金馨 ，趙建新 ，姚藝 ，黃俊杰 ，范琰琰 ，喻林升

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系，浙江 溫州325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)司法鑒定中心，浙江 溫州325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué)司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所，浙江 溫州325035）

膜聯(lián)蛋白是起源于鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白的超家族，其在結(jié)構(gòu)上均具有由四個重復(fù)的60～70個氨基酸組成的保守中心結(jié)構(gòu)域和承擔(dān)獨(dú)特功能的N端結(jié)構(gòu)域[1]。膜聯(lián)蛋白 A1（annexin A1，ANXA1），又稱為依鈣蛋白、磷脂酶A2抑制蛋白，是該家族中第一個被發(fā)現(xiàn)的成員，在機(jī)體多數(shù)器官、組織中廣泛存在。有研究[2-4]表明，ANXA1存在于單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥相關(guān)細(xì)胞中，在體內(nèi)具有抗炎癥作用，參與炎癥過程的調(diào)控。ANXA1可以誘導(dǎo)抗炎因子產(chǎn)生，抑制磷脂酶A2活性，以及環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和一氧化氮合酶的形成，阻止花生四烯酸等炎癥介質(zhì)的合成和釋放，抑制中性粒細(xì)胞的活性和游出等[5]。ANXA1也能促進(jìn)凋亡細(xì)胞的清除，避免凋亡細(xì)胞轉(zhuǎn)化成壞死細(xì)胞引發(fā)炎癥反應(yīng)[6]。此外，ANXA1也是血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成的重要調(diào)節(jié)劑[7]。

皮膚創(chuàng)口愈合是一個復(fù)雜的過程，涉及炎癥反應(yīng)、成纖維細(xì)胞增殖和組織重塑[8]，而愈合過程中相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)的改變可以為推斷損傷時間提供良好的參考依據(jù)。本研究檢測ANXA1在小鼠皮膚創(chuàng)口模型中的時序性表達(dá)和分布特征，旨在探討ANXA1在創(chuàng)口愈合中的作用及其在創(chuàng)口形成時間推斷中的參考價值。

1 材料與方法

1.1 樣本

清潔級健康雄性C57BL/KsJ小鼠45只，年齡8～10周，體質(zhì)量30～35g，由南京生物醫(yī)藥研究院提供。

本實驗經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審核通過，符合《實驗動物 福利倫理審查指南》[9]要求，盡量減少使用的動物數(shù)量和可能遇到的任何痛苦。

1.2 試劑

抗ANXA1抗體（ab137745，美國Abcam公司），兔二步法試劑盒（兔聚合物法檢測系統(tǒng)，PV-6001，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（orb229657，英國Biorbyt公司），Immobilon-P卷膜（IPVH00010，德國Merk Millipore公司），RIPA裂解液（強(qiáng)）（P0013B）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF） 100 mmol/L（ST506）、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠配置試劑盒（P0012A）及聚氰基丙烯酸正丁酯（butyleyanoacrylate，BCA）蛋白濃度測定試劑盒（P0010）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 損傷模型制作

40只小鼠（實驗組）背部剃毛，75%乙醇溶液消毒后，在乙醚麻醉下于背部中央做皮膚全層縱行切口，長度為1cm，不包扎及用藥。切創(chuàng)后分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，光照12h/d，保證環(huán)境清潔，防止創(chuàng)口感染。分別于切創(chuàng)后6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d、14d隨機(jī)選5只小鼠脫頸椎處死，以創(chuàng)口為中心，取創(chuàng)口及周邊處2.0cm×1.5cm大小的皮膚。5只小鼠（對照組）不做切創(chuàng)處理，脫頸椎處死后直接取相同部位同等大小皮膚。沿垂直創(chuàng)口方向?qū)⒚拷M樣本平均分成三份，分別用于制作石蠟切片、蛋白質(zhì)印跡分析、冰箱中備用（-80℃）[10]。

1.4 切片制備及染色觀察

將小鼠皮膚放入由磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）配制的4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）溶液中固定12 h后，經(jīng)大量清水沖洗，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成5mm厚度連續(xù)切片，烘干后放于冰箱4℃保存。

1.4.1 常規(guī)蘇木素-伊紅染色

切片65℃烤片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木素染色5min，1%鹽酸-乙醇分化3s后自來水返藍(lán)30min，1%伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察創(chuàng)口的組織學(xué)形態(tài)。

1.4.2 免疫組織化學(xué)染色

切片常規(guī)脫蠟水化，3%H2O2孵育10min去除內(nèi)源性過氧化物酶，微波熱修復(fù)法修復(fù)抗原，使用5%小牛血清在37℃烘箱內(nèi)孵育30 min，抗ANXA1抗體（1∶1000）作為一抗4℃過夜，使用兔二步法試劑盒在37℃烘箱內(nèi)孵育30min，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素染核。以PBS代替一抗作空白對照。在顯微鏡下觀察，ANXA1陽性染色顯示為棕黃色，每張切片在創(chuàng)口及其周邊區(qū)內(nèi)隨機(jī)選擇10個視野，計算其中ANXA1陽性染色細(xì)胞數(shù)與募集細(xì)胞總數(shù)的比值。

1.5 蛋白質(zhì)印跡分析

將各時間段的皮膚樣本分別剪碎，加VRIPA∶VPMSF=50∶1的混合液300 μL，組織勻漿，全程冰上操作。于冰上靜置20 min后，在4℃下以離心半徑10 cm，12000r/min，離心10min，吸取上清液，重復(fù)離心2次，用BCA法測量蛋白濃度后將樣品置于-80℃保存。于提取的蛋白樣本內(nèi)加入5×蛋白上樣緩沖液，金屬浴100℃變性10 min，上樣總蛋白量為30 μg。用10%SDS-PAGE分離蛋白，再將蛋白轉(zhuǎn)印到Immobilon-P卷膜上，轉(zhuǎn)膜條件為250mA、50min。含有吐溫的Tris緩沖鹽溶液（Tris-buffered saline tween，TBST）洗滌3次，用5%脫脂牛奶封閉2 h，用抗ANXA1抗體（1∶5 000）孵育4℃過夜。TBST洗滌3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG使用TBST稀釋（VIgG∶VTBST=1∶5000）室溫孵育2h，TBST洗滌3次后，用電化學(xué)發(fā)光免疫測定法（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）顯現(xiàn)蛋白條帶。用Scion Image 4.0軟件（美國Scion公司）分析各時間段條帶的光密度值，以β微管蛋白（β-tubulin）作為內(nèi)參，計算各組ANXA1蛋白的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，蛋白表達(dá)相對水平采用±s表示，細(xì)胞陽性率用百分率表示。ANXA1表達(dá)量的組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 蘇木素-伊紅染色和免疫組織化學(xué)染色

與對照組（圖1A）相比：中性粒細(xì)胞于傷后6h開始出現(xiàn)在創(chuàng)口的周圍，傷后12h增多（圖1B），于傷后3 d開始減少。單核細(xì)胞于傷后1 d聚集于傷口的邊緣，其數(shù)量于傷后3 d達(dá)到峰值（圖1C）。成纖維細(xì)胞于傷后3 d開始出現(xiàn)在傷口底部，于傷后5 d增多（圖1D），傷后7d達(dá)到峰值。肉芽組織形成于傷后5～10 d，其內(nèi)可見成纖維細(xì)胞和豐富的新生毛細(xì)血管（圖1E）；在傷后10～14d，表皮完全覆蓋創(chuàng)口，肉芽組織開始向瘢痕組織轉(zhuǎn)變，可見新生毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，間質(zhì)增多（圖1F）。

在免疫組織化學(xué)染色中，對照組皮膚的表皮、毛囊（圖2A）、皮脂腺、血管內(nèi)皮表現(xiàn)出ANXA1陽性染色，未見假陽性染色。在實驗組的皮膚切創(chuàng)及周邊區(qū)，ANXA1的陽性染色在傷后6～12 h主要出現(xiàn)在中性粒細(xì)胞和少量單核細(xì)胞中，在傷后1～3d主要出現(xiàn)在單核細(xì)胞中（圖2B），而在傷后5～10d，其陽性表達(dá)主要出現(xiàn)在新生毛細(xì)血管內(nèi)皮、成纖維細(xì)胞和少量單核細(xì)胞中（圖2C～D）。傷后14 d，新生的表皮及少量成纖維細(xì)胞仍有ANXA1陽性表達(dá)。

從ANXA1陽性細(xì)胞數(shù)與所募集到的細(xì)胞總數(shù)的比值上看：在傷后6h～7d，與對照組相比，實驗組的陽性細(xì)胞率顯著增加（P＜0.05）；在傷后6h～3d，ANXA1陽性細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)的比值超過了40%，且在1 d時達(dá)到峰值，超過了60%（表1）。

表1 ANXA1在對照組和實驗組中的陽性細(xì)胞率（n=5，±s，%）

表1 ANXA1在對照組和實驗組中的陽性細(xì)胞率（n=5，±s，%）

注：1）與對照組比較，P＜0.05

陽性細(xì)胞率29.87±1.44 49.53±2.761）55.91±1.151）62.16±2.231）42.58±2.091）37.71±4.551）34.79±6.431）30.58±3.06 33.52±2.94組別對照傷后6h傷后12h傷后1d傷后3d傷后5d傷后7d傷后10d傷后14d

2.2 蛋白質(zhì)印跡結(jié)果

圖3和表2結(jié)果表明，在對照組和實驗組均有ANXA1條帶，于損傷后6h開始上升，在1d時達(dá)到高峰，之后逐漸下降。實驗組與對照組的相對值單因素方差分析顯示，實驗組ANXA1在6h～3d的表達(dá)與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。另外，ANXA1相對于β-tubulin的表達(dá)強(qiáng)度，在傷后6 h時，與對照組相比數(shù)值明顯上升（P＜0.05），在1d時達(dá)到峰值，超過了1.0，在其他時間段內(nèi)，蛋白相對表達(dá)強(qiáng)度均低于1.0。

圖3 各時間段ANXA1的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果

表2 ANXA1在對照組和實驗組中的蛋白相對表達(dá)量（n=5，±s）

表2 ANXA1在對照組和實驗組中的蛋白相對表達(dá)量（n=5，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05

相對表達(dá)量0.63±0.07 0.83±0.041）0.91±0.061）1.02±0.051）0.90±0.061）0.72±0.07 0.67±0.06 0.59±0.08 0.61±0.08組別對照傷后6h傷后12h傷后1d傷后3d傷后5d傷后7d傷后10d傷后14d

3 討 論

ANXA1是位于細(xì)胞質(zhì)的鈣和磷脂結(jié)合蛋白，由348個氨基酸組成，其N端結(jié)構(gòu)域具有酪氨酸和絲氨酸激酶的磷酸化位點(diǎn)以及糖基化和轉(zhuǎn)谷氨酰胺位點(diǎn)。當(dāng)細(xì)胞活化后，ANXA1可以通過自分泌和旁分泌機(jī)制分泌到胞外[11]。ANXA1是糖皮質(zhì)激素抗炎癥作用中的重要介質(zhì)，糖皮質(zhì)激素可以通過上調(diào)ANXA1的表達(dá)來抑制細(xì)胞的黏附作用及中性粒細(xì)胞的遷移[2，12-13]，同時ANXA1也是參與內(nèi)源性抗炎癥途徑的重要調(diào)節(jié)分子。ANXA1的抗炎癥作用主要通過甲?；氖荏w（formyl peptide receptor，F(xiàn)PR）信號通路實現(xiàn)調(diào)控。ANXA1及其N端活性片段Ac2-26可以作為激動劑來激活FPR2，調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和T細(xì)胞受體信號通路，抑制激活蛋白1（activator protein 1，AP1）、核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）和活化T細(xì)胞的核因子（nuclear factor of activated T cell，NFAT）等的活性，從而抑制促炎性細(xì)胞因子的作用以及增加抗炎癥因子合成[2]。

本研究免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，ANXA1在各組樣本的表皮、毛囊、皮脂腺、血管內(nèi)皮均表現(xiàn)出陽性，與SAITO等[14]的實驗結(jié)果一致，提示ANXA1可能參與了皮膚穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。各實驗組和對照組相比，ANXA1的細(xì)胞陽性率顯著增高，于傷后1d達(dá)到峰值。傷后6 h～1 d，ANXA1在浸潤的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞呈現(xiàn)較高的陽性率。MORAND等[15]通過流式細(xì)胞術(shù)研究了人類白細(xì)胞亞群中ANXA1的存在，發(fā)現(xiàn)在單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中ANXA1含量最高，在淋巴細(xì)胞含量最低。PERRETTI等[2，16]研究發(fā)現(xiàn)，在人和小鼠的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中含有高水平的ANXA1。本實驗結(jié)果與以上研究一致，表明ANXA1在中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中高表達(dá)。既往研究結(jié)果[17]顯示，炎癥開始后，中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞相繼進(jìn)入炎癥區(qū)域，釋放促炎性細(xì)胞因子并激活抗炎癥反應(yīng)。因此，綜上研究結(jié)果提示，ANXA1可能參與到皮膚創(chuàng)口愈合炎癥反應(yīng)的調(diào)控。

此外，本研究結(jié)果顯示，ANXA1的細(xì)胞陽性率于傷后3d開始下降。傷后3d的損傷周圍仍可見較多單核細(xì)胞表達(dá)ANXA1，傷后5～14d的損傷周圍ANXA1主要表達(dá)于成纖維細(xì)胞。從法醫(yī)病理學(xué)應(yīng)用的角度，ANXA1在創(chuàng)口愈合中的表達(dá)呈現(xiàn)一定的時間規(guī)律性，可用于損傷時間的推斷。傷后6h～3d，細(xì)胞陽性率大于40%；傷后12 h～1 d，細(xì)胞陽性率大于55%；傷后1d，細(xì)胞陽性率大于60%。為了進(jìn)一步明確ANXA1表達(dá)的時序性變化，本研究使用蛋白質(zhì)印跡法檢測了其蛋白表達(dá)的相對水平。ANXA1蛋白表達(dá)水平與其細(xì)胞陽性率變化趨勢基本一致，于傷后1 d達(dá)到峰值。本研究提示，ANXA1表達(dá)的時間規(guī)律性可為皮膚創(chuàng)口形成時間的推斷提供參考依據(jù)，有望成為一種用于推斷創(chuàng)口形成時間的生物學(xué)指標(biāo)。

在法醫(yī)學(xué)鑒定實踐中，損傷時間的準(zhǔn)確推斷可以為判斷案情提供線索和依據(jù)。近年來，尋找與損傷時間具有良好相關(guān)性的指標(biāo)成為法醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。經(jīng)研究[18]證實，參與皮膚創(chuàng)口愈合的一些細(xì)胞因子可用于創(chuàng)口形成時間的推斷。如白細(xì)胞介素（interleukin，IL）1a的細(xì)胞陽性率大于30%提示損傷時間為4h～1d，IL-8的細(xì)胞陽性率大于50%提示損傷時間為1～4d，人單核細(xì)胞趨化蛋白-1（human monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）的細(xì)胞陽性率大于30%提示損傷時間為1～7 d，巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α（macrophage inflammatory protein 1α，MIP-1α）的細(xì)胞陽性率大于40%提示損傷時間為1～9d，VEGF的細(xì)胞陽性率大于50%提示損傷時間為7～14 d，氧調(diào)節(jié)蛋白150（oxygen regulated protein-150，ORP-150）的細(xì)胞陽性率大于40%提示損傷時間為7～21d。此外，基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloprotein 2，MMP2）和MMP9、CC趨化因子配體2（CC chemokine ligand 2，CCL2）和CCL3、IL-1b和IL-6以及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor α，TNFα）的mRNA水平的時序性變化也有助于損傷時間的推斷[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，ANXA1在皮膚損傷后的炎癥階段廣泛表達(dá)于中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，適合于創(chuàng)傷早期的創(chuàng)口形成時間的推斷，尤其是1d左右的創(chuàng)口損傷時間的推斷。因此，綜合檢測多種細(xì)胞因子及ANXA1的表達(dá)，可以進(jìn)一步增加皮膚創(chuàng)口形成時間推斷的精確性，縮小損傷時間推斷的誤差。但本研究結(jié)果基于易受控制的動物實驗，僅提供了ANXA1可用于創(chuàng)口形成時間推斷的實驗依據(jù)。后續(xù)還應(yīng)在實際檢案中搜集不同時間的創(chuàng)口樣本，檢測ANXA1的表達(dá)，以探究ANXA1在實際檢案中的適用性。