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(1.山西省農科院果樹研究所,山西 太谷 030815; 2.山西農業(yè)大學園藝學院,山西 太谷 030801)

水楊酸(Salicylic acid,SA),即鄰羥基苯甲酸,是一種植物體內產生的簡單酚類化合物。研究表明,SA可誘導植物體內病程相關蛋白基因的表達及系統(tǒng)抗病性的獲得[1],是植物抗病反應的信號分子和誘導植物對非生物逆境反應的抗逆信號分子[2],而且在植物生長、發(fā)育、成熟、衰老調控及抗逆誘導等方面,也具有廣泛的生理作用。

在逆境條件下,植物體內代謝失調,活性氧和自由基含量升高[3],而超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等是植物體內清除活性氧重要的保護酶,避免了自由基對有機體的攻擊和傷害,尤其是生物膜[4]。丙二醛(MDA)是膜脂過氧化作用的終產物之一,其含量的高低是反映脂質過氧化作用強弱的一個重要指標。此外,MDA還可與膜上的蛋白質、酶等結合,引起蛋白質分子內和分子間的交聯(lián),使之失活,破壞生物膜的結構和功能,從而使生物表現(xiàn)出傷害狀態(tài)[5]。SOD、POD、CAT能夠抑制逆境引發(fā)的丙二醛(MDA)積累[6],從而維持細胞的穩(wěn)定和完整,提高對逆境的適應性。因此,保護酶活性的高低及MDA的含量在一定程度上反映植物的耐逆境的能力[7]。

黃愛霞和佘小平[8]發(fā)現(xiàn),SA能夠提高SOD、POD的活性減緩膜脂中過氧化產物MDA積累,從而提高了黃瓜幼苗的抗低溫能力。宋士清等[9]研究表明,外源SA能夠顯著增強SOD、POD和CAT等保護酶活性,降低黃瓜的鹽害指數,MDA含量和電解質滲漏率,從而誘導黃瓜幼苗的抗鹽能力。王偉英等[10]研究SA處理能夠提高水仙葉片中SOD和CAT的活力,對衰老過程中產生的活性氧起到有效的清除作用。王麗等[11]研究外源SA能明顯提高葡萄幼苗在抗寒鍛煉期間根、莖中SOD,POD活性,降低質膜相對透性和MDA含量,增強了幼苗的抗寒性,且1.00 mmol/L SA處理表現(xiàn)最為明顯。詹妍妮等[12]研究認為:外源SA和熱鍛煉都能顯著降低膜脂過氧化水平,在噴施100 μmol/L SA后,葉肉細胞的MDA和O2-含量顯著降低,膜脂相對透性減小,保護酶系SOD、CAT活性都明顯升高。上述研究表明,SA能夠誘導SOD、POD、CAT活性的增強,抑制MDA積累,從而誘導植物抗逆性的產生。

本試驗通過外源噴施SA,闡明SA對葡萄葉片SOD、CAT活性及MDA含量的影響,為采用SA提高植物抗逆性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試材為長勢良好、土壤和管理條件一致的15株赤霞珠葡萄,分為5組,選擇植株中上部位成熟葉片進行標記,對植株進行SA處理,濃度分別為0.00 mmol/L、0.50 mmol/L、1.00 mmol/L、2.50 mmol/L、5.00 mmol/L,噴施時間為上午8時,在葉片表面不再濕潤時開始計時,分別在30 min,60 min,90 min,120 min采樣。

1.2 試驗試劑與用具

試驗試劑主要有:三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、甲硫氨酸、氮藍四唑(NBT)、核黃素、EDTA、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸二氫鈉、 三羥甲基氨基甲烷(Tris)、濃鹽酸、30%H2O2。

試驗用具主要有:TV-1810紫外可見分光光度計、數顯恒溫水浴鍋、離心機、制冰機、天平、研缽、試管、容量瓶、量筒、燒杯、玻璃棒、移液管、洗耳球、石英比色皿、溫度計、離心管、移液槍、試管架、剪刀、鑷子等。

1.3 試驗方法

1.3.1 SOD活性測定 采用NBT光還原法,以抑制NBT光化學還原50%的酶量為1個酶活力單位。剪取0.1 g葡萄葉片,置于研缽中,加入1 mL 50 mM pH 7.8磷酸緩沖液,加少量石英砂,冰上研磨,做3份重復,分別轉入1.5 ml離心管,12 000 rpm冷凍4℃離心15 min,取上清液供酶活測定。取17支大試管,各加入5 mL NBT反應液,從15份酶液中各取10 μL分別加入15支中,搖勻。另外2支為對照,1支對照管保存于暗處,作為參比;另1支對照管和15支樣品管在25 ℃下光照20 min后,在560 nm波長下比色。樣品酶活單位=[(照光對照管的吸光值-樣品管的吸光值)×酶液提取液總體積]÷(1/2×照光對照管的吸光值×樣品鮮重×測定時所用的酶液體積),樣品酶活單位表示:SOD酶活單位/g FW。

1.3.2 CAT活性測定 采用紫外分光光度計法測定。稱取葡萄葉片1.00 g 置于預冷的研缽中,加入5 ml(分兩次加入)預冷的 pH 7.0 磷酸緩沖液和少量石英砂,冰浴研磨成勻漿后,轉入 10 ml離心管中,在4 ℃、15 000 rpm下離心15 min,上清液即為過氧化氫酶粗提液。取4支10 ml試管,分別加 2 ml酶提取液于沸水浴中加熱煮死,冷卻備用。再取4支10 ml試管,3支為測定(3個重復),1支為對照,按要求加入試劑[Tris-HCl 1.0 ml,酶液 0.025 ml(對照組為煮死酶液),蒸餾水 1.7 ml]。然后將上述4支試管于25 ℃水浴中預熱3 min,逐管加入 0.2 ml 200 mM 的 H202溶液,每加1管立即在紫外分光光度計上測定A240(蒸餾水調零),每隔30 s讀數1次,共測3 min,記錄4支試管的測定值。結果計算:以1 min內A240降低0.1(3支測定管的平均值)為1個酶活性單位(U),先求出3支測定管各自1 min內A240降低值,按下式計算CAT活性。CAT活性(U·g-1FW·min-1)=(ΔA240×Vt)÷(0.1×Vs×t×FW) 式中ΔA240=As0-(As1+As2+As3)÷3;As0:煮死酶液對照管吸光度;As1、As2、As3:樣品測定管吸光度;Vt:酶提取液總體積(mL);FW:樣品鮮重(g)。

1.3.3 丙二醛含量測定 稱取0.4 g鮮重的葉片,加入少許石英砂和2 mL 0.1%三氯乙酸(TCA),充分研磨成勻漿后移到試管中,再用3 mL 0.1%三氯乙酸(TCA)分兩次沖洗研缽,合并提取液,每個樣作2個重復;在提取液中加入5 mL 0.5%的硫代巴比妥酸溶液,搖勻;將試管放入沸水浴中顯色反應15 min,到時間后立即取出并放入冰浴中冷卻至室溫;冷卻后轉入10 mL離心管中3 000 rpm離心15 min,取上清液,測定其體積,以0.5%的硫代巴比妥酸溶液為參比,測532 nm和600 nm波長下的吸光值。結果計算:MDA含量(m mol/g FW)=[(532 nm吸光值-600 nm吸光值)×上清液總體積]÷[155×稱取植物材料的鮮重]。

1.4 數據處理

采用Excel2003分析實驗數據及繪制折線圖、利用SAS進行方差數據分析。

2 結果與分析

2.1 外源SA對葡萄葉片SOD活性的影響

由圖1可以看出,外源SA對葉片超氧化物歧化酶SOD影響比較明顯,在處理后30 min到60 min時,各濃度處理都成上升趨勢,尤其是0.50 mmol/L處理時增長趨勢較好,且高于其他濃度的處理,60 min后低濃度處理組仍成上升趨勢,高濃度2.5 mmol/L和5.00 mmol/L開始下降,在90 min后各處理組的葉片SOD活性都為下降趨勢,說明外源SA對葡萄葉片SOD活性的影響先成上升然后下降的趨勢,又由表1可知處理為0.50 mmol/L在60 min時對葡萄葉片SOD活性影響顯著。

圖1 外源SA對葡萄葉片SOD活性的影響

表1 SOD方差分析表Tab1. The analysis of variance of SOD

2.2 外源SA對葡萄葉片CAT活性的影響

由圖2可以看出,外源SA處理后對葡萄葉片CAT活性呈現(xiàn)上升趨勢,促進了活性氧自由基的清除,而且在較低濃度的SA處理對CAT的活性影響較大,增長較快,濃度過高時作用不明顯,但在90 min后都有上升。在表2中可知0.50 mmol/L和1.00 mmol/L處理在120 min與對照相比差異顯著。

圖2 外源SA對葡萄葉片CAT活性的影響

2.3 外源SA對葡萄葉片丙二醛含量的影響

由圖3可知外源SA處理葉片后對膜質過氧化產物MDA含量有一定的影響,呈現(xiàn)出下降的趨勢,與對照組相比0.50 mmol/L處理組的MDA含量下降趨勢較大,在處理后120 min時達到最低值。在表3中可以看出0.50 mmol/L處理組與對照組相比差異顯著。

圖3 外源SA對葡萄葉片MDA含量的影響

表2 CAT方差分析表Tab.2 The analysis of variance of CAT

表3 MDA方差分析表

3 結論與討論

本文通過外源噴施SA,以赤霞珠葡萄(VitisviniferaL.cv.Cabernet Sauvignon)為試材,對不同濃度SA處理后葡萄葉片SOD、CAT、MDA的變化情況進行了初步研究,得出以下結論:

1)外源噴施SA后,葡萄葉片SOD活性先增強,在處理后90 min開始下降,而且SA濃度在0.50 mmol/L時SOD活性變化比較顯著。

2)外源噴施SA后,葡萄葉片CAT活性呈上升趨勢,0.50 mmol/L和1.00 mmol/L處理后上升效果顯著。

3)外源噴施SA后,葡萄葉片MDA含量變化有下降的趨勢,且在0.50 mmol/L處理組下降幅度明顯。

在正常條件下,植物體內活性氧的產生和清除處于動態(tài)平衡,而當處于逆境脅迫時,這一平衡被破壞而產生過多的自由基,植物為了適應進而繼續(xù)生存逐漸進化出一套適應機制和策略,使自身免受逆境傷害,隨即產生兩種系統(tǒng)防止活性氧的危害:酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)。植物的酶促防御系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)等,都具有清除自由基的能力,減輕膜質過氧化程度。前人研究[13-15]表明,外源SA可提高植物體內SOD活性,但SA對CAT活性的影響尚有爭議,Dat等[16]報告,外源水楊酸培養(yǎng)煙草植株降低了CAT活性,此結果在擬南芥[17]馬鈴薯微植體[18]和葡萄[19]中得到證實。但Rao等[13]和李兆亮等[14]研究認為,SA對CAT活性無顯著抑制作用;而何亞麗等[15]研究表明,0.5 mmol/L的水楊酸有提高高羊茅幼苗CAT活性的作用。詹妍妮等[12]用1年生赤霞珠葡萄幼苗噴施100 μmol/L的SA后,其葉肉細胞的CAT活性明顯升高。在本實驗中,對赤霞珠葡萄成熟葉片噴施0.50 mmol/L的SA后,其葉肉細胞的CAT活性也明顯升高,進一步說明SA對CAT有促進作用。王利軍等[20]研究表明,葡萄幼苗葉片噴施SA 1 h后,MDA含量就有顯著降低,之后雖有增高,但直到噴后24 h,仍比未噴施的低,這與本實驗結果相符。