梁月欽，夏 磊，李 怡，聞?wù)?/p>

(1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022；2.舟山市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全管理中心，浙江舟山 316021)

目前市面銷售的菌種種類和數(shù)量與日俱增，許多研究都直接選取市售的微生物制劑進(jìn)行試驗(yàn)。由于經(jīng)過市場(chǎng)驗(yàn)證，市售菌一般都具有純度高、活性好、成本低、無毒副作用、不污染生態(tài)環(huán)境等特點(diǎn)[1]，因而在各領(lǐng)域都具有廣泛應(yīng)用。生活垃圾資源化、土壤改良、病蟲防害、污水處理等都有賴于微生物的作用[2-3]。

我國(guó)目前水產(chǎn)行業(yè)急速發(fā)展，但水產(chǎn)加工業(yè)的滯后導(dǎo)致了大量水產(chǎn)品廢棄物的出現(xiàn)。盡管國(guó)際上試圖通過各種廢物處理系統(tǒng)減少?gòu)U物，但每年產(chǎn)生的廢物量一直在增加[4]。這些水產(chǎn)下腳料是重要的蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)來源[5]，通過不同的方法例如微生物發(fā)酵水解，可以有效利用這些副產(chǎn)物。實(shí)際上，蝦蟹的廢棄物依然具有不可估量的商業(yè)價(jià)值[6]。例如，將小蝦進(jìn)行一定程度的深度加工可以制得價(jià)值數(shù)倍的人造對(duì)蝦[7]。例如用魷魚內(nèi)臟制備魷魚醬油，提取黑色素，生產(chǎn)鈣制品等[8-10]，都是對(duì)廢棄物的合理利用，是變廢為寶的有效途徑。本文以魷魚內(nèi)臟、蝦蟹下腳料為發(fā)酵基質(zhì)，利用一種包含了光合菌、酵母菌、乳酸菌等益生菌類的商業(yè)混合菌進(jìn)行發(fā)酵技術(shù)和相應(yīng)工藝的優(yōu)化，為商業(yè)混合菌種合理利用水產(chǎn)品下腳料提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

商業(yè)菌：徐州益邦環(huán)?？萍加邢薰?；

魷魚內(nèi)臟、對(duì)蝦下腳料、梭子蟹下腳料：舟山國(guó)際水產(chǎn)城；

碳酸鈉、氫氧化鈉、無水硫酸銅、酒石酸鉀鈉等均為分析純，福林酚試劑（BR）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1600 型紫外分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市億能儀器實(shí)驗(yàn)廠；THZ-82B 氣浴恒溫震蕩器：金壇區(qū)白塔金昌實(shí)驗(yàn)儀器廠；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DGG-9140A 型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；YC-260 L 4℃冰箱：上海啟閔生物科技有限公司；FA1004N 分析天平：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；TG20-WS 離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘銳離心機(jī)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵工藝

下腳料儲(chǔ)存于-20℃冰箱中，通過流水解凍，稱取2.0 g 下腳料，然后加入一定比例的無菌水，最后將商業(yè)菌液在無菌環(huán)境下接種到下腳料底物中進(jìn)行單因素以及正交試驗(yàn)。發(fā)酵結(jié)束后離心取發(fā)酵上清液，利用福林酚法測(cè)定發(fā)酵液中可溶性蛋白的含量[11]，并計(jì)算出結(jié)果。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

用預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定單因素水平范圍。試驗(yàn)選取發(fā)酵溫度、菌種接種量、料水比以及培養(yǎng)時(shí)間這4 個(gè)因素作為試驗(yàn)的單因素，根據(jù)發(fā)酵液中可溶性蛋白轉(zhuǎn)化率來判斷各因素對(duì)發(fā)酵效果的影響[11]。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)通過前期單因素實(shí)驗(yàn)，選取上述4 種發(fā)酵因素來設(shè)計(jì)4 因素3 水平正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Orthogonal experimental design

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 可溶性蛋白含量測(cè)定

用Folin-酚法進(jìn)行發(fā)酵結(jié)果的測(cè)定[12]。

1.4.2 可溶性蛋白轉(zhuǎn)化率測(cè)定

可溶性蛋白轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式為：

式中M：蛋白轉(zhuǎn)化率；Y：發(fā)酵前可溶性蛋白含量；X：發(fā)酵后可溶性蛋白含量；N：發(fā)酵原料總蛋白含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 商業(yè)菌發(fā)酵魷魚內(nèi)臟試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 魷魚內(nèi)臟單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1.1 料液比單因素試驗(yàn)結(jié)果

固定菌液接種量為25%，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時(shí)間為1 d，將料水比設(shè)為1:1、1:3、1:5、1:7、1:9。采用福林酚法測(cè)定發(fā)酵后蛋白轉(zhuǎn)化率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1 所示。

微生物生長(zhǎng)過程中水分具有維持生命體溫、調(diào)節(jié)體液平衡等作用，而在發(fā)酵過程中添加適量的水，在為益生菌提供生長(zhǎng)環(huán)境的同時(shí)也能夠?qū)ζ渖顒?dòng)起到增益效果。從圖1 可以看出，蛋白轉(zhuǎn)化率隨著水分添加量不斷增加，料液比1:7 時(shí)達(dá)到最高，隨后開始下降，可能是過多的水分導(dǎo)致底物被稀釋從而影響了微生物代謝。

2.1.1.2 菌液接種量單因素試驗(yàn)結(jié)果

固定發(fā)酵溫度為30℃，料水比為1:7，發(fā)酵時(shí)間為1 d，將菌液接種量設(shè)為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)得發(fā)酵液中蛋白轉(zhuǎn)化率含量，結(jié)果如圖2 所示。

從圖2 可以看出，菌液接種量在30%時(shí)發(fā)酵結(jié)果明顯優(yōu)于其它比例，而繼續(xù)添加產(chǎn)物反而下降，可能是在一定的生長(zhǎng)環(huán)境下過多的菌體發(fā)生了競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)，形成了一定的生物拮抗，從而影響了發(fā)酵水平。

2.1.1.3 溫度單因素試驗(yàn)結(jié)果

固定菌液接種量為25%，料水比為1:7，發(fā)酵時(shí)間為1 d，將發(fā)酵溫度設(shè)為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果如圖3 所示。

圖1 料水比對(duì)發(fā)酵液中蛋白轉(zhuǎn)化率的影響Fig.1 Effect of feed water ratio on protein conversion in fermentation broth

圖2 菌液接種量對(duì)發(fā)酵液蛋白轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of inoculum quantity of bacterial liquid on protein concentration in fermentation broth

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液中蛋白轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on protein conversion in fermentation broth

每種微生物最適生長(zhǎng)溫度不盡相同，故而選擇最適的發(fā)酵溫度至關(guān)重要。從圖3 可以看出，發(fā)酵溫度在30℃時(shí)蛋白轉(zhuǎn)化率明顯高于其它溫度，溫度過低菌體生長(zhǎng)緩慢，溫度過高又會(huì)抑制菌體代謝活動(dòng)，從而影響發(fā)酵結(jié)果。

2.1.1.4 時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果

固定菌液接種量為25%，料水比為1:7，發(fā)酵溫度為30℃，將發(fā)酵時(shí)間設(shè)為1 d、2 d、3 d、4 d，考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響。結(jié)果如圖4 所示。

從圖4 可以看出，發(fā)酵時(shí)間2 d 的發(fā)酵效果明顯優(yōu)于其它發(fā)酵條件?？赡苁前l(fā)酵時(shí)間過久底物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已不足以供給菌體生長(zhǎng)，或是多肽又進(jìn)一步被微生物水解形成小分子肽，難以被檢測(cè)，從而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果降低。

2.1.2 發(fā)酵魷魚內(nèi)臟工藝優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)表2 結(jié)果，由極差R 可得，影響蛋白轉(zhuǎn)化率因素的主次為料液比＞溫度＞接種量＞時(shí)間，即料水比是影響商業(yè)菌發(fā)酵魷魚內(nèi)臟蛋白轉(zhuǎn)化率最主要因素，這是由于魷魚內(nèi)臟中營(yíng)養(yǎng)成分豐富，且大多屬于水溶性，合適的料液比可以更好地幫助菌體生長(zhǎng)，從而提升發(fā)酵結(jié)果。魷魚內(nèi)臟的最佳發(fā)酵條件為料水比1:7，溫度35℃，接種量30%，時(shí)間1 d，此條件下，蛋白轉(zhuǎn)化率可達(dá)20.33%。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中蛋白轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of culture time on protein conversion in fermentation broth

表2 魷魚內(nèi)臟正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Orthogonal experimental design and results of fermented salmon guts

2.2 商業(yè)菌發(fā)酵蝦下腳料試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 蝦下腳料單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 料水比單因素試驗(yàn)結(jié)果

條件同2.1.1.1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5 所示。

從圖5 可以看出，蛋白轉(zhuǎn)化率在料液比為1:7 時(shí)有最大值，再添加水反而稀釋了底物營(yíng)養(yǎng)，導(dǎo)致發(fā)酵水平下降。

2.2.1.2 菌液接種量單因素試驗(yàn)結(jié)果

條件同2.1.1.2，結(jié)果如圖6 所示。

從圖6 可以看出，蛋白轉(zhuǎn)化率隨著菌液接種量的增加不斷提高，當(dāng)接種量為30%時(shí)發(fā)酵效果最好，再多的菌液反而導(dǎo)致競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)，影響發(fā)酵效果。

2.2.1.3 溫度單因素試驗(yàn)結(jié)果

條件同2.1.1.3，結(jié)果如圖7 所示。

從圖7 可以看出，發(fā)酵溫度在30℃時(shí)候有蛋白轉(zhuǎn)化率最大值，此時(shí)菌體協(xié)同效果最好，生長(zhǎng)代謝最強(qiáng)，從而能夠快速分解底物中的蛋白質(zhì)。

2.2.1.4 時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果

條件同2.1.1.4，結(jié)果如圖8 所示。

從圖8 可以看出，發(fā)酵時(shí)間3 d 時(shí)蛋白轉(zhuǎn)化率最高，此時(shí)對(duì)蝦營(yíng)養(yǎng)基本被消耗完畢，繼續(xù)發(fā)酵反而導(dǎo)致可溶多肽進(jìn)一步被分解。

圖5 料水比對(duì)發(fā)酵液中蛋白轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of feed water ratio on protein conversion in fermentation broth

圖6 菌液接種量對(duì)發(fā)酵液蛋白轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Effect of inoculum quantity of bacterial liquid on protein concentration in fermentation broth

圖7 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液中蛋白轉(zhuǎn)化率的影響Fig.7 Effect of fermentation temperature on protein conversion in fermentation broth

圖8 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中蛋白轉(zhuǎn)化率的影響Fig.8 Effect of culture time on protein conversion in fermentation broth

2.2.2 發(fā)酵蝦下腳料工藝優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)表3 結(jié)果，由極差R 可得，影響蛋白轉(zhuǎn)化率因素的主次為料水比＞時(shí)間＞接種量＞溫度，即料水比是影響商業(yè)菌發(fā)酵蝦下腳料蛋白轉(zhuǎn)化率最主要的因素，最佳發(fā)酵條件為料水比1:7，接種量30%，溫度30℃，時(shí)間1 d，此條件下蛋白轉(zhuǎn)化率達(dá)到13.18%。

表3 蝦正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Orthogonal experimental design and results of fermented shrimp

2.3 商業(yè)菌發(fā)酵蟹下腳料試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 蟹下腳料單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1.1 料水比單因素試驗(yàn)結(jié)果

條件同2.1.1.1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9 所示。

從圖9 可以看出，蛋白轉(zhuǎn)化率隨料液比增加而提高，在1:7 時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)添加水反而導(dǎo)致蛋白轉(zhuǎn)化效率降低，影響最終發(fā)酵結(jié)果。

2.3.1.2 菌液接種量單因素試驗(yàn)結(jié)果

條件同2.1.1.2，結(jié)果如圖10 所示。

從圖10 可以看出，蛋白轉(zhuǎn)化率隨菌液接種量的增加而不斷提高，當(dāng)菌液接種量為30%發(fā)酵效果最好，繼續(xù)添加菌液反而導(dǎo)致競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)，使最終發(fā)酵蛋白轉(zhuǎn)化率下降。

圖9 料水比對(duì)發(fā)酵液中蛋白轉(zhuǎn)化率的影響Fig.9 Effect of feed water ratio on protein conversion in fermentation broth

圖10 菌液接種量對(duì)發(fā)酵液蛋白轉(zhuǎn)化率的影響Fig.10 Effect of inoculum quantity of bacterial liquid on protein concentration in fermentation broth

2.3.1.3 溫度單因素試驗(yàn)結(jié)果

條件同2.1.1.3，結(jié)果如圖11 所示。

從圖11 可以看出，發(fā)酵溫度在30℃時(shí)候蛋白轉(zhuǎn)化率最大，是菌體最適的生長(zhǎng)溫度，溫度太高或太低都會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制，影響菌體代謝活動(dòng)，從而使最終蛋白轉(zhuǎn)化率相對(duì)較低。

2.3.1.4 時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果

條件同2.1.1.4，結(jié)果圖12 所示。

從圖12 中可以看出，發(fā)酵時(shí)間2 d 時(shí)底物基本消耗殆盡，此時(shí)蛋白轉(zhuǎn)化率最高，繼續(xù)發(fā)酵反而導(dǎo)致水溶多肽被進(jìn)一步分解成小分子肽，影響檢測(cè)結(jié)果。

圖11 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液中蛋白轉(zhuǎn)化率的影響Fig.11 Effect of fermentation temperature on protein conversion in fermentation broth

圖12 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中蛋白轉(zhuǎn)化率的影響Fig.12 Effect of culture time on protein conversion in fermentation broth

2.3.2 發(fā)酵蟹下腳料工藝優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)表4 結(jié)果，由極差R 可得，影響蛋白轉(zhuǎn)化率因素的主次為接種量＞時(shí)間＞料水比＞溫度，即接種量是影響商業(yè)菌發(fā)酵蟹下腳料蛋白轉(zhuǎn)化率最主要的因素，通過添加合適量的微生物能最大限度地發(fā)酵梭子蟹，最佳發(fā)酵條件為料水比1:7，接種量30%，溫度35℃，時(shí)間1 d，此條件下蛋白轉(zhuǎn)化率可達(dá)12.76%。

表4 蟹正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.4 Orthogonal experiment design and results of fermented crab

2.4 討論

商業(yè)混合菌發(fā)酵魷魚內(nèi)臟的蛋白轉(zhuǎn)化率可達(dá)20.33%；發(fā)酵蝦下腳料的蛋白轉(zhuǎn)化率可達(dá)13.18%；發(fā)酵蟹下腳料的蛋白轉(zhuǎn)化率可達(dá)12.76%。由結(jié)果可見，商業(yè)混合菌發(fā)酵魷魚的效果相對(duì)蝦蟹較高，說明底物對(duì)微生物發(fā)酵影響較大。而蛋白約占蝦蟹下腳料干重的1/5[13]，相較于單一菌種的發(fā)酵，商業(yè)菌對(duì)蝦蟹下腳料的轉(zhuǎn)化結(jié)果相對(duì)較高。這主要得力于各菌種的協(xié)同作用，特別是其中的某些高效菌種發(fā)揮主要作用。已有研究表明，按照一定比率混合動(dòng)物蛋白和植物蛋白共同發(fā)酵，可以將植物中限制性氨基酸的相關(guān)影響降到最低，平衡產(chǎn)物中氨基酸含量，從而可以加工成極具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的高效飼料[14]。特別是一些高蛋白的原料，含量雖高，卻難以被吸收利用，通過微生物發(fā)酵，可以將其中的大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化成易于吸收的小分子物質(zhì)。利用微生物處理下腳料不僅賦予了海產(chǎn)品副產(chǎn)物更大的商業(yè)價(jià)值，且防止了這些下腳料對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的不良影響，與當(dāng)前大力提倡的綠色發(fā)展理念相符[15]。

3 結(jié)論

通過一系列優(yōu)化試驗(yàn)，明確了商業(yè)菌發(fā)酵魷魚內(nèi)臟及蝦蟹下腳料的最佳條件，包括發(fā)酵溫度、料水比、菌液接種量、發(fā)酵時(shí)間。其中發(fā)酵魷魚內(nèi)臟的蛋白轉(zhuǎn)化率可達(dá)20.33%；發(fā)酵蝦下腳料的蛋白轉(zhuǎn)化率可達(dá)13.18%；發(fā)酵蟹下腳料的蛋白轉(zhuǎn)化率可達(dá)12.76%?？梢娡ㄟ^商業(yè)復(fù)合菌的發(fā)酵，可以有效轉(zhuǎn)化水產(chǎn)下腳料中的蛋白質(zhì)等大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，極大提升了水產(chǎn)下腳料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和應(yīng)用前景。其中魷魚轉(zhuǎn)化率最高，對(duì)蝦其次，梭子蟹最低，說明底物本身的營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)對(duì)微生物發(fā)酵過程產(chǎn)生一定影響，后續(xù)研究或者實(shí)際應(yīng)用過程中可以通過添加外源性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)補(bǔ)全底物營(yíng)養(yǎng)源，從而更好地促進(jìn)微生物生長(zhǎng)代謝，提升發(fā)酵效率。隨著無抗時(shí)代的來臨，微生物技術(shù)逐步得到相關(guān)行業(yè)重視。微生物技術(shù)與水產(chǎn)行業(yè)的深度融合必將促進(jìn)水產(chǎn)行業(yè)的多元化發(fā)展。