許蕾，陳佩琳，馮光燕，鐘旻依，景婷婷，黃琳凱，張新全

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 四川 成都 611130)

鴨茅(Dactylisglomerata)是禾本科鴨茅屬多年生優(yōu)質(zhì)牧草，種質(zhì)資源豐富，自然界中存在二倍體(2n=14)、四倍體(2n=28)和六倍體(2n=42)3種類型[1]。鴨茅廣泛分布于世界溫帶地區(qū)，截至目前，共包括四倍體及二倍體亞種20余種[2]。同源四倍體鴨茅在野生資源中占比最多，多作為引進(jìn)及栽培使用，雜種優(yōu)勢(shì)較二倍體更明顯；六倍體鴨茅種群數(shù)量較窄，在利比亞與埃及西部有一定的分布[3]；二倍體鴨茅對(duì)鴨茅的起源及進(jìn)化研究有一定的參考價(jià)值[4]。鴨茅為異花授粉植株，野生資源存在天然雜交的現(xiàn)象，利用其天然材料進(jìn)行雜交育種時(shí)存在一定的難度，通過(guò)對(duì)野生型鴨茅材料倍性的鑒定，能夠?yàn)轼喢┻z傳背景研究和種質(zhì)資源利用建立依據(jù)，同時(shí)為遠(yuǎn)緣雜交及多倍體育種提供便利。

鴨茅染色體倍性與遺傳多樣性密切相關(guān)，其遺傳多樣性通過(guò)核型、生物學(xué)形態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)、同工酶等方面共同表現(xiàn)[5-6]。早在1980年Falistocco等[7]發(fā)現(xiàn)位于意大利北、中、南部的18種野生鴨茅染色體數(shù)目為2n=4x=28，都為四倍體。20世紀(jì)以來(lái)，張新全等[8]和周自瑋等[9]分別鑒定了11個(gè)野生鴨茅種質(zhì)材料倍性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二倍體鴨茅‘皇木’、‘越西’、‘康定’、‘泥巴山’和‘茂縣’、‘朗目山’、‘白水臺(tái)’、‘德欽’染色體細(xì)胞數(shù)2n=2x=14，四倍體鴨茅‘廬山’、‘寶興’、‘古藺’染色體細(xì)胞數(shù)2n=4x=28，2007年Amirouche等[10]在阿爾及利比亞北部發(fā)現(xiàn)鴨茅二倍體居群12個(gè)，四倍體居群18個(gè)，由此可見(jiàn)，染色體計(jì)數(shù)法和染色體核型分析可以精確鑒定鴨茅倍性，但其操作耗時(shí)，不適宜大規(guī)模鑒定倍性。而通過(guò)形態(tài)、生理生化及分子水平探究鴨茅倍性時(shí)，其遺傳多樣性會(huì)受海拔、地域隔離、溫度及月降水量的影響[11]。因此亟需找到一種快速有效檢測(cè)鴨茅倍性的方法。

近年來(lái)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)、分類學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞周期分析及植物基因組大小估算等研究中[12]。利用光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)高速流動(dòng)的單細(xì)胞懸浮液進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量和信號(hào)處理得到的DNA含量分布曲線，可以直接觀測(cè)植物倍性[13]。國(guó)內(nèi)使用流式細(xì)胞術(shù)鑒定牧草細(xì)胞倍性的應(yīng)用也愈加廣泛，紫花苜蓿(Medicagosativa)、黑麥草(Loliumperenne)、蒙古冰草(Agropyronmongolicum)等已能夠篩選出適宜的細(xì)胞核懸液和細(xì)胞核提取方法，通過(guò)選擇一種參照材料作為外標(biāo)，確定其熒光峰值范圍，可以快速有效地確定植株倍性[14-16]。此外，內(nèi)標(biāo)法在植物倍性及細(xì)胞DNA含量檢測(cè)中也較為常用，此過(guò)程將參照樣與供試樣混合后，通過(guò)DNA含量分布圖得到的分析結(jié)果直觀準(zhǔn)確。本研究以外標(biāo)法為主，內(nèi)標(biāo)法為輔，建立利用流式細(xì)胞儀鑒定鴨茅倍性的技術(shù)體系，并鑒定46份鴨茅種質(zhì)資源的倍性，以期為鴨茅倍性育種工作提供基本信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1植物材料 鴨茅2006-1采自重慶巫溪，鴨茅90-103采自四川越西，均為野生種質(zhì)材料。鴨茅供試樣品共46個(gè)，由美國(guó)農(nóng)業(yè)部植物種質(zhì)資源庫(kù)提供，種子來(lái)源于歐洲溫帶、西亞及北非等區(qū)域[17]。所有材料于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)草學(xué)基地(N 30°42′, E 103°51′)及雅安校區(qū)草學(xué)基地中(N 38°8′, E 103°14′)種植。試驗(yàn)于2017年3月開始。

1.1.2細(xì)胞解離液及染色液 OttoⅠ溶液：0.1 mol·L-1檸檬酸，0.5% (v/v) Tween 20，用0.22 mm無(wú)菌注射器過(guò)濾并儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中。OttoⅡ溶液：0.4 mol·L-1Na2HPO4·12H2O，用 0.22 mm無(wú)菌注射器過(guò)濾并避光常溫(18～25 ℃)保存。OttoⅠ溶液與OttoⅡ溶液共同組成Otto解離液[18]。

LB01溶液[19]：15 mmol·L-1Tris，2 mmol·L-1Na2EDTA，0.5 mmol·L-1spermine·4HCl，80 mmol·L-1KCl，20 mmol·L-1NaCl，0.1 % (v/v) TritonX-100，用0.22 mm無(wú)菌注射器過(guò)濾并且儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱中。

Tris.MgCl2溶液[20]：200 mmol·L-1Tris，4 mmol·L-1MgCl2·6H2O，0.5 % (v/v)Triton X-100，配好后用0.22 mm無(wú)菌注射器過(guò)濾，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中。

Hepes溶液[21]：10 mmol·L-1MgSO4·7H2O，50 mmol·L-1KCl，5 mmol·L-14-羥乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES]，0.3 mmol·L-1二硫蘇糖醇(1,4 dithiothreitol，DTT)，0.25% (v/v) TritonX-100，配好后用用0.22 mm無(wú)菌注射器過(guò)濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。

PI 原液：配置1 mg·mL-1的原液后，過(guò)濾分裝，錫紙包裹保存在-20 ℃冰箱。

RNase原液：配置1 mg·mL-1的 RNase的原液后，90 ℃熱激15 min，用 0.22 mm無(wú)菌注射器過(guò)濾后分裝，錫紙包裹保存在-20 ℃冰箱，使用時(shí)解凍并保存于4 ℃冰箱中。

1.1.3儀器 本試驗(yàn)使用OLYMPUS CX41生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司生產(chǎn))。流式細(xì)胞儀型號(hào)為Beckman Cyto FLEX(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司生產(chǎn))。

1.2 根尖壓片鑒定

試驗(yàn)首先取鴨茅種子于光照培養(yǎng)箱中發(fā)芽，材料出芽后轉(zhuǎn)至穴盤培養(yǎng)，待長(zhǎng)至3～5 cm時(shí)移入大棚花盆中培養(yǎng)，選取分蘗較多、長(zhǎng)勢(shì)較好的單株材料置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)水培，剪下0.5～1.0 cm長(zhǎng)的根尖部位置于EP管中，加水4 ℃冰箱儲(chǔ)存(冰水浴)24 h后，轉(zhuǎn)至卡諾氏固定液(無(wú)水乙醇：冰醋酸=3:1)中固定24 h，根尖固定后，用95%乙醇沖洗干凈，再轉(zhuǎn)入70%乙醇中儲(chǔ)存。將固定好的根尖取出，沖洗干凈后放入5 mol·L-1鹽酸中處理5～10 min(或1 mol·L-1鹽酸中60 ℃處理10～15 min)，當(dāng)根尖呈現(xiàn)透明時(shí)取出，蒸餾水沖洗后，置于載玻片上并切取2 mm左右根尖生長(zhǎng)點(diǎn)，蓋上蓋玻片輕輕按壓敲打，在酒精燈上迅速燒片，然后用改良苯酚品紅溶液染色5 min，壓片完成后在OLYMPUS CX41生物顯微鏡下鏡檢，選取根尖有絲分裂中期染色體拍照。

1.3 花粉母細(xì)胞壓片鑒定

取孕穗期鴨茅小穗，置于卡諾氏固定液24 h，用95%乙醇洗凈后轉(zhuǎn)入70%乙醇中，于4 ℃冰箱儲(chǔ)存[22]。從固定好的小穗上取下小花，使用鑷子及解剖針剝離下雄蕊置于載玻片上，用改良苯酚品紅溶液染色5 min，輕輕用解剖針切至花粉母細(xì)胞離出，蓋上蓋破片輕按后酒精迅速燒片，鏡檢觀察減數(shù)分裂中期染色體配對(duì)情況。

1.4 鴨茅細(xì)胞核懸液制備

本試驗(yàn)選用Otto、LB01、Tris.MgCl2、Hepes解離液進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，目的是篩選出適合鴨茅細(xì)胞核分離的最佳解離液，從而得到鴨茅細(xì)胞核。具體操作為：先將干凈培養(yǎng)皿傾斜置于冰盒上，取供試樣品幼嫩葉片約20 mg，蒸餾水沖洗表面后用濾紙吸干水分，加入1 mL預(yù)冷的解離液并沒(méi)過(guò)材料，用鋒利的刀片將葉片切碎，吸打混合后，吸取上清，通過(guò)300～400目(0.04～0.05 mm)尼龍網(wǎng)將液體移入1.5 mL EP管中，1100 r·min-1離心5 min，收集細(xì)胞核，棄上清至細(xì)胞核上方有100 mL左右液體，輕輕搖動(dòng)重懸浮細(xì)胞核，再加入相同的解離液重懸即可。然后加入PI原液50 μg·mL-1，RNase原液50 μg·mL-1，4 ℃黑暗條件染色20～40 min，振蕩器搖晃后繼續(xù)用300～400目(0.04～0.05 mm)尼龍網(wǎng)過(guò)濾，置于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

對(duì)于Otto核懸液的制備，本試驗(yàn)參照Dolezel等[18]的兩步法進(jìn)行細(xì)胞核懸浮液的制備和染色。需要先加入1 mL預(yù)冷的OttoⅠ解離核細(xì)胞，離心后用100 μL冰凍的OttoⅠ溶液重懸，再加入OttoⅡ溶液1 mL。

1.5 雞血紅細(xì)胞提取

試驗(yàn)利用家雞雞血紅細(xì)胞作為參照估測(cè)鴨茅細(xì)胞核DNA含量大小。家雞雞血細(xì)胞提取步驟為：10 μL雞血加入1 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)稀釋，再加入1 mL濃度為0.2%的曲拉通，4 ℃放置10 min后取出，1000 r·min-1離心5 min，去上清，4 ℃條件下加PI染色30 min，PBS重懸，1000 r·min-1再次離心5 min，去上清后用PBS重懸即可。使用同一種參照材料檢測(cè)細(xì)胞核DNA含量大小時(shí)，注意控制儀器電壓保持不變。

1.6 外標(biāo)法測(cè)定鴨茅倍性

流式細(xì)胞儀外標(biāo)法測(cè)定倍性時(shí)，需要先檢測(cè)一個(gè)獨(dú)立的參照樣品再進(jìn)行供試樣品檢測(cè)，每個(gè)待測(cè)樣品設(shè)置3次重復(fù)，每次收集細(xì)胞數(shù)不少于10000個(gè)，檢測(cè)后通過(guò)公式換算出供試樣品的倍性及DNA含量。本試驗(yàn)首先選取雞血紅細(xì)胞[1.25 pg(1222.5 Mb)[23]]為外標(biāo)參照物，上機(jī)檢測(cè)后使用MoFit軟件進(jìn)行繪圖與結(jié)果分析，利用樣品G1期熒光強(qiáng)度均值計(jì)算鴨茅2006-1的DNA含量。

同時(shí)選取二倍體材料2006-1作為外標(biāo)參照物，利用流式細(xì)胞儀光電倍增管接受鴨茅細(xì)胞核懸液的熒光信號(hào)與散射光信號(hào)，將其轉(zhuǎn)化為電信號(hào)后傳入計(jì)算機(jī)中，通過(guò)CytExpert軟件創(chuàng)建圖形和門控，調(diào)整閾值，在儀器采樣后最終得到鴨茅葉片熒光直方圖(峰圖)，其橫坐標(biāo)表示樣品G1峰的熒光位置，即2C熒光通道范圍，縱坐標(biāo)表示樣品細(xì)胞核數(shù)目。保持流式細(xì)胞儀參數(shù)不變，以2006-1的G1峰熒光均值為參照標(biāo)準(zhǔn)確定供試樣品倍性水平。其倍性及DNA含量計(jì)算公式如下：

供試樣品倍性水平或供試樣細(xì)胞核DNA含量=(參照樣品倍性水平或參照樣細(xì)胞核DNA含量×供試樣品G1峰熒光均值)/對(duì)照樣品G1峰熒光均值

1.7 內(nèi)標(biāo)法測(cè)定鴨茅倍性

與外標(biāo)法不同的是，流式細(xì)胞儀內(nèi)標(biāo)法測(cè)定鴨茅倍性時(shí)，需要將已知倍性的參照樣品2006-1和供試樣品等量混合，然后通過(guò)檢測(cè)確定主峰熒光通道范圍，得出供試樣品的倍性水平，每個(gè)待測(cè)樣品設(shè)置3次重復(fù)，每次收集細(xì)胞數(shù)不少于10000個(gè)。值得注意的是，若參照植物和供試樣品的峰完全重疊表明兩者倍性相同。若出現(xiàn)內(nèi)標(biāo)參照樣品和供試樣品兩個(gè)獨(dú)立的峰，則表明供試樣倍性可能與參照樣存在差異，我們選取其中的主峰為依據(jù)分析倍性即可。

1.8 細(xì)胞核DNA含量變異分析

樣品G1期峰熒光均值與細(xì)胞核DNA含量線性相關(guān)，其變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)值能夠有效表現(xiàn)流式細(xì)胞儀檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確程度。試驗(yàn)經(jīng)Cyto FLEX流式細(xì)胞儀檢測(cè)得到每個(gè)樣品的直方圖及散點(diǎn)圖后，以FSC格式導(dǎo)出，打開ModFit軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，除能得到樣品峰熒光均值外，還能得到G1期的變異系數(shù)CV。CV值越小，數(shù)值越穩(wěn)定，代表樣品檢測(cè)變異程度越小[24]。

2 結(jié)果與分析

圖1 壓片法測(cè)定鴨茅細(xì)胞倍性Fig.1 Ploidy analysis with chromosome compression A: 2006-1花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I染色體, 示7II; B: 90-103根尖染色體, 2n=14. A: Mitosis of PMC in 2006-1, showing 7II in metaphase Ⅰ; B: Mitosis of root tip squashing in 90-103, showing 2n=14.

2.1 鴨茅倍性的細(xì)胞學(xué)鑒定

鴨茅花藥壓片后，通過(guò)顯微鏡觀察2006-1花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期染色體數(shù)目發(fā)現(xiàn)，鴨茅14條染色體配對(duì)形成7對(duì)，染色體形態(tài)為棒形、環(huán)形(圖1A)，這與之前本課題組鴨茅花粉母細(xì)胞染色體形態(tài)一致[25]。

同時(shí)我們也采用90-103鴨茅作為參照進(jìn)一步驗(yàn)證了二倍體鴨茅染色體數(shù)目，鴨茅根尖壓片后，通過(guò)顯微鏡觀察其細(xì)胞有絲分裂中期染色體數(shù)目2n=2x=14(圖1B)。

2.2 解離液選擇影響細(xì)胞核提取效果

在控制處理一致的條件下，分別使用Otto、LB01、Tris.MgCl2、Hepes解離鴨茅葉片，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，由流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果得出，Tris.MgCl2、Hepes處理下的鴨茅葉片都無(wú)法產(chǎn)生完整的樣品峰，葉片細(xì)胞核DNA含量很少，碎片峰面積高于樣品峰面積(圖2b，c)。而運(yùn)用Otto、LB01解離都能夠得到完整的樣本峰，根據(jù)本試驗(yàn)細(xì)胞核提取條件得出，Otto解離出的樣本峰優(yōu)于LB01，其峰更為集中，重復(fù)性好(圖4a和圖2a)。同時(shí)，使用ModFit軟件測(cè)定不同解離液條件下G1期CV值發(fā)現(xiàn)，使用Otto提取鴨茅細(xì)胞核時(shí)CV值為3.84%～5.08%，使用LB01時(shí)CV值為9.68%～15.82%，其余解離液檢測(cè)的CV值都大于10%或CV值無(wú)法計(jì)算得出，這表明利用Otto解離液提取細(xì)胞核結(jié)果最為準(zhǔn)確，可得明顯主峰。

圖2 不同解離液對(duì)鴨茅2006-1出峰效果影響Fig.2 Effect of different lysis buffer on 2006-1 peak values a: LB01; b: Tris.MgCl2; c: Hepe

2.3 利用外標(biāo)法分析鴨茅倍性

試驗(yàn)以雞血紅細(xì)胞為參照樣品，分別進(jìn)行雞血紅細(xì)胞和鴨茅2006-1細(xì)胞核DNA含量與熒光強(qiáng)度的檢測(cè)，分析得到鴨茅2006-1的DNA含量為2275.79 Mb(圖3)。以二倍體鴨茅2006-1為參照樣品，分別進(jìn)行樣品倍性的檢測(cè)，使用參照材料對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)后，再依次對(duì)其他鴨茅供試材料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PI237609、PI295271為二倍體，寶興、PI538922、PI310393為四倍體(圖4)。

圖3 以雞血為外標(biāo)檢測(cè)鴨茅DNA含量Fig.3 Detection of DNA content with chicken blood as external standard a: 雞血紅細(xì)胞 Red blood cells of chicken blood; b: 2006-1-1; c: 2006-1-2; d: 2006-1-3; e: 2006-1-4. mean: 熒光均值； CV： 變異系數(shù)The coefficient of variation.

圖4 流式細(xì)胞儀外標(biāo)法測(cè)定細(xì)胞倍性Fig.4 Ploidy analysis with external standard a: 2006-1; b: PI237609; c: PI295271; d: 寶興 Baoxing; e: PI538922; f: PI310393.

2.4 利用內(nèi)標(biāo)法分析鴨茅倍性

與外標(biāo)法相比，內(nèi)標(biāo)法每次處理供試樣品時(shí)，需要加入等量的2006-1葉片一同切碎。結(jié)果發(fā)現(xiàn)若圖形內(nèi)只存在單峰且其熒光均值在2006-1熒光值范圍內(nèi)，峰值高、峰面積大，此時(shí)只存在核DNA含量為2C的細(xì)胞，鑒定供試樣品為二倍體；若圖內(nèi)出現(xiàn)雙峰，由于混入?yún)⒄諛悠?006-1為二倍體，除存在核DNA含量為2C的細(xì)胞，同時(shí)還有核DNA含量為4C的細(xì)胞，其熒光值為二倍體的2倍，鑒定供試樣品為四倍體。由此，得出寶興為四倍體，PI237609、PI295271、PI224599、PI230116、PI265568為二倍體(圖5)。

圖5 流式細(xì)胞儀內(nèi)標(biāo)法測(cè)定細(xì)胞倍性Fig.5 Ploidy analysis with internal standard a: 寶興 Baoxing; b: PI237609; c: PI295271; d: PI224599; e: PI230116; f: PI265568

2.5 內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法的比較分析

試驗(yàn)表明，以鴨茅2006-1作為內(nèi)標(biāo)參照物，通過(guò)ModFit軟件分析得出，5個(gè)二倍體材料的熒光均值為(56.45±6.96)，變異系數(shù)(CV值)于5%上下波動(dòng)，此時(shí)測(cè)得的熒光均值(mean值)更穩(wěn)定，檢測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性更高(表1)。外標(biāo)法檢測(cè)對(duì)儀器電壓及人為操作有一定的要求，一般情況下可以得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果，有時(shí)檢測(cè)結(jié)果會(huì)優(yōu)于選擇內(nèi)標(biāo)參照物的檢測(cè)(圖6b，e)，但其存在的偶然誤差會(huì)影響出峰橫坐標(biāo)大小，即引起熒光通量范圍的改變。偶然誤差影響較大時(shí)，儀器將無(wú)法測(cè)出完整樣品峰，只能顯示碎片峰，出現(xiàn)CV值數(shù)值偏大和檢測(cè)不出的情況，因此無(wú)法準(zhǔn)確判斷材料倍性(圖6f )，此時(shí)使用重復(fù)試驗(yàn)或者內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)，可以重新獲得檢測(cè)者所需的結(jié)果，但當(dāng)材料珍貴缺少時(shí)，選擇內(nèi)標(biāo)法更為直觀和準(zhǔn)確，且檢測(cè)結(jié)果不易受其他組峰的干擾。

當(dāng)供試樣品與參照樣品倍性產(chǎn)生明顯差異時(shí)，外標(biāo)法檢測(cè)可以直觀體現(xiàn)材料倍性。本試驗(yàn)在檢測(cè)寶興倍性時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用外標(biāo)2006-1為參照時(shí)，只存在單峰，此時(shí)檢測(cè)寶興的mean值為136.44，為二倍體2006-1的2倍，CV值為6.43%；當(dāng)使用2006-1為內(nèi)標(biāo)參照物時(shí)，寶興峰面積占全部峰面積的24.03%，其mean值為126.44，CV值為5.37%，由此可見(jiàn)，雖然內(nèi)標(biāo)法CV值更小，檢測(cè)更為精確，但外標(biāo)法對(duì)于倍性的直觀檢測(cè)具有一定優(yōu)勢(shì)。因此，本試驗(yàn)在使用外標(biāo)法鑒定46種材料倍性后，綜合數(shù)據(jù)針對(duì)其中21種材料繼續(xù)進(jìn)行內(nèi)標(biāo)分析，共鑒定出二倍體材料22份，四倍體材料24份(表2)。

表1 鴨茅二倍體內(nèi)外標(biāo)熒光均值和變異系數(shù)比較 Table 1 Comparison of external and internal standard on diploid materials with mean and CV

圖6 利用ModFit的內(nèi)外標(biāo)比較Fig.6 Comparison of external and internal standard with ModFit graph 內(nèi)標(biāo) Internal standard: a: 寶興 Baoxing; b: PI295271; c: PI231517; 外標(biāo) External standard: d: 寶興 Baoxing; e: PI295271; f: PI231517.

序號(hào)No.種質(zhì)編號(hào)Accession No.亞種D. glomeratasubsp.倍性Ploidy level 原產(chǎn)地Seed source序號(hào)No.種質(zhì)編號(hào)Accession No.亞種D. glomeratasubsp.倍性Ploidy level原產(chǎn)地Seed source1AKZ-NrGR667aschersoniana2x波蘭Polen24PI306730hispanica4x德國(guó)Greece2AKZ-NrGR668aschersoniana2x波蘭Polen25PI310393woronowii4x蘇聯(lián)Soviet Union3PI170344hispanica2x土耳其Turkey26PI346967marina4x葡萄牙Portugal4PI224599hispanica2x以色列Israel27PI346968marina4x葡萄牙Portugal5PI229472marina4x阿爾及利亞Algeria28PI346969marina4x葡萄牙Portugal6PI230116hispanica2x伊朗Iran29PI368880santai2x阿爾及利亞Algeria7PI231517hispanica2x摩洛哥Morocco30PI372621lobata4x德國(guó)Germany8PI237601juncinella2x西班牙Spain31PI418678juncinella4x西班牙Spain9PI237602lusitanica2x葡萄牙Portugal32PI441032smithii4x英國(guó)United Kingdom10PI237603lusitanica2x葡萄牙Portugal33PI441034smithii4x英國(guó)United Kingdom11PI237604marina4x葡萄牙Portugal34PI477989marina4x法國(guó)France12PI237605santai4x阿爾及利亞Algeria35PI499583glomerata2x中國(guó)China13PI237607smithii2x西班牙Spain36PI535737hispanica2x利比亞Libya14PI237609ibizensis2x西班牙Spain37PI538891glomerata2x俄羅斯Russian Federation15PI237610woronowii4x伊朗Iran38PI538920glomerata4x俄羅斯Russian Federation16PI251815glomerata4x意大利Italy39PI538921lobata4x俄羅斯Russian Federation17PI253572hispanica4x葡萄牙Portugal40PI538922woronowii4x俄羅斯Russian Federation18PI265567hispanica4x法國(guó)France41PI577065marina4x葡萄牙Portugal19PI265568hispanica2x西班牙Spain42PI577066marina4x葡萄牙Portugal20PI283241lobata2x德國(guó)Germany43PI634265lusitanica2x西班牙Spain21PI283242lobata4x德國(guó)Germany44ABY-BC-4800-1980Ujudaica2x黎巴嫩Lebanon22PI283243woronowii4x蘇聯(lián)Soviet Union45ABY-BC-5368-1970Uparthiana2x伊朗Iran23PI295271himalayensis2x印度India46w41628glomerata2x俄羅斯Russian Federation

3 討論

通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定植株倍性，是早期研究者最常使用的方法。1994年Loticato等發(fā)現(xiàn)二倍體與四倍體鴨茅葉片長(zhǎng)度及株叢大小存在差異，在開花期形態(tài)差異最顯著，此時(shí)四倍體植株較二倍體植株更低矮，花序更直立，但僅通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察不能精準(zhǔn)判斷鴨茅倍性，種質(zhì)隔離及環(huán)境因素等作用，都有可能使雜交后代出現(xiàn)雜合，甚至是變異的情況。而在幼苗期，不同倍性材料形態(tài)學(xué)差異更不顯著，利用流式能在幼苗期鑒定植株倍性，將為高效準(zhǔn)確篩選雜交育種材料提供便利。染色體計(jì)數(shù)和細(xì)胞學(xué)觀察，是分析植物倍性最直接有效的方式，但其工作量較大，根尖的獲取，細(xì)胞分裂時(shí)期的控制等多種因素影響其觀察的效果。相比較而言，利用花粉壓片要比根尖壓片更為準(zhǔn)確，但鴨茅花粉育性與結(jié)實(shí)率都不高，花粉數(shù)目差異較大[27]，二倍體鴨茅花粉數(shù)量更少，操作更具難度。本試驗(yàn)結(jié)合了前人對(duì)鴨茅的核型分析，主要采用染色體計(jì)數(shù)的方法鑒定鴨茅2006-1的倍性，然后在此基礎(chǔ)上進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，能夠同時(shí)檢測(cè)多種鴨茅材料的倍性，此方法取材時(shí)間集中，取樣量少，細(xì)胞易提取，檢測(cè)速度快。

內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)檢測(cè)是流式細(xì)胞儀用來(lái)確定植物DNA含量和植物倍性的常用方法，相比較而言，內(nèi)標(biāo)法可以通過(guò)等量混合參照樣品和供試樣品獲取樣品峰差異，其鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，受儀器電壓及人為操作影響變異較小，檢測(cè)相同物種材料時(shí)，若出現(xiàn)參照主峰與供試樣主峰重疊且只有唯一峰時(shí)，說(shuō)明兩者倍性相同，若出現(xiàn)雙峰且兩峰DNA含量接近時(shí)，則為不同倍性材料，只有當(dāng)兩者DNA含量相近且無(wú)法區(qū)分差異時(shí)，倍性鑒定就會(huì)存在困難。外標(biāo)法較內(nèi)標(biāo)法操作簡(jiǎn)單，對(duì)于同一物種相同條件下倍性的大量檢測(cè)具有優(yōu)勢(shì)，一般情況CV值保持在5%左右，但同時(shí)，外標(biāo)法也要嚴(yán)格控制儀器條件與材料處理?xiàng)l件一致，減少人為操作產(chǎn)生的誤差，對(duì)于檢測(cè)效果較差，CV值過(guò)大的情況，可以多次重復(fù)排除人為與儀器產(chǎn)生的誤差。同時(shí)，內(nèi)外標(biāo)參照物的選擇，一定程度會(huì)影響檢測(cè)樣品DNA含量。有研究表明參照樣本選擇同屬及近緣種材料，DNA含量相近，測(cè)試的差異性較小，更有易于準(zhǔn)確表達(dá)待測(cè)樣品的倍性[28]。但又有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，即使是植物細(xì)胞，某些條件下也可以選用動(dòng)物細(xì)胞作為參照，例如使用人類口腔上皮細(xì)胞做參照[29]，可用于測(cè)定棉花(Gossypiumspp.)胚珠內(nèi)DNA含量；用雞血紅細(xì)胞做植物的參照檢測(cè)倍性，于蘋果(Malusdomestica)[30]、桃屬(Amygdalus)、李屬(Prunus)[31]及獼猴桃(Actinidiaspp.)[32]中都有較好效果，這可能是由于選用的動(dòng)物細(xì)胞核DNA與供試樣品核DNA含量差異較小導(dǎo)致的。此外，試驗(yàn)也估測(cè)了鴨茅2006-1的細(xì)胞核DNA含量，起初選用大麥(Hordeumvulgare)為參照，估測(cè)得到的結(jié)果差異較大，此差異的產(chǎn)生可能與大麥基因組較大有關(guān)(5.1 Gb[33])，故后續(xù)選取雞血為參照，可較為精確地估測(cè)2006-1的倍性，在此基礎(chǔ)上，以2006-1為參照檢測(cè)其他鴨茅材料倍性也更為準(zhǔn)確。

流式細(xì)胞儀分析植物細(xì)胞倍性時(shí)的關(guān)鍵一步就是解離液的選擇，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，使用Tris.MgCl2、Hepes處理鴨茅葉片時(shí)無(wú)法產(chǎn)生樣品峰，而在既含酸又含Na鹽的Otto、LB01解離液中能夠測(cè)得較高的核DNA含量，雖然Dpoole?el等[34]和柳青慕等[35]使用LB01解離液可以得到較好的提取效果，但其中的添加物β-巰基乙醇毒性較大，本試驗(yàn)嘗試使用去除β-巰基乙醇的LB01解離液提取鴨茅細(xì)胞核DNA發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)樣能夠產(chǎn)生明顯的峰，但碎片峰所占面積較大，嚴(yán)重干擾鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性，因此最終選用Otto提取鴨茅細(xì)胞核，其出峰效果好，對(duì)于細(xì)胞核較少的樣品也能得到完整的峰。DTT等物質(zhì)有利于消除葉片中的酚類粘連物質(zhì)，但對(duì)于鴨茅細(xì)胞核的提取有抑制作用。關(guān)于探究離心時(shí)間、離心次數(shù)、PI含量、染色時(shí)間及過(guò)濾次數(shù)等多種因素對(duì)流式結(jié)果的影響，我們對(duì)比細(xì)胞核解離3 min與解離5 min，離心5 min與離心10 min，離心1次與離心2次得出，解離時(shí)間和離心時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)增加碎片峰產(chǎn)生的概率，解離次數(shù)的增加雖然會(huì)改變檢測(cè)準(zhǔn)確度，但在控制解離時(shí)間的前提下，檢測(cè)樣品出峰效果并沒(méi)有較大的差異。上機(jī)前的再過(guò)濾更有利于出峰，防止堵塞儀器。此外，成熟葉片較幼嫩時(shí)期的葉片更易產(chǎn)生雜峰，為防止主峰分析受到干擾，盡量選擇幼嫩葉片檢測(cè)，或者使用F1代種子培養(yǎng)的植株葉片來(lái)檢測(cè)。

4 結(jié)論

本研究采用流式細(xì)胞術(shù)，以鴨茅二倍體材料2006-1為參照，篩選常用的4種細(xì)胞核DNA解離液，通過(guò)外標(biāo)法為主，內(nèi)標(biāo)法為輔的檢測(cè)方法，建立一套能夠高效穩(wěn)定檢測(cè)鴨茅倍性的流式檢測(cè)技術(shù)。通過(guò)此技術(shù)成功鑒定出46種鴨茅種質(zhì)材料倍性。通過(guò)DNA含量分布圖和ModFit數(shù)據(jù)分析得出，相對(duì)于LB01、Tris.MgCl2和Hepes，Otto是最適合鴨茅葉片的解離液，產(chǎn)生的樣品峰清晰集中，檢測(cè)數(shù)據(jù)變異小，準(zhǔn)確性好。在檢測(cè)方法的選擇上，內(nèi)外標(biāo)法各有優(yōu)劣勢(shì)，對(duì)比5種二倍體和1種四倍體材料發(fā)現(xiàn)，內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)相同倍性材料的熒光均值較穩(wěn)定，且針對(duì)單個(gè)樣品的檢測(cè)準(zhǔn)確性較高；外標(biāo)法檢測(cè)可能存在偶然誤差，表現(xiàn)為不能正常出峰或CV值過(guò)大，但外標(biāo)法操作便捷，數(shù)據(jù)直觀性很好，適于大量檢測(cè)。