（復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 200032）

1994年由澳大利亞Macquarie大學(xué)的學(xué)者Wilkins和Williams等提出蛋白質(zhì)組（proteome）一詞，該詞為蛋白質(zhì)（protein）與基因組（genome）兩個詞的結(jié)合，并且于1995年發(fā)表于Electrophoresis上，被定義為“一種基因組所表達的全套蛋白質(zhì)”[1]。蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）是蛋白質(zhì)組概念的延伸，是在整體水平上研究蛋白質(zhì)組的特性、結(jié)構(gòu)、功能以及活動規(guī)律的一門科學(xué)，隨著人類基因組計劃的完成，生命科學(xué)步入后基因組時代，蛋白質(zhì)組也逐步成為功能基因組研究的主要內(nèi)容之一[2]。

法醫(yī)病理學(xué)的主要任務(wù)是運用相關(guān)的醫(yī)學(xué)專業(yè)知識解決有關(guān)暴力死亡和非暴力死亡的死亡征象、死亡原因、死亡方式、死亡時間、死亡地點、個體識別以及致傷物的推斷和確定等。然而，在多數(shù)死亡案件中，法醫(yī)病理學(xué)家主要解決的難點問題主要集中在死亡時間和死亡原因這兩個方面，這也是法醫(yī)病理學(xué)的兩個主要科學(xué)問題[3]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，死亡時間（postmortem interval，PMI）的推斷已不僅僅局限于尸體現(xiàn)象、尸體化學(xué)、法醫(yī)昆蟲學(xué)等，在死亡原因的鑒定中有些死亡案例由于缺乏特異性的指標，很難作出明確的死亡診斷，如機械性窒息、猝死綜合征、過敏性休克等。利用 DNA[4]、mRNA[5-6]、microRNA[7]以及蛋白質(zhì)[8]檢測技術(shù)推斷死亡時間和判斷死亡原因的研究開始逐漸增多。

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)在臨床疾病的研究中應(yīng)用較為廣泛，主要用于發(fā)現(xiàn)新的疾病生物標志物、鑒定疾病相關(guān)蛋白質(zhì)、提高疾病早期診斷能力、開發(fā)新的藥物靶點、研制新型有效的藥物等方面[9-10]。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的不斷成熟，法醫(yī)病理學(xué)也逐漸運用該技術(shù)方法以更精確地指導(dǎo)法醫(yī)學(xué)實踐[11-13]。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究手段

1.1 雙向電泳技術(shù)

雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）作為蛋白質(zhì)分離的核心技術(shù)，由KLOSE和KLOSE等[14-15]于1975年建立經(jīng)典雙向凝膠電泳。2-DE是等電聚焦電泳和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）的組合，即具有相同等電點的蛋白質(zhì)無論其分子大小，在電場的作用下都會聚集在某一特定位置，再用SDS-PAGE將不同分子量的蛋白質(zhì)分離，電泳后根據(jù)蛋白質(zhì)的上樣量對膠進行染色，經(jīng)染色得到的電泳圖是個二維分布的蛋白質(zhì)圖，存儲凝膠圖像獲取蛋白定性和定量信息，利用圖像分析軟件分析蛋白質(zhì)各種信息。

在此技術(shù)上，雙向差異凝膠電泳技術(shù)（two-dimensional difference gel electrophoresis，2D-DIGE）[16-17]的出現(xiàn)大大彌補了2-DE技術(shù)上的缺點，2D-DIGE可在同一塊雙向電泳膠中分離多個不同熒光標記的樣品，并第一次引入了內(nèi)標的概念，從而避免了傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)膠與膠之間重復(fù)性差的缺點[18]。

HERNáNDEZ等[19]利用熒光差異凝膠電泳技術(shù)，對患有2型糖尿病黃斑水腫患者以及患有特發(fā)性黃斑裂孔的非糖尿病患者的玻璃體液進行差異蛋白研究。結(jié)果顯示，有81種蛋白質(zhì)呈現(xiàn)倍數(shù)差異，經(jīng)過質(zhì)譜技術(shù)識別出了25種玻璃體內(nèi)蛋白，其中檢測出的血紅素結(jié)合蛋白在2型糖尿病黃斑水腫患者的玻璃體液中明顯升高，而其他3種蛋白（β-晶狀體蛋白S、叢生蛋白和轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白）則相反，隨后又在另外18個樣本中進行酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），結(jié)果與2D-DIGE分析結(jié)果一致，進一步證實差異凝膠電泳技術(shù)更精確的定量能力。

1.2 質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜技術(shù)（mass spectrometry，MS）[20]憑借其高特異性、高靈敏度、高自動化等特點，成為蛋白質(zhì)鑒定的重要工具及核心技術(shù)。蛋白質(zhì)譜技術(shù)[21]是一種將質(zhì)譜儀用于研究蛋白質(zhì)的技術(shù)。其基本原理是用蛋白酶消化蛋白質(zhì)后的肽段混合物，在質(zhì)譜儀中形成帶電離子，經(jīng)過質(zhì)譜分析器與檢測器后將特定質(zhì)量與質(zhì)荷比（m/z）分離與收集，再通過質(zhì)量分析器后分析出每個肽段的m/z，即可得到蛋白質(zhì)的一級質(zhì)譜峰圖。如果存在強度較大的肽段離子，那么離子選擇器將對其進行二級質(zhì)譜分析。蛋白質(zhì)的鑒定即可通過一次質(zhì)譜峰圖與二級質(zhì)譜峰圖的比對而得出。目前較常用的質(zhì)譜分析儀有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatograph-mass spectrometer，GCMS）、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀（matrixassisted laser desorption ionization-time of flightmass spectrometer，MALDI-TOF-MS）等[22]，謝 增 瑞等[23]應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜法對死者器官中的毒鼠強進行檢測，由于干擾雜質(zhì)的減少，使得最后的檢測靈敏度較全掃描質(zhì)譜法大為提高。

1.3 生物信息學(xué)技術(shù)

生物信息學(xué)[24]是現(xiàn)代生命科學(xué)與信息科學(xué)、計算機科學(xué)、數(shù)學(xué)、統(tǒng)計學(xué)科相互交叉的學(xué)科。生物信息學(xué)主要在基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)兩方面體現(xiàn)[25]。在蛋白質(zhì)分析過程中，生物信息學(xué)的作用不僅僅體現(xiàn)在數(shù)據(jù)庫的查閱和資料的整合上，在蛋白質(zhì)組研究領(lǐng)域，如識別蛋白質(zhì)、對已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行分析等方面的作用更是至關(guān)重要的。高通量、大規(guī)模的實驗數(shù)據(jù)通過生物信息學(xué)軟件的處理，能夠?qū)D像分析、蛋白質(zhì)鑒定及比較提供更為快捷的幫助。如基因表達匯編（Gene Expression Omnibus，GEO）[26]數(shù)據(jù)庫其主要貯存DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA等人類基因組范圍內(nèi)高通量得到的表觀遺傳數(shù)據(jù)。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的新技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展在很大程度上受到技術(shù)的推動，因此，發(fā)展更高精度、更高通量、更高靈敏度的研究技術(shù)平臺是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的重要任務(wù)。

2.1 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

蛋白質(zhì)芯片（protein chip）[27]是一種新型的生物芯片，其原理是將標記了特定熒光的已知蛋白分子產(chǎn)物固定于經(jīng)過特殊化學(xué)處理的固相載體上，根據(jù)已知蛋白分子的特性，捕獲能與之特異性結(jié)合的待測蛋白，經(jīng)過漂洗、純化，再通過測定芯片上各點的熒光強度，最后由計算機分析結(jié)果，達到測定各種蛋白質(zhì)的目的。蛋白質(zhì)芯片具有可以從小量樣品（ng級）發(fā)現(xiàn)低豐度蛋白質(zhì)、直接用生物樣品（血清、體液、尿液）快速進行分析、高通量的驗證能力及優(yōu)點[28]。

NUERRULA等[29]運用蛋白芯片技術(shù)分析了差異表達的血清蛋白及其與透明細胞腎癌的臨床意義，所檢測出來的差異血清蛋白的m/z分別是15953、7987、9 304、8 948、5 911，相應(yīng)的特異性蛋白分別為Bcl-2家族凋亡調(diào)控蛋白、WAP四硫化物核心蛋白、Krueppel樣因子8、單核細胞趨化蛋白-1、血清淀粉樣蛋白β蛋白-4，并可能作為腎癌的腫瘤標志物。這些蛋白質(zhì)對透明細胞腎癌有很高的預(yù)測價值，可能有助于透明細胞腎癌的治療評估、預(yù)后和靶向治療。

蛋白芯片技術(shù)在基因表達篩選、抗原抗體檢測、生化反應(yīng)檢測、藥物篩選及疾病診斷等方面應(yīng)用廣泛[30-32]。

2.2 同位素標記相對和絕對定量技術(shù)

同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）[33]，其基本原理為用多種同位素試劑標記（可同時標記和比較不同的4種或8種蛋白質(zhì)樣品）已被裂解的蛋白多肽N末端或賴氨酸側(cè)鏈基團，這樣會產(chǎn)生成千上萬個光譜、數(shù)千個可識別多肽和上百個可鑒定蛋白，然后用質(zhì)譜技術(shù)對這些多肽進行定量分析，再利用生物信息學(xué)的工具和分析方法對數(shù)據(jù)進行有效的處理。

HERGENROEDER等[34]收集重癥顱腦損傷的成人患者血清，對人體血清樣本進行iTRAQ標記和分析，在初步鑒定出的160種血清蛋白質(zhì)中定量識別出其中31種蛋白質(zhì)的含量在顱腦損傷后發(fā)生了顯著改變，可能成為顱腦損傷的潛在生物標志物。隨后將顱腦損傷患者與正常成人血清進行ELISA，實驗結(jié)果表明，血清淀粉樣蛋白A和C反應(yīng)蛋白在急性損傷早期即可出現(xiàn)顯著上調(diào)，可作為急性顱腦損傷的候選分子。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

3.1 死后蛋白質(zhì)的變化

蛋白質(zhì)是機體的重要組成部分，機體死亡后，在多種蛋白水解酶及腐敗菌的作用下，機體蛋白質(zhì)成分逐漸分解成為氨基酸和小分子含氮物質(zhì)，含量逐漸減少直至消失。KIKUCHI等[35]用ELISA試劑盒檢測，發(fā)現(xiàn)死后7d內(nèi)大鼠血漿高遷移率族蛋白B1在4℃時隨PMI增加不斷上升，在14℃和24℃時先增加后減少。PARMAR等[36]通過白蛋白與溴甲酚綠染料結(jié)合從而發(fā)生顏色上的變化，再對白蛋白-溴甲酚綠結(jié)合物的吸收光譜進行定量，結(jié)果表明，腦脊液中的白蛋白在死后72h的降解呈線性，死后腦脊液中白蛋白濃度的降低可作為推斷死亡時間的一個依據(jù)。

齊麟等[37]通過分子生物學(xué)方法制備鼠抗人微管蛋白多克隆抗體，然后利用Western印記法檢測死后24、48、72和96h大鼠腎組織中微管蛋白的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在斷頸死亡和溺死這兩種死亡原因致死后的大鼠腎組織中微管蛋白均呈逐步降解的趨勢，斷頸死亡模型中，微管蛋白在機體死后96h檢測不到，但機體死后72h時仍有較高表達，溺死模型中，微管蛋白在機體死亡后72h檢測不到。機體死亡后體內(nèi)蛋白質(zhì)的變化有一定規(guī)律性或呈某種特異性，利用ELISA、Western印記法等可以對蛋白質(zhì)進行定性、定量的檢測，但無法大規(guī)模、高通量地對蛋白質(zhì)進行全面篩選及鑒定。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，其在推斷死亡時間及死亡原因方面也有所應(yīng)用。

3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在推斷死亡時間中的應(yīng)用

HUNSUCKER等[38]利用2-DE對小鼠腦組織進行分離，二維凝膠圖像顯示在25℃、死后4 h內(nèi)，大腦中近1000個蛋白質(zhì)中絕大多數(shù)是穩(wěn)定的。同樣，F(xiàn)OUNTOULAKIS等[39]用2-DE分析大鼠腦組織時發(fā)現(xiàn)，在23℃的實驗環(huán)境下，腦組織的蛋白質(zhì)發(fā)生變化大多都在死亡24h之后。KWAK等[40]利用2-DE和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（high-performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）在大鼠的心肌組織和肝組織中發(fā)現(xiàn)了26種蛋白質(zhì)（包括肌肉蛋白、氧化相關(guān)蛋白、代謝蛋白）的變化規(guī)律，心肌組織中的ATP合成酶、心肌肌球蛋白重鏈5、Tnnt2蛋白及結(jié)蛋白等9種蛋白質(zhì)在死后48 h內(nèi)呈逐步降解的趨勢，可作為法醫(yī)學(xué)推斷PMI的生物標志物。TAVICHAKORNTRAKOOL等[41]將蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)應(yīng)用于死后骨骼肌中蛋白的變化，觀察到在初始總蛋白質(zhì)濃度一致的情況下，經(jīng)2-DE圖像分析后，處于4℃的蛋白質(zhì)斑點總數(shù)在24h開始下降，而處于25℃的蛋白質(zhì)斑點總數(shù)在12h就開始下降。經(jīng)四極桿飛行時間串聯(lián)二級質(zhì)譜法（quadrupole time-of-flight mass spectrometry/mass spectrometry，Q-TOF MS/MS）分析鑒定出肌酸激酶、熱休克蛋白27以及肌紅蛋白，這三種蛋白質(zhì)斑點減少的體積與死亡時間有顯著相關(guān)性。

3.3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在推斷死亡原因中的應(yīng)用

在死亡原因的鑒定中有些死亡案例死因比較明確，容易作出準確的鑒定意見。而有些死亡案例由于缺乏特異性的指標，很難作出明確的死亡原因診斷。近些年，有學(xué)者嘗試利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對推斷死亡原因進行了初步研究。

任磊等[8]用外力打擊兔頸動脈竇建立神經(jīng)源性休克死亡的模型，利用雙向電泳后檢測打擊兔頸動脈竇致神經(jīng)源性休克死亡組及兔空氣栓塞致死組的心肌組織，兩組均有700個蛋白質(zhì)斑點，其中共有7個蛋白質(zhì)的差異改變在2倍及以上，在神經(jīng)源性休克死亡組中有5個蛋白質(zhì)斑點的表達上調(diào)，在正常對照組有2個蛋白質(zhì)斑點的表達下調(diào)。隨后進行液相色譜-芯片質(zhì)譜的鑒定，表達上調(diào)的蛋白有角蛋白10、α-2B腎上腺素能受體、超氧化物歧化酶、鋅指蛋白569、熱休克蛋白70，表達下調(diào)的蛋白有膜聯(lián)蛋白XⅢb、組織因子途徑抑制物。該研究初步說明神經(jīng)源性休克死亡發(fā)生了蛋白表達譜的改變，可為臨床及法醫(yī)檢案中出現(xiàn)的疑似神經(jīng)源性休克死亡案例的診斷提供輔助依據(jù)。法醫(yī)學(xué)實踐中，彌漫性軸索損傷（diffuse axonal injury，DAI）在交通事故所引起的顱腦損傷中占絕大部分且易導(dǎo)致死亡，尸體檢驗不易診斷。ZHANG等[42]采用串聯(lián)質(zhì)譜（mass spectrometry/mass spectrometry，MS/MS）加上iTRAQ標記技術(shù)在DAI小鼠組和非損傷小鼠組中共鑒定了1858種蛋白質(zhì)，并對其量化后確定了10個候選蛋白，經(jīng)免疫印跡和免疫組化分析證實，檸檬酸合成酶、突觸相關(guān)蛋白25、微管相關(guān)蛋白1B和Rho相關(guān)蛋白激酶2與DAI具有高度相關(guān)性。DAMMEIER等[43]為找到多次槍擊案件中的致死原因，用金屬片撞擊牛的心、腎、肝、肌肉以及肺組織，模擬槍擊案件。經(jīng)胰蛋白酶消化金屬片表面的組織后，采用LC-MS/MS運行測量，發(fā)現(xiàn)每個樣本均約有14000個肽段。通過對特征圖譜的質(zhì)譜鑒定，共鑒定出1756種蛋白質(zhì)。利用統(tǒng)計分析，結(jié)合定性、定量的結(jié)果，最終在每種組織中找出相關(guān)性最高的8個蛋白質(zhì)。此外，還進行了射擊實驗驗證了結(jié)果。該研究表明，利用蛋白質(zhì)組學(xué)尋找出器官特異性蛋白質(zhì)對遭受多次槍擊案后找出致死原因有實際意義。ECKHARDT等[44]對大鼠的心尖與基部進行了差異蛋白組學(xué)的分析，先從大鼠左右心室從上到下剪取組織提取蛋白質(zhì)，取上清液后用2-DE技術(shù)分離蛋白質(zhì)，將差異表達的蛋白質(zhì)斑點進行蛋白質(zhì)納米液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定（nano-liquid chromatography-tandem mass spectrometry，nLC-MS/MS）最后利用數(shù)據(jù)庫鑒定表達差異的蛋白質(zhì)。該研究首次揭示了心臟左、右心室的心尖處與基部處的多種蛋白質(zhì)在濃度上存在顯著差異。就左心室而言，5種蛋白質(zhì)（肌球蛋白輕鏈3、乳酸脫氫酶B鏈、肌酸激酶M、二氫硫辛酸脫氫酶、相對分子質(zhì)量為60000的熱休克蛋白）在心尖處具有更高的濃度；在右心室中，2種蛋白質(zhì)［肌酸激酶S型和質(zhì)子泵煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）］在心尖處具有更高的濃度。在這7種差異蛋白質(zhì)中，有5種蛋白質(zhì)參與能量代謝。由于不同的心臟病變會影響不同的心臟區(qū)域，這對在法醫(yī)病理學(xué)中不明原因心臟性猝死的探究起到提示作用。

3.4 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在毒理學(xué)中的應(yīng)用

當毒物進入機體，會擾亂機體的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，器官、蛋白質(zhì)以及細胞發(fā)生變化，運用蛋白質(zhì)組學(xué)能夠找出毒物的毒性變化、作用機制以及對靶器官的作用。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)能夠在毒理學(xué)研究中發(fā)揮重要作用。

LIN等[45]應(yīng)用iTRAQ技術(shù)對服用何首烏提取物的小鼠肝組織進行鑒定，一共檢測出23 619個肽段（10914個特異性肽段）和2040種蛋白質(zhì)。差異表達蛋白按其比值進行篩選后共有588種蛋白質(zhì)，其中300個表達下調(diào)，288個表達上調(diào)。爾后對這些差異蛋白質(zhì)應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析，如用于注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫（database for annotation，visualization and integrated discovery，DAVID）分析工具、韋恩分析（Venn diagram）、通路富集分析得出NADH脫氫酶家族蛋白和溶質(zhì)載體家族16成員2（solute carrier family 16 member 2，SLC16A2）可以被認為是何首烏造成肝毒性的潛在生物標志物。在日常生活中所用的塑料水瓶、食物包裝都會添加雙酚A（bisphenol A，BPA），BPA是一種人造雌激素，會引起肝功能障礙。VAHDATI等[46]將大鼠灌胃低劑量（0.5 mg/kg）BPA，30d后取出肝組織，經(jīng)2-DE區(qū)分出有差異表達的蛋白質(zhì)斑點，再利用MALDI-TOF/TOF后發(fā)現(xiàn)，在對照組和BPA處理組之間，15種總蛋白和12種磷蛋白斑點被差異調(diào)節(jié)。通過Western印跡分析驗證表明，蛋白表達變化趨勢與2-DE圖像分析和質(zhì)譜鑒定的結(jié)果一致。該研究采用的是基于凝膠的蛋白質(zhì)組學(xué)方法來鑒定經(jīng)BPA處理的肝組織的蛋白質(zhì)生物標志物，并研究BPA作用的分子機制。

4 展 望

蛋白質(zhì)組學(xué)是一門在蛋白質(zhì)水平上認識生命機理的學(xué)科，其學(xué)術(shù)理念和相關(guān)技術(shù)方法已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個領(lǐng)域，但在法醫(yī)學(xué)中的研究尚處于探索階段。

利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對死后不同時間點的蛋白質(zhì)進行精確定量，探尋其變化規(guī)律，從而對死亡時間進行推斷，同時利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)尋找不明死亡原因的特異性標志物，進一步探查出蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的互相作用，甚至DNA-蛋白質(zhì)、RNA-蛋白質(zhì)的相互作用，以闡明不明原因死亡的死亡機制。若能把控蛋白樣品制備和保存的均一化，那么利用蛋白質(zhì)組學(xué)解決法醫(yī)病理學(xué)研究中的科學(xué)問題將成為可能。