龔 軍 路翔宇 熊 偉 許 建 張 浩 俞小炯

（四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院肝膽胰外 四川 成都 610072）

聚肌胞苷酸（polyinosinic polycytidylic acid，Poly I：C）為T(mén)oll樣受體3（TLR3）的特異性配體，且TLR3對(duì)TRIF依賴(lài)性信號(hào)通路專(zhuān)一介導(dǎo)。大量研究發(fā)現(xiàn)[1-4]，TLR3的特異性激動(dòng)劑Poly I：C在體內(nèi)外對(duì)缺血缺氧的神經(jīng)細(xì)胞均有保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)[5-8]，Poly I：C對(duì)腦缺血損傷小鼠的神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，并且可增加腦缺血小鼠及體外氧糖剝奪損傷處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞TLR3-TRIF信號(hào)通路下游IFN-3的表達(dá)起到抑制炎癥反應(yīng)的作用。但現(xiàn)階段尚未明確其具體作用機(jī)制，因此本研究采用Western blot檢測(cè)氧糖剝奪損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞模型TLR3信號(hào)通路中的相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，進(jìn)一步探討Poly I：C對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

SD乳鼠，購(gòu)自于凱學(xué)生物科技（上海）有限公司。Poly I：C（購(gòu)自于上海玉博生物科技有限公司），TRIF、TLR3一抗（購(gòu)自于上海研盟生物工程有限公司），pIRF3、NF-KB一抗（購(gòu)自于上海滬震實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 于超凈工作臺(tái)取出生1d SD大鼠大腦皮質(zhì)組織，在DMEM/F12青霉素小瓶中剪成1mm3的組織塊，加入等體積的0.25%胰蛋白酶37℃消化5min，后加入含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)液終止消化。液體采用200目濾網(wǎng)過(guò)濾，離心去上清，沉淀細(xì)胞接種于完全培養(yǎng)液中，在傳代6次后即可使用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組和模型建立 分為對(duì)照組、氧糖剝奪組（OGD）、Poly I：C（10、20ug/ml）、預(yù)適應(yīng)組（Poly I：C+OGD）。取第6代細(xì)胞按照分組分別采用DMEM或Poly I：C與DMEM孵育24h，對(duì)照組使用有糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，其余各組采用無(wú)糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)12h后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.3 Western blot檢測(cè)TLR3、pIRF3、pNF-KB表達(dá) 在各組細(xì)胞中加入80ul的含有蛋白酶抑制劑、磷酸化蛋白酶抑制劑的低溫蛋白裂解液，4℃處理0.5h，12000r/min離心15min，取上清。配置含蛋白50ug電泳樣品，制備厚度為1.0mm的5%聚丙烯酰胺凝膠（pH=6.8），8%分離膠（pH=8.8）。濃縮膠80V電泳0.5h，分離膠103V電泳至溴酚藍(lán)燃料前沿至凝膠末端處。取出后4℃、橫流電流250mA轉(zhuǎn)膜2～3h，常溫封閉90min，隨后加入一抗，4℃過(guò)夜孵育，采用TBST洗膜后加入二抗常溫孵育90min。加入ECL reagent顯色液，暗室下膠片曝光、掃描后采用軟件定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 Poly I：C對(duì)對(duì)氧糖剝奪損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞TLR3蛋白表達(dá)影響

與對(duì)照組對(duì)比，OGD組和Poly I：C+OGD組星形膠質(zhì)細(xì)胞TLR3表達(dá)水平增加（P＜0.01）；OGD組、Poly I：C+OGD各組之間互相對(duì)比星形膠質(zhì)細(xì)胞TLR3表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 Western blot檢測(cè)Poly I：C對(duì)對(duì)氧糖剝奪損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞TLR3蛋白表達(dá)影響

2.2 Poly I：C對(duì)對(duì)氧糖剝奪損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞pIRF3蛋白表達(dá)影響

OGD組和Poly I：C+OGD組星形膠質(zhì)細(xì)胞pIRF3表達(dá)水平均高于對(duì)照組（P＜0.05），Poly I：C+OGD組星形膠質(zhì)細(xì)胞pIRF3表達(dá)水平均高于OGD組（P＜0.05），Poly I：C+OGD各組對(duì)比星形膠質(zhì)細(xì)胞pIRF3表達(dá)水平無(wú)差異性（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 Western blot檢測(cè)Poly I：C對(duì)對(duì)氧糖剝奪損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞pIRF3蛋白表達(dá)影響

2.3 Poly I：C對(duì)氧糖剝奪損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞pNF-KB蛋白表達(dá)影響

OGD組和Poly I：C+OGD組星形膠質(zhì)細(xì)胞pIRF3表達(dá)水平均高于對(duì)照組（P＜0.05），OGD組、Poly I：C+OGD各組之間互相對(duì)比星形膠質(zhì)細(xì)胞TLR3表達(dá)水平無(wú)差異性（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)Poly I：C對(duì)對(duì)氧糖剝奪損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞pNF-KB蛋白表達(dá)影響

3.討論

大量研究證實(shí)，TLR3特異性受體激動(dòng)劑Ploy I：C在缺血缺氧條件下對(duì)神經(jīng)細(xì)胞存在保護(hù)作用。如Packard等[9]在小鼠鬧缺血前給予Ploy I：C可有效緩解對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷。宋璞等給予皮層神經(jīng)元細(xì)胞Ploy I：C處理，結(jié)果表明Ploy I：C可有效緩解缺糖缺氧導(dǎo)致的原代神經(jīng)細(xì)胞損傷。Borysiewicz等[10]采用H2O2處理建立缺糖缺氧星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧模型，結(jié)果表明Ploy I：C可有效緩解H2O2導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷。

本研究結(jié)果表明，OGD組和Poly I：C+OGD組TLR3、pNF-KB表達(dá)水平均高于對(duì)照組（P＜0.05），pIRF3與對(duì)照組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Poly I：C+OGD組與OGD組對(duì)比，pIRF3蛋白表達(dá)水平增加（P＜0.05），pNF-KB表達(dá)水平降低（P＜0.05），TLR3表達(dá)無(wú)差異性（P＞0.05）。

綜上所述，Poly I：C通過(guò)促進(jìn)氧糖剝奪損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞pIRF蛋白的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)下游抗炎因子干擾素-β的表達(dá)相關(guān)。