，天然草地不斷退化，草地沙化和水土流失問題突出[2]。高寒草地生態(tài)修復是解決上述問題的關(guān)鍵，包括對退化草地進行改良和建設(shè)優(yōu)質(zhì)草場[3]。但是，高寒地區(qū)種植的牧草必須具備較強的耐寒性[4]。前人研究發(fā)現(xiàn)，高原地區(qū)鄉(xiāng)土草更適宜高寒草地建植[4-5]。這是因為該類植物在漫長的進化過程中，充分適應低溫環(huán)境。所以，收集和篩選高寒草原野生牧草種質(zhì)，可促進人工草地建設(shè)，有利于青藏高原草地生態(tài)修復。

垂穗披堿草(Elymusnutans)是禾本科(Gramineae)披堿草屬(Elymus)多年生草本植物，分布海拔范圍2500～4000 m，是青藏高原地區(qū)的重要牧草[5]。垂穗披堿草在高寒地區(qū)廣泛分布，是由于其在長期的適應性演化過程中形成一套完善的抗氧化防御系統(tǒng)，能夠有效抵御低溫對其生理特性的損傷[4-5]。在低溫脅迫下，植物細胞內(nèi)活性氧過量積累，細胞膜透性增加，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)作為植物細胞中第一道抗氧化防線，能夠?qū)⒊蹶庪x子自由基轉(zhuǎn)換為H2O2，過氧化物酶(peroxidase, POD)能夠?qū)2O2進一步分解，消除由于活性氧積累對細胞的毒害作用[6]。在低溫脅迫下，垂穗披堿草的SOD和POD活性增強[7]；游離脯氨酸和可溶性糖含量增加[8]。研究人員發(fā)現(xiàn)垂穗披堿草耐寒性與種質(zhì)有關(guān)，付娟娟等[4]研究發(fā)現(xiàn)，西藏當雄地區(qū)的垂穗披堿草耐寒性優(yōu)于甘肅甘南州種質(zhì)。張尚雄等[8]研究表明，西藏不同地區(qū)披堿草屬植物的耐寒性也存在較大差異，青縣野生垂穗披堿草>同德老芒麥(Elymussibiricus)>那曲縣野生垂穗披堿草。這說明垂穗披堿草的耐寒性受遺傳控制，不同種質(zhì)之間存在差異。本研究從青藏高原收集10種野生垂穗披堿，通過低溫模擬試驗，探討不同低溫脅迫時間對生理代謝的影響。根據(jù)種質(zhì)低溫生理應答，篩選耐寒性強的種質(zhì)材料，以期為高寒草地生態(tài)修復提供優(yōu)良種質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料于2012年采收自青海省、甘肅省和四川省高寒草地。本試驗選取10份種質(zhì)進行耐寒性生理研究。種源地地理坐標和種質(zhì)生境見表1。

1.2 試驗設(shè)計

選取成熟飽滿種子，經(jīng)0.1%(W/V)次氯酸鈉溶液消毒，用蒸餾水沖洗，均勻置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，然后將培養(yǎng)皿置于人工氣候箱(光通量密度350 μmol·m-2·s-1，光期14 h，25 ℃，濕度70%；暗期10 h，20 ℃，濕度60%)中萌發(fā)。萌發(fā)后7 d進行移栽，將長勢一致的幼苗轉(zhuǎn)移至育苗盤中，每盤40苗，采用沙培的方式在人工氣候箱中繼續(xù)進行幼苗培養(yǎng)，期間幼苗每5 d澆1次Hoagland營養(yǎng)液。28 d后開始進行低溫脅迫處理，每個處理3個生物學重復。處理前，材料先放進15 ℃培養(yǎng)箱中預冷24 h，之后按照2.5 ℃·h-1的速度降至4 ℃，以25 ℃生長材料為對照(CK)，開始低溫脅迫8、24和72 h。各時間節(jié)點，剪取不同葉位葉片并混合，樣品稱重后錫紙包裹，經(jīng)液氮速凍后放入-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 垂穗披堿草種源地坐標和氣象數(shù)據(jù) Table 1 The source and meteorological data of 10 germplasms of E. nutans

注：下文圖表中出現(xiàn)的材料名稱均以此表中編號表示。

Note:The codes of material names will be used in following Figures and Tables.

1.3 測定指標

采用電導法測定細胞膜透性[9]，以葉片電導率表示；采用分光光度法測定葉綠素含量[9]；采用茚三酮法測定游離脯氨酸(free proline, Pro)含量[9]；可溶性糖(soluble sugar, SS)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性含量參照《植物生理學實驗教程》[10]測定。

1.4 參試材料苗期耐寒性綜合評價

1.4.1耐寒性評價方法 參試材料的耐寒性評價采用隸屬函數(shù)法[11]，各指標的隸屬函數(shù)值：

μ(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中:Xj表示第j個指標值，Xmin表示第j個指標的最小值，Xmax表示第j個指標的最大值，如某一指標與耐寒性呈負相關(guān)，可用反隸屬函數(shù)計算其耐寒隸屬函數(shù)值，即μ(Xj)=(Xmax-Xj)/(Xmax-Xmin)。

式中：Wj表示第j個指標的權(quán)重。

式中：D表示各材料耐寒性綜合評價值，D值越大表明耐寒性越強。

1.4.2耐寒性評價分級標準 參試材料耐寒性D值可以分為3級[8]。Ⅰ級：綜合評價值0.7以上，為耐寒性強；Ⅱ級：綜合評價值為0.5～0.7，為耐寒性中等；Ⅲ級：綜合評價值在0.5以下，為耐寒性弱。

1.5 數(shù)據(jù)處理

應用SPSS 16.0進行單因素方差分析，LSD法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 垂穗披堿草對低溫脅迫的生理響應

2.1.1低溫對葉片膜透性的影響 植物遭受低溫冷害時，膜脂發(fā)生相變，膜透性增加，溶質(zhì)向胞外滲透。所以，細胞質(zhì)膜相對透性可反映低溫下細胞膜受傷害的程度。從圖1可以看出，低溫脅迫下參試材料葉片相對膜透性增加，增幅最大的是種質(zhì)ZQ、REG、LQ、LT、GC和AB。不同低溫脅迫時間對相對膜透性的影響不同，種質(zhì)REG和AB細胞膜受損最嚴重，低溫脅迫8 h時葉片膜透性顯著增加318%和143%，但在24和72 h處理間無顯著差異。種質(zhì)ZQ、LQ、LT和GC在8 h時比對照顯著增加61%、42%、23%和108%，在低溫脅迫24 h時膜透性達到最大，脅迫72 h時趨于穩(wěn)定，分別恢復了5%、2%、15%和2%。在8 h低溫處理下，材料MQ、XH、ZN和HZ葉片相對膜透性增加，經(jīng)24和72 h低溫脅迫，葉片膜透性顯著高于對照。參試材料中，MQ、XH和HZ膜透性相對較小，低溫脅迫72 h時相對膜透性較24 h時分別降低18%、43%和38%，表明這3種材料葉片細胞膜受損較小，對低溫脅迫的耐受性更強。

圖1 低溫對垂穗披堿草葉片相對膜透性的影響Fig.1 Effect of low temperature on relative membrane permeability of E. nutans 不同小寫字母表示同一材料在不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同。Different lowercase letters indicate significant difference within the same material among different treatments (P<0.05), the same below.

2.1.2低溫對葉綠素含量的影響 低溫脅迫下，葉綠素的合成速率受到抑制。本試驗中，低溫脅迫下垂穗披堿草葉綠素含量先降低后增加(圖2)。在8 h處理下，種質(zhì)材料葉綠素含量均降低，種質(zhì)ZQ和LQ葉綠素含量降幅最小，僅為3%和4%，其他種質(zhì)葉綠素含量顯著降低。種質(zhì)XH、ZN和GC降幅最大，分別降低17%、18%和21%。在24 h時，葉綠素含量繼續(xù)降低，不同種質(zhì)降幅不同。其中，ZQ降幅最小，低于對照9%，ZN、REG和GC降幅最大，分別降低41%、36%和37%。在72 h時，各種質(zhì)材料葉綠素含量不同程度增加，增幅最大的是ZN和GC，分別比24 h時增加39%和40%。材料ZQ、XH和LQ分別比24 h時增加2%、2%和3%。本試驗中，低溫處理24 h時，葉片葉綠素含量最低；低溫處理72 h時，葉片葉綠素含量較24 h有所增加，其中種質(zhì)ZQ、XH和LQ葉綠素含量與CK無顯著性差異，其他種質(zhì)含量顯著低于CK(P<0.05)。

圖2 低溫對垂穗披堿草葉綠素含量的影響Fig.2 Effect of low temperature on chlorophyll content of E. nutans

2.1.3低溫對游離脯氨酸含量的影響 低溫脅迫下不同種質(zhì)葉片脯氨酸含量逐漸增加(圖3)。在低溫脅迫8 h時，種質(zhì)XH、LQ和AB游離脯氨酸含量增加最多，分別比對照增加58%、59%和90%，種質(zhì)GC增幅最小，僅為11%；在低溫脅迫24 h時，種質(zhì)ZQ、LQ和AB游離脯氨酸增幅最大，分別比對照增加83%、84%和94%，種質(zhì)GC增幅最小，僅為44%。在低溫脅迫72 h時，參試材料的游離脯氨酸含量繼續(xù)增加，均顯著高于CK(P<0.05)，增幅為87%～99%。需要指出的是，在低溫脅迫下，除種質(zhì)GC外，其他種質(zhì)游離脯氨酸含量均顯著高于對照(P<0.05)。

圖3 低溫對垂穗披堿草游離脯氨酸含量的影響Fig.3 Effect of low temperature on free proline content of E. nutans

2.1.4低溫對可溶性糖含量的影響 垂穗披堿草可溶性糖在低溫脅迫下逐漸增加(圖4)。在低溫處理8 h時，種質(zhì)MQ、ZN、REG、LQ和AB可溶性糖含量顯著增加，其中種質(zhì)ZN可溶性糖含量增幅最大(128%)。但是該處理下種質(zhì)ZQ比CK降低12%；低溫處理24 h時，種質(zhì)ZN和LT可溶性糖含量增加最多，比CK顯著增加100%和104%，種質(zhì)GC增幅最小，比CK含量增加14%；低溫處理72 h時，種質(zhì)ZN可溶性糖含量比24 h處理顯著增加54%，比CK增加208%。種質(zhì)XH可溶性糖含量比24 h處理降低24%，但是比CK顯著增加12%。本試驗中，不同低溫脅迫時間內(nèi)種質(zhì)ZN和LT可溶性糖含量增幅最大，種質(zhì)ZQ、MQ和HZ較為穩(wěn)定，這說明ZN和LT耐寒性相對較強，ZQ、MQ和HZ耐寒性較為穩(wěn)定，且能經(jīng)受72 h的低溫脅迫，說明上述種質(zhì)能夠耐受較長時間的低溫脅迫，其低溫耐受性可以用可溶性糖含量評估。

2.1.5低溫對酶活性的影響 垂穗披堿草葉片SOD和POD活性在低溫脅迫下先增加后降低，但不同種質(zhì)變化幅度不同。低溫脅迫8 h時，種質(zhì)MQ的SOD活性顯著增加(P<0.05)，比CK增加109%，種質(zhì)REG和GC增幅最小，分別比CK增加5.0%和0.2%；低溫處理24 h時，種質(zhì)MQ和LT的SOD活性增幅最大，分別比CK增加147%和148%。但種質(zhì)GC和AB的SOD活性增幅較小，分別比CK增加18%和22%；低溫處理72 h時，種質(zhì)ZQ和LT的SOD活性分別比CK增加57%和43%，種質(zhì)ZN和REG的SOD活性分別比CK降低49%和24%。本試驗中，低溫處理24 h時，葉片SOD活性最高；低溫處理72 h時，種質(zhì)ZQ和LT葉片SOD活性顯著高于CK(P<0.05)，種質(zhì)ZN和REG顯著低于對照(P<0.05)，其他種質(zhì)SOD活性與CK無顯著差異。

圖5 低溫對垂穗披堿草SOD活性的影響Fig.5 Effect of low temperature on SOD activity of E. nutans

圖6 低溫對垂穗披堿草POD活性的影響Fig.6 Effect of low temperature on POD activity of of E. nutans

低溫脅迫下，垂穗披堿草葉片POD和SOD活性的變化趨勢基本一致，但不同種質(zhì)的POD活性變化存在差異(圖6)。低溫處理8 h時，種質(zhì)GC和AB的POD增幅最大，顯著增加251%和221%，種質(zhì)HZ增幅最小，僅增加13%。低溫處理24 h時，種質(zhì)GC的POD活性繼續(xù)增加，較CK增加257%，種質(zhì)HZ增幅最小，較CK增加49%。低溫處理72 h時，種質(zhì)GC的POD活性顯著增加(P<0.05)，較CK增加220%。種質(zhì)MQ和AB比CK低3%和30%。本試驗中，低溫處理8 h時，各種質(zhì)葉片POD活性均顯著高于CK；低溫處理24 h時，除種質(zhì)AB外，其他種質(zhì)POD活性均達到最高。低溫處理72 h時，葉片POD活性降低，但種質(zhì)ZQ、HZ、LQ、LT和GC顯著高于CK。

2.2 種質(zhì)耐寒性綜合評價

為減少不同處理結(jié)果在耐寒性評價中存在的相互覆蓋，參照各指標相對值變異系數(shù)[8,12]，本試驗選取低溫脅迫24 h的指標變化率評價其耐寒性。先通過主成分分析判斷各成分的貢獻率，再計算抗寒隸屬函數(shù)值。主成分分析結(jié)果顯示，3個主成分的貢獻率依次為40%、29%和22%，累計貢獻率達到91%。其中第1主成分(F1)主要包括SOD和POD，第2主成分(F2)主要包括相對膜透性和可溶性糖，第3主成分(F3)主要包括葉綠素和游離脯氨酸(表2)。

表2 各綜合指標系數(shù)及貢獻率 Table 2 The coefficient and contribution rate of every comprehensive index

采用標準差系數(shù)賦予權(quán)重法對10份垂穗披堿草種質(zhì)進行耐寒性評價(表3)。評分越高，種質(zhì)耐寒性越強。10份材料綜合評價值介于0.12～0.82；根據(jù)植物耐寒能力分級標準，種質(zhì)LQ、ZN和AB綜合評價值>0.7，耐寒性最強；種質(zhì)REG綜合評價值為0.53，耐寒性中等；種質(zhì)LT、GC、XH、ZQ、HZ和MQ綜合評價值<0.5，耐寒性弱。

表3 各綜合指標得分、隸屬函數(shù)值和耐寒性綜合評分 Table 3 Comprehensive index score, subordinate function value and cold resistance comprehensive score of different germplasms

3 討論

3.1 葉片膜透性與垂穗披堿草耐寒性的關(guān)系

葉片膜透性是評價植物耐寒性的重要生理指標。低溫脅迫下，質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和功能受到傷害，導致細胞膜透性增大，電解質(zhì)外滲，電導率增大，該指標能夠客觀反映植物在低溫逆境中的傷害狀況[13]。耐寒性不同的品種，膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性不同，可用低溫脅迫下相對膜透性的增大程度，評價植物耐寒性的強弱[14]。前人研究發(fā)現(xiàn)，耐寒性強的植物受凍害較輕，相對膜透性增加較少，膜傷害程度較輕，后期可恢復正常；耐寒性弱的植物則受害程度重，膜透性顯著增大且難以恢復正常[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下垂穗披堿草葉片相對膜透性逐漸增加。在低溫處理8 h時，各材料葉片相對膜透性增幅較小，受到的冷害較輕。隨低溫脅迫時間的延長，葉片膜透性增至最大，各材料受到明顯冷害。整個低溫脅迫過程中，種質(zhì)REG和AB葉片細胞膜受到嚴重傷害，相對膜透性顯著增加。種質(zhì)LT葉片相對膜透性增加最少，表明其葉片細胞膜受到的傷害較弱，材料XH和HZ在低溫脅迫后期相對膜透性降低，說明夏河和合作地區(qū)種質(zhì)對低溫脅迫耐受性更強。

3.2 葉綠素與垂穗披堿草耐寒性的關(guān)系

葉綠素是植物光合作用中吸收光能的主色素，在植物體內(nèi)處于不斷合成與分解的動態(tài)平衡，其含量受多種因素影響[17]。低溫脅迫下植物葉綠素含量降低，光合酶活性減弱，光合速率降低[18]。植物葉片葉綠素含量增加，有利于光合作用順利進行，增加有機物積累，降低滲透勢，增強細胞保水力，提高植物耐寒性[19]。劉國君等[20]發(fā)現(xiàn)常綠植物葉綠素含量，從10月到次年1月逐步下降，次年1月達最低點，次年1月到3月又大幅度回升。何云等[13]研究發(fā)現(xiàn)，低溫環(huán)境下叢毛羊胡子草(Eriopnrumcomosuny)和金發(fā)草(Pogonatherumpaniceam)葉綠素含量降低，12月的葉綠素含量顯著低于8月，這說明植物的葉綠素含量隨溫度降低而減少，在溫度最低的時間葉綠素含量也最低。本研究中，低溫對種質(zhì)ZN和GC的葉綠素含量影響顯著，但是該材料光合系統(tǒng)修復能力較強，在適應低溫環(huán)境后，葉綠素含量迅速增加。低溫脅迫下，種質(zhì)ZQ和LQ光合系統(tǒng)穩(wěn)定性較強，葉綠素含量在低溫脅迫初期降低，在適應低溫環(huán)境之后，含量穩(wěn)定或有所增加。整體來看，葉綠素含量在低溫下先減少后增加，可能是因為低溫初期，植物葉片通過激素調(diào)節(jié)，部分葉綠素降解，光合速率降低。在植物光合系統(tǒng)逐漸適應低溫后，葉綠素含量有所恢復[21]。綜合評價結(jié)果顯示，葉綠素含量穩(wěn)定的種質(zhì)ZQ耐寒性不強，這說明，耐寒性除了與葉綠素含量有關(guān)外，還與種質(zhì)特性有關(guān)。

3.3 可溶性糖和游離脯氨酸與垂穗披堿草耐寒性的關(guān)系

可溶性糖和游離脯氨酸是植物重要的營養(yǎng)物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[22]?？扇苄蕴呛吭黾幽芴岣呒毎麧B透液濃度，調(diào)節(jié)組織滲透勢，提高保水能力，保護細胞不致遇冷凝固，從而提高植物耐寒性[13,15]。杜永吉等[15]研究發(fā)現(xiàn)，可溶性糖與結(jié)縷草(Zoysiajaponica)耐寒性密切相關(guān)，低溫下結(jié)縷草可溶性糖逐漸增加，耐寒性強的品種可溶性糖含量更高。張尚雄等[8]也發(fā)現(xiàn)，耐寒性強的披堿草可溶性糖含量高，可溶性糖在低溫環(huán)境顯著增加；劉慧民等[23]在地錦屬植物中研究發(fā)現(xiàn)，低溫時可溶性糖增加，并在冬季最冷時期含量最高。本研究中，低溫脅迫下垂穗披堿草可溶性糖含量逐漸增加，但在不同品種和不同處理間存在差異。低溫脅迫下種質(zhì)ZN和LT可溶性糖含量增加最多，但是綜合評價結(jié)果顯示，這兩者不是耐寒性最強的種質(zhì)，這說明植物體內(nèi)的可溶性糖含量高低不僅與低溫耐受程度有關(guān)，還與種質(zhì)本身的特性有關(guān)。

植物葉片游離脯氨酸在低溫環(huán)境下逐漸增加，脯氨酸的積累是植物在低溫環(huán)境中的應激保護，脯氨酸能有效清除自由基，穩(wěn)定植物細胞膜[24-30]。但是，關(guān)于脯氨酸在植物耐寒性中的作用一直存在不同的觀點。如韓發(fā)等[7]在垂穗披堿草中研究發(fā)現(xiàn)，高濃度脯氨酸是植物耐寒的重要原因，但Hekneby等[31]和王世珍等[32]卻提出低溫環(huán)境下植物脯氨酸增加可能與其耐寒性無關(guān)。也有研究認為，植物游離脯氨酸增加程度與植物的抗逆性呈負相關(guān)[14,28]。當前關(guān)于脯氨酸與植物耐寒性相關(guān)研究中，學者們尚未得到絕對一致的結(jié)論，這說明植物脯氨酸與耐寒性的關(guān)系可能因植物而異[24-25]。而在本研究中，低溫脅迫下游離脯氨酸逐漸增加，這與王世珍等[32]在高羊茅(Festucaarundinacea)中研究結(jié)果相似。本試驗還發(fā)現(xiàn)，長時間低溫脅迫下，植物葉片游離脯氨酸顯著增加，這說明垂穗披堿草脯氨酸在低溫環(huán)境下累積效應明顯，脯氨酸可作為垂穗披堿草耐寒評價的重要參考指標。

3.4 超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性與垂穗披堿草耐寒性的關(guān)系

SOD和POD是植物酶促防御系統(tǒng)中的重要保護酶，逆境中維持較高的酶活性，可以消除細胞內(nèi)活性氧對細胞膜的傷害，減少膜質(zhì)過氧化，穩(wěn)定膜透性[14]。SOD主要作用是清除超氧自由基，同時產(chǎn)生歧化產(chǎn)物H2O2。POD具有酶促降解H2O2作用，減輕有害物質(zhì)對細胞的傷害，表現(xiàn)出一定的抗逆性[28]。兩者在低溫脅迫下的變化趨勢相似。本研究中，垂穗披堿草在低溫脅迫下葉片SOD和POD活性增強。這說明SOD和POD作為植物細胞保護酶，酶活性與植物耐寒性有關(guān)[3,12]。前人研究表明[23,30]，在低溫脅迫下，耐寒性強的植物SOD和POD能維持較高的酶活性水平，減少活性氧自由基的積累，減輕膜傷害，增加植物體耐寒性。馬智宏等[33]研究發(fā)現(xiàn)，耐寒性強的草坪草在低溫環(huán)境能保持較高的SOD和POD活性，有利于適應低溫環(huán)境。本研究中，種質(zhì)ZQ和LT的SOD和POD酶活性在低溫脅迫下顯著增加，但是隨脅迫時間的延長，酶活性有所降低，但仍維持較高水平，使得垂穗披堿草能夠耐受較長時間的低溫脅迫。低溫環(huán)境下植物葉片SOD和POD維持較高的酶活性，能夠保持植物細胞中活性氧代謝的動態(tài)平衡，減少氧化自由基累積，減弱膜脂過氧化作用，減輕細胞膜的破壞程度。從這個角度分析，本研究中種質(zhì)ZQ和LT對低溫環(huán)境適應性更強。

3.5 垂穗披堿草耐寒性綜合評價

植物耐寒性是一個受多因素影響的數(shù)量性狀，單一指標難以全面準確反映耐寒性強弱，可結(jié)合多指標綜合評價植物耐寒性[12-13]。隸屬函數(shù)評價法是一種有效的綜合評價法，已在披堿草[8]、早熟禾(Poapratensis)[12]和菌草[34]耐寒性評價中得到應用。本研究應用該方法發(fā)現(xiàn)，垂穗披堿草種質(zhì)ZN、LQ和AB耐寒性最強，REG耐寒性最弱。本研究對高寒地區(qū)種質(zhì)耐寒性評價具有參考價值，得到3種耐寒種質(zhì)對垂穗披堿草育種和耐寒機制研究具有重要意義。