許蕾，陳佩琳，馮光燕，鐘旻依，景婷婷，黃琳凱，張新全

(四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院， 四川 成都 611130)

鴨茅(Dactylisglomerata)是禾本科鴨茅屬多年生優(yōu)質(zhì)牧草，種質(zhì)資源豐富，自然界中存在二倍體(2n=14)、四倍體(2n=28)和六倍體(2n=42)3種類型[1]。鴨茅廣泛分布于世界溫帶地區(qū)，截至目前，共包括四倍體及二倍體亞種20余種[2]。同源四倍體鴨茅在野生資源中占比最多，多作為引進及栽培使用，雜種優(yōu)勢較二倍體更明顯；六倍體鴨茅種群數(shù)量較窄，在利比亞與埃及西部有一定的分布[3]；二倍體鴨茅對鴨茅的起源及進化研究有一定的參考價值[4]。鴨茅為異花授粉植株，野生資源存在天然雜交的現(xiàn)象，利用其天然材料進行雜交育種時存在一定的難度，通過對野生型鴨茅材料倍性的鑒定，能夠為鴨茅遺傳背景研究和種質(zhì)資源利用建立依據(jù)，同時為遠緣雜交及多倍體育種提供便利。

鴨茅染色體倍性與遺傳多樣性密切相關(guān)，其遺傳多樣性通過核型、生物學形態(tài)、生長發(fā)育指標、同工酶等方面共同表現(xiàn)[5-6]。早在1980年Falistocco等[7]發(fā)現(xiàn)位于意大利北、中、南部的18種野生鴨茅染色體數(shù)目為2n=4x=28，都為四倍體。20世紀以來，張新全等[8]和周自瑋等[9]分別鑒定了11個野生鴨茅種質(zhì)材料倍性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二倍體鴨茅‘皇木’、‘越西’、‘康定’、‘泥巴山’和‘茂縣’、‘朗目山’、‘白水臺’、‘德欽’染色體細胞數(shù)2n=2x=14，四倍體鴨茅‘廬山’、‘寶興’、‘古藺’染色體細胞數(shù)2n=4x=28，2007年Amirouche等[10]在阿爾及利比亞北部發(fā)現(xiàn)鴨茅二倍體居群12個，四倍體居群18個，由此可見，染色體計數(shù)法和染色體核型分析可以精確鑒定鴨茅倍性，但其操作耗時，不適宜大規(guī)模鑒定倍性。而通過形態(tài)、生理生化及分子水平探究鴨茅倍性時，其遺傳多樣性會受海拔、地域隔離、溫度及月降水量的影響[11]。因此亟需找到一種快速有效檢測鴨茅倍性的方法。

近年來，流式細胞儀檢測已廣泛應用于細胞學、分類學、遺傳學、免疫學、發(fā)育生物學、細胞周期分析及植物基因組大小估算等研究中[12]。利用光學檢測系統(tǒng)對高速流動的單細胞懸浮液進行多參數(shù)測量和信號處理得到的DNA含量分布曲線，可以直接觀測植物倍性[13]。國內(nèi)使用流式細胞術(shù)鑒定牧草細胞倍性的應用也愈加廣泛，紫花苜蓿(Medicagosativa)、黑麥草(Loliumperenne)、蒙古冰草(Agropyronmongolicum)等已能夠篩選出適宜的細胞核懸液和細胞核提取方法，通過選擇一種參照材料作為外標，確定其熒光峰值范圍，可以快速有效地確定植株倍性[14-16]。此外，內(nèi)標法在植物倍性及細胞DNA含量檢測中也較為常用，此過程將參照樣與供試樣混合后，通過DNA含量分布圖得到的分析結(jié)果直觀準確。本研究以外標法為主，內(nèi)標法為輔，建立利用流式細胞儀鑒定鴨茅倍性的技術(shù)體系，并鑒定46份鴨茅種質(zhì)資源的倍性，以期為鴨茅倍性育種工作提供基本信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1植物材料 鴨茅2006-1采自重慶巫溪，鴨茅90-103采自四川越西，均為野生種質(zhì)材料。鴨茅供試樣品共46個，由美國農(nóng)業(yè)部植物種質(zhì)資源庫提供，種子來源于歐洲溫帶、西亞及北非等區(qū)域[17]。所有材料于四川農(nóng)業(yè)大學成都校區(qū)草學基地(N 30°42′, E 103°51′)及雅安校區(qū)草學基地中(N 38°8′, E 103°14′)種植。試驗于2017年3月開始。

1.1.2細胞解離液及染色液 OttoⅠ溶液：0.1 mol·L-1檸檬酸，0.5% (v/v) Tween 20，用0.22 mm無菌注射器過濾并儲存于4 ℃冰箱中。OttoⅡ溶液：0.4 mol·L-1Na2HPO4·12H2O，用 0.22 mm無菌注射器過濾并避光常溫(18～25 ℃)保存。OttoⅠ溶液與OttoⅡ溶液共同組成Otto解離液[18]。

LB01溶液[19]：15 mmol·L-1Tris，2 mmol·L-1Na2EDTA，0.5 mmol·L-1spermine·4HCl，80 mmol·L-1KCl，20 mmol·L-1NaCl，0.1 % (v/v) TritonX-100，用0.22 mm無菌注射器過濾并且儲存在-20 ℃冰箱中。

Tris.MgCl2溶液[20]：200 mmol·L-1Tris，4 mmol·L-1MgCl2·6H2O，0.5 % (v/v)Triton X-100，配好后用0.22 mm無菌注射器過濾，儲存于4 ℃冰箱中。

Hepes溶液[21]：10 mmol·L-1MgSO4·7H2O，50 mmol·L-1KCl，5 mmol·L-14-羥乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES]，0.3 mmol·L-1二硫蘇糖醇(1,4 dithiothreitol，DTT)，0.25% (v/v) TritonX-100，配好后用用0.22 mm無菌注射器過濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。

PI 原液：配置1 mg·mL-1的原液后，過濾分裝，錫紙包裹保存在-20 ℃冰箱。

RNase原液：配置1 mg·mL-1的 RNase的原液后，90 ℃熱激15 min，用 0.22 mm無菌注射器過濾后分裝，錫紙包裹保存在-20 ℃冰箱，使用時解凍并保存于4 ℃冰箱中。

1.1.3儀器 本試驗使用OLYMPUS CX41生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司生產(chǎn))。流式細胞儀型號為Beckman Cyto FLEX(美國貝克曼庫爾特有限公司生產(chǎn))。

1.2 根尖壓片鑒定

試驗首先取鴨茅種子于光照培養(yǎng)箱中發(fā)芽，材料出芽后轉(zhuǎn)至穴盤培養(yǎng)，待長至3～5 cm時移入大棚花盆中培養(yǎng)，選取分蘗較多、長勢較好的單株材料置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)水培，剪下0.5～1.0 cm長的根尖部位置于EP管中，加水4 ℃冰箱儲存(冰水浴)24 h后，轉(zhuǎn)至卡諾氏固定液(無水乙醇：冰醋酸=3:1)中固定24 h，根尖固定后，用95%乙醇沖洗干凈，再轉(zhuǎn)入70%乙醇中儲存。將固定好的根尖取出，沖洗干凈后放入5 mol·L-1鹽酸中處理5～10 min(或1 mol·L-1鹽酸中60 ℃處理10～15 min)，當根尖呈現(xiàn)透明時取出，蒸餾水沖洗后，置于載玻片上并切取2 mm左右根尖生長點，蓋上蓋玻片輕輕按壓敲打，在酒精燈上迅速燒片，然后用改良苯酚品紅溶液染色5 min，壓片完成后在OLYMPUS CX41生物顯微鏡下鏡檢，選取根尖有絲分裂中期染色體拍照。

1.3 花粉母細胞壓片鑒定

取孕穗期鴨茅小穗，置于卡諾氏固定液24 h，用95%乙醇洗凈后轉(zhuǎn)入70%乙醇中，于4 ℃冰箱儲存[22]。從固定好的小穗上取下小花，使用鑷子及解剖針剝離下雄蕊置于載玻片上，用改良苯酚品紅溶液染色5 min，輕輕用解剖針切至花粉母細胞離出，蓋上蓋破片輕按后酒精迅速燒片，鏡檢觀察減數(shù)分裂中期染色體配對情況。

1.4 鴨茅細胞核懸液制備

本試驗選用Otto、LB01、Tris.MgCl2、Hepes解離液進行對比試驗，目的是篩選出適合鴨茅細胞核分離的最佳解離液，從而得到鴨茅細胞核。具體操作為：先將干凈培養(yǎng)皿傾斜置于冰盒上，取供試樣品幼嫩葉片約20 mg，蒸餾水沖洗表面后用濾紙吸干水分，加入1 mL預冷的解離液并沒過材料，用鋒利的刀片將葉片切碎，吸打混合后，吸取上清，通過300～400目(0.04～0.05 mm)尼龍網(wǎng)將液體移入1.5 mL EP管中，1100 r·min-1離心5 min，收集細胞核，棄上清至細胞核上方有100 mL左右液體，輕輕搖動重懸浮細胞核，再加入相同的解離液重懸即可。然后加入PI原液50 μg·mL-1，RNase原液50 μg·mL-1，4 ℃黑暗條件染色20～40 min，振蕩器搖晃后繼續(xù)用300～400目(0.04～0.05 mm)尼龍網(wǎng)過濾，置于流式細胞儀上檢測。

對于Otto核懸液的制備，本試驗參照Dolezel等[18]的兩步法進行細胞核懸浮液的制備和染色。需要先加入1 mL預冷的OttoⅠ解離核細胞，離心后用100 μL冰凍的OttoⅠ溶液重懸，再加入OttoⅡ溶液1 mL。

1.5 雞血紅細胞提取

試驗利用家雞雞血紅細胞作為參照估測鴨茅細胞核DNA含量大小。家雞雞血細胞提取步驟為：10 μL雞血加入1 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)稀釋，再加入1 mL濃度為0.2%的曲拉通，4 ℃放置10 min后取出，1000 r·min-1離心5 min，去上清，4 ℃條件下加PI染色30 min，PBS重懸，1000 r·min-1再次離心5 min，去上清后用PBS重懸即可。使用同一種參照材料檢測細胞核DNA含量大小時，注意控制儀器電壓保持不變。

1.6 外標法測定鴨茅倍性

流式細胞儀外標法測定倍性時，需要先檢測一個獨立的參照樣品再進行供試樣品檢測，每個待測樣品設(shè)置3次重復，每次收集細胞數(shù)不少于10000個，檢測后通過公式換算出供試樣品的倍性及DNA含量。本試驗首先選取雞血紅細胞[1.25 pg(1222.5 Mb)[23]]為外標參照物，上機檢測后使用MoFit軟件進行繪圖與結(jié)果分析，利用樣品G1期熒光強度均值計算鴨茅2006-1的DNA含量。

同時選取二倍體材料2006-1作為外標參照物，利用流式細胞儀光電倍增管接受鴨茅細胞核懸液的熒光信號與散射光信號，將其轉(zhuǎn)化為電信號后傳入計算機中，通過CytExpert軟件創(chuàng)建圖形和門控，調(diào)整閾值，在儀器采樣后最終得到鴨茅葉片熒光直方圖(峰圖)，其橫坐標表示樣品G1峰的熒光位置，即2C熒光通道范圍，縱坐標表示樣品細胞核數(shù)目。保持流式細胞儀參數(shù)不變，以2006-1的G1峰熒光均值為參照標準確定供試樣品倍性水平。其倍性及DNA含量計算公式如下：

供試樣品倍性水平或供試樣細胞核DNA含量=(參照樣品倍性水平或參照樣細胞核DNA含量×供試樣品G1峰熒光均值)/對照樣品G1峰熒光均值

1.7 內(nèi)標法測定鴨茅倍性

與外標法不同的是，流式細胞儀內(nèi)標法測定鴨茅倍性時，需要將已知倍性的參照樣品2006-1和供試樣品等量混合，然后通過檢測確定主峰熒光通道范圍，得出供試樣品的倍性水平，每個待測樣品設(shè)置3次重復，每次收集細胞數(shù)不少于10000個。值得注意的是，若參照植物和供試樣品的峰完全重疊表明兩者倍性相同。若出現(xiàn)內(nèi)標參照樣品和供試樣品兩個獨立的峰，則表明供試樣倍性可能與參照樣存在差異，我們選取其中的主峰為依據(jù)分析倍性即可。

1.8 細胞核DNA含量變異分析

樣品G1期峰熒光均值與細胞核DNA含量線性相關(guān)，其變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)值能夠有效表現(xiàn)流式細胞儀檢測數(shù)據(jù)的準確程度。試驗經(jīng)Cyto FLEX流式細胞儀檢測得到每個樣品的直方圖及散點圖后，以FSC格式導出，打開ModFit軟件進行數(shù)據(jù)擬合，除能得到樣品峰熒光均值外，還能得到G1期的變異系數(shù)CV。CV值越小，數(shù)值越穩(wěn)定，代表樣品檢測變異程度越小[24]。

2 結(jié)果與分析

圖1 壓片法測定鴨茅細胞倍性Fig.1 Ploidy analysis with chromosome compression A: 2006-1花粉母細胞減數(shù)分裂中期I染色體, 示7II; B: 90-103根尖染色體, 2n=14. A: Mitosis of PMC in 2006-1, showing 7II in metaphase Ⅰ; B: Mitosis of root tip squashing in 90-103, showing 2n=14.

2.1 鴨茅倍性的細胞學鑒定

鴨茅花藥壓片后，通過顯微鏡觀察2006-1花粉母細胞減數(shù)分裂中期染色體數(shù)目發(fā)現(xiàn)，鴨茅14條染色體配對形成7對，染色體形態(tài)為棒形、環(huán)形(圖1A)，這與之前本課題組鴨茅花粉母細胞染色體形態(tài)一致[25]。

同時我們也采用90-103鴨茅作為參照進一步驗證了二倍體鴨茅染色體數(shù)目，鴨茅根尖壓片后，通過顯微鏡觀察其細胞有絲分裂中期染色體數(shù)目2n=2x=14(圖1B)。

2.2 解離液選擇影響細胞核提取效果

在控制處理一致的條件下，分別使用Otto、LB01、Tris.MgCl2、Hepes解離鴨茅葉片，每個處理3個重復，由流式細胞儀檢測結(jié)果得出，Tris.MgCl2、Hepes處理下的鴨茅葉片都無法產(chǎn)生完整的樣品峰，葉片細胞核DNA含量很少，碎片峰面積高于樣品峰面積(圖2b，c)。而運用Otto、LB01解離都能夠得到完整的樣本峰，根據(jù)本試驗細胞核提取條件得出，Otto解離出的樣本峰優(yōu)于LB01，其峰更為集中，重復性好(圖4a和圖2a)。同時，使用ModFit軟件測定不同解離液條件下G1期CV值發(fā)現(xiàn)，使用Otto提取鴨茅細胞核時CV值為3.84%～5.08%，使用LB01時CV值為9.68%～15.82%，其余解離液檢測的CV值都大于10%或CV值無法計算得出，這表明利用Otto解離液提取細胞核結(jié)果最為準確，可得明顯主峰。

圖2 不同解離液對鴨茅2006-1出峰效果影響Fig.2 Effect of different lysis buffer on 2006-1 peak values a: LB01; b: Tris.MgCl2; c: Hepe

2.3 利用外標法分析鴨茅倍性

試驗以雞血紅細胞為參照樣品，分別進行雞血紅細胞和鴨茅2006-1細胞核DNA含量與熒光強度的檢測，分析得到鴨茅2006-1的DNA含量為2275.79 Mb(圖3)。以二倍體鴨茅2006-1為參照樣品，分別進行樣品倍性的檢測，使用參照材料對儀器進行校準后，再依次對其他鴨茅供試材料進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PI237609、PI295271為二倍體，寶興、PI538922、PI310393為四倍體(圖4)。

圖3 以雞血為外標檢測鴨茅DNA含量Fig.3 Detection of DNA content with chicken blood as external standard a: 雞血紅細胞 Red blood cells of chicken blood; b: 2006-1-1; c: 2006-1-2; d: 2006-1-3; e: 2006-1-4. mean: 熒光均值； CV： 變異系數(shù)The coefficient of variation.

圖4 流式細胞儀外標法測定細胞倍性Fig.4 Ploidy analysis with external standard a: 2006-1; b: PI237609; c: PI295271; d: 寶興 Baoxing; e: PI538922; f: PI310393.

2.4 利用內(nèi)標法分析鴨茅倍性

與外標法相比，內(nèi)標法每次處理供試樣品時，需要加入等量的2006-1葉片一同切碎。結(jié)果發(fā)現(xiàn)若圖形內(nèi)只存在單峰且其熒光均值在2006-1熒光值范圍內(nèi)，峰值高、峰面積大，此時只存在核DNA含量為2C的細胞，鑒定供試樣品為二倍體；若圖內(nèi)出現(xiàn)雙峰，由于混入?yún)⒄諛悠?006-1為二倍體，除存在核DNA含量為2C的細胞，同時還有核DNA含量為4C的細胞，其熒光值為二倍體的2倍，鑒定供試樣品為四倍體。由此，得出寶興為四倍體，PI237609、PI295271、PI224599、PI230116、PI265568為二倍體(圖5)。

圖5 流式細胞儀內(nèi)標法測定細胞倍性Fig.5 Ploidy analysis with internal standard a: 寶興 Baoxing; b: PI237609; c: PI295271; d: PI224599; e: PI230116; f: PI265568

2.5 內(nèi)標法和外標法的比較分析

試驗表明，以鴨茅2006-1作為內(nèi)標參照物，通過ModFit軟件分析得出，5個二倍體材料的熒光均值為(56.45±6.96)，變異系數(shù)(CV值)于5%上下波動，此時測得的熒光均值(mean值)更穩(wěn)定，檢測數(shù)據(jù)準確性更高(表1)。外標法檢測對儀器電壓及人為操作有一定的要求，一般情況下可以得到較為準確的結(jié)果，有時檢測結(jié)果會優(yōu)于選擇內(nèi)標參照物的檢測(圖6b，e)，但其存在的偶然誤差會影響出峰橫坐標大小，即引起熒光通量范圍的改變。偶然誤差影響較大時，儀器將無法測出完整樣品峰，只能顯示碎片峰，出現(xiàn)CV值數(shù)值偏大和檢測不出的情況，因此無法準確判斷材料倍性(圖6f )，此時使用重復試驗或者內(nèi)標法檢測，可以重新獲得檢測者所需的結(jié)果，但當材料珍貴缺少時，選擇內(nèi)標法更為直觀和準確，且檢測結(jié)果不易受其他組峰的干擾。

當供試樣品與參照樣品倍性產(chǎn)生明顯差異時，外標法檢測可以直觀體現(xiàn)材料倍性。本試驗在檢測寶興倍性時發(fā)現(xiàn)，使用外標2006-1為參照時，只存在單峰，此時檢測寶興的mean值為136.44，為二倍體2006-1的2倍，CV值為6.43%；當使用2006-1為內(nèi)標參照物時，寶興峰面積占全部峰面積的24.03%，其mean值為126.44，CV值為5.37%，由此可見，雖然內(nèi)標法CV值更小，檢測更為精確，但外標法對于倍性的直觀檢測具有一定優(yōu)勢。因此，本試驗在使用外標法鑒定46種材料倍性后，綜合數(shù)據(jù)針對其中21種材料繼續(xù)進行內(nèi)標分析，共鑒定出二倍體材料22份，四倍體材料24份(表2)。

表1 鴨茅二倍體內(nèi)外標熒光均值和變異系數(shù)比較 Table 1 Comparison of external and internal standard on diploid materials with mean and CV

圖6 利用ModFit的內(nèi)外標比較Fig.6 Comparison of external and internal standard with ModFit graph 內(nèi)標 Internal standard: a: 寶興 Baoxing; b: PI295271; c: PI231517; 外標 External standard: d: 寶興 Baoxing; e: PI295271; f: PI231517.

序號No.種質(zhì)編號Accession No.亞種D. glomeratasubsp.倍性Ploidy level 原產(chǎn)地Seed source序號No.種質(zhì)編號Accession No.亞種D. glomeratasubsp.倍性Ploidy level原產(chǎn)地Seed source1AKZ-NrGR667aschersoniana2x波蘭Polen24PI306730hispanica4x德國Greece2AKZ-NrGR668aschersoniana2x波蘭Polen25PI310393woronowii4x蘇聯(lián)Soviet Union3PI170344hispanica2x土耳其Turkey26PI346967marina4x葡萄牙Portugal4PI224599hispanica2x以色列Israel27PI346968marina4x葡萄牙Portugal5PI229472marina4x阿爾及利亞Algeria28PI346969marina4x葡萄牙Portugal6PI230116hispanica2x伊朗Iran29PI368880santai2x阿爾及利亞Algeria7PI231517hispanica2x摩洛哥Morocco30PI372621lobata4x德國Germany8PI237601juncinella2x西班牙Spain31PI418678juncinella4x西班牙Spain9PI237602lusitanica2x葡萄牙Portugal32PI441032smithii4x英國United Kingdom10PI237603lusitanica2x葡萄牙Portugal33PI441034smithii4x英國United Kingdom11PI237604marina4x葡萄牙Portugal34PI477989marina4x法國France12PI237605santai4x阿爾及利亞Algeria35PI499583glomerata2x中國China13PI237607smithii2x西班牙Spain36PI535737hispanica2x利比亞Libya14PI237609ibizensis2x西班牙Spain37PI538891glomerata2x俄羅斯Russian Federation15PI237610woronowii4x伊朗Iran38PI538920glomerata4x俄羅斯Russian Federation16PI251815glomerata4x意大利Italy39PI538921lobata4x俄羅斯Russian Federation17PI253572hispanica4x葡萄牙Portugal40PI538922woronowii4x俄羅斯Russian Federation18PI265567hispanica4x法國France41PI577065marina4x葡萄牙Portugal19PI265568hispanica2x西班牙Spain42PI577066marina4x葡萄牙Portugal20PI283241lobata2x德國Germany43PI634265lusitanica2x西班牙Spain21PI283242lobata4x德國Germany44ABY-BC-4800-1980Ujudaica2x黎巴嫩Lebanon22PI283243woronowii4x蘇聯(lián)Soviet Union45ABY-BC-5368-1970Uparthiana2x伊朗Iran23PI295271himalayensis2x印度India46w41628glomerata2x俄羅斯Russian Federation

3 討論

通過形態(tài)學鑒定植株倍性，是早期研究者最常使用的方法。1994年Loticato等發(fā)現(xiàn)二倍體與四倍體鴨茅葉片長度及株叢大小存在差異，在開花期形態(tài)差異最顯著，此時四倍體植株較二倍體植株更低矮，花序更直立，但僅通過形態(tài)學觀察不能精準判斷鴨茅倍性，種質(zhì)隔離及環(huán)境因素等作用，都有可能使雜交后代出現(xiàn)雜合，甚至是變異的情況。而在幼苗期，不同倍性材料形態(tài)學差異更不顯著，利用流式能在幼苗期鑒定植株倍性，將為高效準確篩選雜交育種材料提供便利。染色體計數(shù)和細胞學觀察，是分析植物倍性最直接有效的方式，但其工作量較大，根尖的獲取，細胞分裂時期的控制等多種因素影響其觀察的效果。相比較而言，利用花粉壓片要比根尖壓片更為準確，但鴨茅花粉育性與結(jié)實率都不高，花粉數(shù)目差異較大[27]，二倍體鴨茅花粉數(shù)量更少，操作更具難度。本試驗結(jié)合了前人對鴨茅的核型分析，主要采用染色體計數(shù)的方法鑒定鴨茅2006-1的倍性，然后在此基礎(chǔ)上進行流式細胞儀分析，能夠同時檢測多種鴨茅材料的倍性，此方法取材時間集中，取樣量少，細胞易提取，檢測速度快。

內(nèi)標與外標檢測是流式細胞儀用來確定植物DNA含量和植物倍性的常用方法，相比較而言，內(nèi)標法可以通過等量混合參照樣品和供試樣品獲取樣品峰差異，其鑒定結(jié)果準確，受儀器電壓及人為操作影響變異較小，檢測相同物種材料時，若出現(xiàn)參照主峰與供試樣主峰重疊且只有唯一峰時，說明兩者倍性相同，若出現(xiàn)雙峰且兩峰DNA含量接近時，則為不同倍性材料，只有當兩者DNA含量相近且無法區(qū)分差異時，倍性鑒定就會存在困難。外標法較內(nèi)標法操作簡單，對于同一物種相同條件下倍性的大量檢測具有優(yōu)勢，一般情況CV值保持在5%左右，但同時，外標法也要嚴格控制儀器條件與材料處理條件一致，減少人為操作產(chǎn)生的誤差，對于檢測效果較差，CV值過大的情況，可以多次重復排除人為與儀器產(chǎn)生的誤差。同時，內(nèi)外標參照物的選擇，一定程度會影響檢測樣品DNA含量。有研究表明參照樣本選擇同屬及近緣種材料，DNA含量相近，測試的差異性較小，更有易于準確表達待測樣品的倍性[28]。但又有試驗發(fā)現(xiàn)，即使是植物細胞，某些條件下也可以選用動物細胞作為參照，例如使用人類口腔上皮細胞做參照[29]，可用于測定棉花(Gossypiumspp.)胚珠內(nèi)DNA含量；用雞血紅細胞做植物的參照檢測倍性，于蘋果(Malusdomestica)[30]、桃屬(Amygdalus)、李屬(Prunus)[31]及獼猴桃(Actinidiaspp.)[32]中都有較好效果，這可能是由于選用的動物細胞核DNA與供試樣品核DNA含量差異較小導致的。此外，試驗也估測了鴨茅2006-1的細胞核DNA含量，起初選用大麥(Hordeumvulgare)為參照，估測得到的結(jié)果差異較大，此差異的產(chǎn)生可能與大麥基因組較大有關(guān)(5.1 Gb[33])，故后續(xù)選取雞血為參照，可較為精確地估測2006-1的倍性，在此基礎(chǔ)上，以2006-1為參照檢測其他鴨茅材料倍性也更為準確。

流式細胞儀分析植物細胞倍性時的關(guān)鍵一步就是解離液的選擇，對比發(fā)現(xiàn)，使用Tris.MgCl2、Hepes處理鴨茅葉片時無法產(chǎn)生樣品峰，而在既含酸又含Na鹽的Otto、LB01解離液中能夠測得較高的核DNA含量，雖然Dpoole?el等[34]和柳青慕等[35]使用LB01解離液可以得到較好的提取效果，但其中的添加物β-巰基乙醇毒性較大，本試驗嘗試使用去除β-巰基乙醇的LB01解離液提取鴨茅細胞核DNA發(fā)現(xiàn)，檢測樣能夠產(chǎn)生明顯的峰，但碎片峰所占面積較大，嚴重干擾鑒定結(jié)果準確性，因此最終選用Otto提取鴨茅細胞核，其出峰效果好，對于細胞核較少的樣品也能得到完整的峰。DTT等物質(zhì)有利于消除葉片中的酚類粘連物質(zhì)，但對于鴨茅細胞核的提取有抑制作用。關(guān)于探究離心時間、離心次數(shù)、PI含量、染色時間及過濾次數(shù)等多種因素對流式結(jié)果的影響，我們對比細胞核解離3 min與解離5 min，離心5 min與離心10 min，離心1次與離心2次得出，解離時間和離心時間的延長，會增加碎片峰產(chǎn)生的概率，解離次數(shù)的增加雖然會改變檢測準確度，但在控制解離時間的前提下，檢測樣品出峰效果并沒有較大的差異。上機前的再過濾更有利于出峰，防止堵塞儀器。此外，成熟葉片較幼嫩時期的葉片更易產(chǎn)生雜峰，為防止主峰分析受到干擾，盡量選擇幼嫩葉片檢測，或者使用F1代種子培養(yǎng)的植株葉片來檢測。

4 結(jié)論

本研究采用流式細胞術(shù)，以鴨茅二倍體材料2006-1為參照，篩選常用的4種細胞核DNA解離液，通過外標法為主，內(nèi)標法為輔的檢測方法，建立一套能夠高效穩(wěn)定檢測鴨茅倍性的流式檢測技術(shù)。通過此技術(shù)成功鑒定出46種鴨茅種質(zhì)材料倍性。通過DNA含量分布圖和ModFit數(shù)據(jù)分析得出，相對于LB01、Tris.MgCl2和Hepes，Otto是最適合鴨茅葉片的解離液，產(chǎn)生的樣品峰清晰集中，檢測數(shù)據(jù)變異小，準確性好。在檢測方法的選擇上，內(nèi)外標法各有優(yōu)劣勢，對比5種二倍體和1種四倍體材料發(fā)現(xiàn)，內(nèi)標法檢測相同倍性材料的熒光均值較穩(wěn)定，且針對單個樣品的檢測準確性較高；外標法檢測可能存在偶然誤差，表現(xiàn)為不能正常出峰或CV值過大，但外標法操作便捷，數(shù)據(jù)直觀性很好，適于大量檢測。