何曉童，王盛祥，王玉萍

(甘肅農(nóng)業(yè)大學園藝學院，甘肅蘭州 730070)

植物的生長發(fā)育易受諸多環(huán)境因素的影響，其中，溫度和光照較為顯著.研究表明低溫是制約植物生長發(fā)育的重要環(huán)境因素之一， 0 ℃以上的低溫會導致冷害[1]，弱光直接影響著植物的凈光合速率[2].研究發(fā)現(xiàn)，低溫弱光是冬春保護地栽培中影響農(nóng)作物正常生長發(fā)育和高產(chǎn)的重要障礙因素，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中經(jīng)常遇到的惡劣環(huán)境條件，成為限制蔬菜產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素[3].

蕓豆(PhaseolusvulgarisL.)又名菜豆、棒豆及四季豆等，原產(chǎn)美洲的墨西哥和阿根廷，我國以華北、東北和西北栽培較多.紅蕓豆為蝶形花科菜豆屬一年生草本植物，適應范圍廣，籽粒營養(yǎng)豐富，是補充植物蛋白的重要豆類蔬菜作物.紅蕓豆在氣溫低于10 ℃時易受凍，其適宜生長繁殖溫度為18～20 ℃，喜光，是短日照異花授粉作物[4].由于生育期短、適應性廣等特點，發(fā)展紅蕓豆優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)化的種植已成為貧困山區(qū)農(nóng)民的致富的一個產(chǎn)業(yè)支柱.為了適應市場需求，冬春季溫室栽培紅蕓豆是個很好的種植方式，但冬春季溫室栽培常常伴有低溫弱光，對其生長和產(chǎn)量造成影響[5].

低溫脅迫下，植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，直接對細胞造成傷害[6],能引發(fā)植物抗氧化酶系和光合代謝等方面的改變[7].植物體內(nèi)存在多種抗氧化酶主要有超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)等以及一些小分子的非酶抗氧化劑，都參與了抗逆過程[8-9].低溫弱光也會影響葉綠素的含量，而葉綠素是植物轉(zhuǎn)換和利用光能的關鍵色素.葉綠素熒光參數(shù)被視為研究植物光合作用與環(huán)境關系的內(nèi)在探針.其中，最大光化學效率(Fv/Fm)是反映光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)最大光量子效率的重要參數(shù)，其提供了線性電子傳遞速率的測定方法.因此能反映植物光合能力的大小，并判定環(huán)境脅迫對光合機構的影響程度.

弱光壞境會影響植物的光形態(tài)建成，從而削弱光合有效輻射強度或引起光質(zhì)的改變[10].通常弱光處理下植物葉片厚度減小、葉色變淺、葉面積增加等現(xiàn)象[11].并且弱光環(huán)境下，植物光合速率受到直接影響，同時也受溫度，濕度，CO2濃度和品種自身差異共同作用的影響.另外，弱光脅迫會使植物細胞內(nèi)透性增大、電解質(zhì)外滲、活性氧代謝失衡、引發(fā)膜脂過氧化反應，造成細胞膜系統(tǒng)和代謝過程的損傷[12].

目前國內(nèi)外關于紅蕓豆的研究主要集中在種植密度、種植方式及貯藏等方面[13]，而低溫弱光脅迫對紅蕓豆生長及生理特性的影響方面研究較少.在冬春溫室條件下，低溫時常伴隨著弱光[14]，研究低溫逆境的試驗結果中有弱光因素起作用，有研究發(fā)現(xiàn)低溫下的弱光在一定程度上減弱了光合作用及相關酶活性的降低，保護了光合系統(tǒng)的穩(wěn)定，維系了植物的正常光合能力[15]，所以了解蔬菜植物對低溫弱光互作反應十分必要.本試驗研究了低溫弱光對2個品種紅蕓豆幼苗生長及相關生理指標的影響，比較了2個不同品種的耐性強弱，以期為進一步開展菜豆耐低溫弱光生理與菜豆抗冷性育種及高產(chǎn)栽培提供一定的理論依據(jù),以解決西北和東北地區(qū)冬春季溫室栽培受低溫弱光的影響提供一定的理論指導.

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

試驗以‘英國大紅蕓豆’和‘小紅蕓豆’2個品種為材料，取飽滿種子在播種前晾曬1 d，然后播種在裝有育苗營養(yǎng)土的小花盆中.正常光溫管理，晝夜溫度25 ℃/18 ℃，光周期12 h/12 h(晝/夜)，光照強度200 μmol/(m2·s).播種16 d后待幼苗長至3葉1心時挑選生長健壯且長勢一致的幼苗轉(zhuǎn)移至人工氣候箱中進行低溫弱光處理.試驗設4個處理，L-CK：英國大紅蕓豆晝夜溫度25 ℃/18 ℃，光照強度200 μmol/(m2·s)，光周期12 h/12 h(晝/夜).S-CK：‘小紅蕓豆’晝夜溫度25 ℃/18 ℃，光照強度200 μmol/(m2·s)光周期12 h/12 h(晝/夜).L-T：大紅蕓豆晝夜溫度15 ℃/10 ℃，光照強度60 μmol/(m2·s)光周期12 h/12 h(晝/夜).S-T：‘小紅蕓豆’晝夜溫度15 ℃/10 ℃，光照強度60 μmol/(m2·s)光周期12 h/12 h(晝/夜).處理組和對照組除溫度和光照不同外其他生長環(huán)境均相同，處理7 d后，把幼苗從低溫弱光移至正常溫光下(晝夜溫度25 ℃/18 ℃，光及溫度周期12 h/12 h(晝/夜)，光照強度200 μmol/(m2·s))進行恢復1 d、2 d、3 d.在處理和恢復期間分別取第2、3展開葉測定株高、莖粗、葉面積、過氧化氫酶(catalase,CAT),過氧化物酶(peroxidase,POD),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2),丙二醛(malonaldehyde,MDA)，谷胱甘肽(glutathione,GSH)，抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)，超氧陰離子(superoxide anion,O2-)、葉綠素含量以及葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fm.每處理90盆，每盆3株，重復3次.

1.2 測定指標與方法

1.2.1 抗氧化物質(zhì)及抗氧化酶 參照李合生[16]的方法，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定；SOD活性采用NBT還原法測定；POD活性采用愈創(chuàng)木酚法；過氧化氫酶采用直接比色法；超氧陰離子采用萘胺法.過氧化氫、GSH、APX采用南京建成的試劑盒測定.

1.2.2 葉綠素含量 用丙酮乙醇混合液法提取，用紫外可見分光光度計(DR/5000型)測定.

1.2.3 葉綠素熒光參數(shù) 采用英國Hansatech 公司生產(chǎn)的 FMS-2 型調(diào)制式葉綠素熒光儀測定.

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 低溫弱光脅迫對幼苗生長的影響

表1結果顯示：低溫弱光脅迫下，‘英國大紅蕓豆’株高在3，5，7 d分別比對照降低2.5%、4.6%和13.2%；在恢復1，2，3 d后分別比對照降低12.8%、13.5%、12.2%；處理7 d生長抑制達到顯著水平(P<0.05)，在脅迫解除后恢復速率逐漸增大.‘小紅蕓豆’株高在處理7 d比對照降低19%，在恢復3 d低于對照21%.莖粗的變化趨勢與株高相同，‘英國大紅蕓豆’幼苗莖粗在處理3、5、7 d分別比對照顯著降低4.7%、11.3%和16%，恢復1、2、3 d時分別比對照降低21%、21.%和17%，‘小紅蕓豆’幼苗莖粗在處理3、5、7 d分別比對照顯著降低8%、12%和18%，在恢復3 d比對照降低15%，低溫弱光脅迫對‘小紅蕓豆’莖粗的抑制比英國大紅蕓豆顯著，且在恢復過程中，英國大紅蕓豆的莖粗變化顯著高于‘小紅蕓豆’.‘英國大紅蕓豆’幼苗葉面積在處理3、5、7 d時，分別比對照顯著降低10%、10.2%和13%、而‘小紅蕓豆’分別比對照顯著降低8%、9%、15%.脅迫處理對英國大紅蕓豆葉面積的抑制作用沒有‘小紅蕓豆’顯著，而且在恢復過程中，葉面積增大速率也較‘小紅蕓豆’快.

表1 低溫弱光脅迫及恢復對紅蕓豆幼苗生長指標的影響

同行不同字母表示同一品種不同處理間差異顯著(P<0.05).S、L分別代表‘小紅蕓豆’、英國大紅蕓豆2個品種，CK表對照，T表低溫弱光處理.

Different letters in the same trade indicate that there is significant difference between different treatments of the same variety (P<0.05).S and L respectively represent two varieties ofS.sinensisandS.vulgaris,CK table,and T-table low-temperature and low-light treatment.

2.2 低溫弱光脅迫對紅蕓豆葉綠素含量及葉綠素熒光參數(shù)的影響

低溫弱光脅迫下，‘小紅蕓豆’幼苗葉片中葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)和總葉綠素均呈下降趨勢，下降幅度隨著脅迫時間的延長不斷增大(圖1).英國大紅蕓豆葉綠素a在處理3、5、7 d分別比處理前降低3.4%、10%和26%，處理7 d達最低值，在恢復3 d含量接近對照.‘小紅蕓豆’在處理3、5、7 d分別比對照降低6.8%、18%和31%，且在處理5 d、7 d與‘英國大紅蕓豆’差異顯著，恢復速率較慢.葉綠素b變化趨勢和葉綠素a變化趨勢相同，‘英國大紅蕓豆’在處理7 d比對照降低42%，并達最低值，在恢復1、2、3 d分別比處理前降低34%、20%、4%，在恢復3 d與處理前無顯著差異.相比‘英國大紅蕓豆’，‘小紅蕓豆’在脅迫下葉綠素b含量下降幅度更甚，在7 d比對照降低66%，恢復3 d比對照降低21%，恢復速率也較‘英國大紅蕓豆’慢.總葉綠素在低溫弱光脅迫下呈下降趨勢，在恢復過程有所提高，但相比‘英國大紅蕓豆’‘小紅蕓豆’在脅迫下下降幅度大，恢復速率慢，‘小紅蕓豆’在各個階段，無論脅迫還是恢復過程中總葉綠素含量都顯著低于‘英國大紅蕓豆’.

同色柱不同字母表示同一品種間不同處理差異顯著(P<0.05)，S表示‘小紅蕓豆’，L表示大紅蕓豆，T表示低溫弱光處理.Different letters on the same color column indicate significant differences between treatments in the same variety (P<0.05).S indicates small red kidney beans,L indicates red kidney beans,and T indicates low temperature and low light treatment.圖1 低溫弱光對紅蕓豆葉綠素及Fv/Fm的影響Figure 1 Effects of low temperature and weak light and recovery period on chlorophyll content and Fv/Fm of red kidney bean

低溫下植物CO2同化受阻，電子傳遞鏈被過度還原，因而即使是在弱光脅迫下，也會產(chǎn)生過剩的光能，對光系統(tǒng)造成傷害[16].Fv/Fm為暗適應條件下PSⅡ的最大光學轉(zhuǎn)換效率，表示將吸收的光能向PSⅡ轉(zhuǎn)換的潛力，能反映植物的光抑制的程度大小.圖1顯示，‘英國大紅蕓豆’和‘小紅蕓豆’的Fv/Fm在低溫弱光脅迫下均呈下降趨勢，前者在處理3、5、7 d分別比對照降低7%、15%和26%，下降幅度隨著脅迫時間的延長不斷增大，且與處理前差異顯著(P<0.05)，說明低溫弱光對PSⅡ造成了光抑制，在恢復1、2、3 d時分別比處理前降低13%、6%和3%，在恢復后期與處理前無顯著差異.‘小紅蕓豆’光抑制更為明顯，在處理3、5、7 d分別比對照降低11%、24%和43%，下降幅度顯著大于‘英國大紅蕓豆’，處理7 d達最低值，在恢復3 d后比對照降低7%，說明雖然受到光抑制，但脅迫沒有對植物的光合機構造成不可逆的傷害，總體上，‘小紅蕓豆’的PSⅡ光抑制比‘英國大紅蕓豆’顯著.

2.3 低溫弱光脅迫對葉片超氧陰離子與過氧化氫和丙二醛含量的影響

從圖2可以看出，低溫弱光下兩個紅蕓豆品種的丙二醛含量均呈上升趨勢，其中‘英國大紅蕓豆’在處理3、5、7 d時，較對照分別升高4%、21%和36%，在處理7 d達最高值，差異顯著(P<0.05)，在恢復過程中逐漸下降，與處理前無顯著性差異(P<0.05).‘小紅蕓豆’在處理3、5、7 d后分別比處理前升高27%、33%和47%，在恢復過程中也逐漸下降，在恢復3 d比處理前升高23%，相比大紅蕓豆，‘小紅蕓豆’的丙二醛含量隨時間延長積累速率顯著較高.低溫弱光處理下超氧陰離子的含量也不斷升高，

同色柱不同字母表示同一品種間不同處理差異顯著(P<0.05)，S表示‘小紅蕓豆’，L表示大紅蕓豆，T表示低溫弱光處理.Different letters on the same color column indicate significant differences between treatments in the same variety (P<0.05).S indicates small red kidney beans,L indicates red kidney beans,and T indicates low temperature and low light treatment.圖2 低溫弱脅迫及恢復期大紅蕓豆丙二醛、過氧化氫、超氧陰離子變化Figure 2 Changes of malondialdehyde,superoxide anion,hydrogen peroxide,peroxidase in the leaves of red bean during low temperature and weak light stress and recovery period

‘英國大紅蕓豆’在7 d達最高值，比對照增大44%，在恢復過程中不斷下降，但仍顯著高于處理前.與‘英國大紅蕓豆’相比，‘小紅蕓豆’超氧陰離子含量增加幅度顯著，在7 d達最高值，在恢復過程中緩慢下降，恢復3 d接近正常水平.在低溫弱光脅迫下過氧化氫含量隨著時間的延長不斷升高，但‘英國大紅蕓豆’增大幅度顯著低于‘小紅蕓豆’，后者在處理3、5、7 d分別比處理前升高25%、35%和53%，在7 d達到最高值，在恢復過程中緩慢下降，但較‘英國大紅蕓豆’恢復速率緩慢.

2.4 低溫弱光脅迫對葉片抗氧化酶活性及GSH含量的影響

從圖3可以看出，POD在低溫弱光條件下呈先下降后升高的趨勢，‘英國大紅蕓豆’在3 d、5d分別比處理前升高23%、25%，隨著脅迫時間延長開始下降，在恢復1 d下降到最低值，并且與處理前差異顯著，在恢復3 d接近處理前水平，‘小紅蕓豆’在3 d、5d雖然也呈升高趨勢，但升高幅度顯著小于‘英國大紅蕓豆’，在恢復1 d達最低值，與處理前差異顯著，并且恢復速率較慢.SOD的變化趨勢與POD的相同，在低溫弱光條件下3個紅蕓豆品種均是先升高后下降，在處理5 d均達最高值，在處理7 d開始下降，在恢復1 d達最低值，與‘英國大紅蕓豆’相比，‘小紅蕓豆’的升高幅度較小，下降幅度較大，并且恢復速率較慢.CAT活性也呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在處理3 d達到最高，5 d開始下降，在恢復1 d達最低值，‘英國大紅蕓豆’處理3 dCAT活性比對照高28%，處理5 d較對照升高21%，在恢復1 d比對照降低24%，而‘小紅蕓豆’在處理3 d較對照升高22%，恢復1 d后達最低值，比對照顯著降低31%，均顯著低于‘英國大紅蕓豆’.在恢復過程中，‘英國大紅蕓豆’在恢復3 d接近處理前水平，而‘小紅蕓豆’恢復速率較慢.從圖3看出，脅迫處理下隨時間延長，APX活性一直呈下降趨勢，處理7 d 2品種均達到最低值，與‘英國大紅蕓豆’，‘小紅蕓豆’的APX活性下降幅度更大.GSH含量的變化趨勢與APX相同，‘小紅蕓豆’在處理7 d顯著低于‘英國大紅蕓豆’，并且恢復速率較慢.

同色柱不同字母表示同一品種間不同處理差異顯著(P<0.05)，S表示‘小紅蕓豆’，L表示大紅蕓豆，T表示低溫弱光處理.Different letters on the same color column indicate significant differences between treatments in the same variety (P<0.05).S indicates small red kidney beans,L indicates red kidney beans,and T indicates low temperature and low light treatment.圖3 低溫弱光脅迫及恢復期大紅蕓豆SOD、GSH、APX、CAT、POD變化Figure 3 Changes of SOD,CAT,GSH,APX in the leaves of red kidney bean under low temperature and weak light stress and recovery period

3 討論

植物的營養(yǎng)生長在很大程度上受到低溫弱光的影響，低溫弱光抑制了日光溫室中茄子株高、莖粗、及葉片的生長[17].本試驗發(fā)現(xiàn)，2個紅蕓豆品種在低溫弱光脅迫下株高、莖粗、葉面積均受到了一定程度的抑制，且隨著時間的延長抑制作用越顯著，在脅迫處理7 d抑制作用尤為明顯，比對照降低幅度更大.與‘小紅蕓豆’相比，脅迫條件下‘英國大紅蕓豆’幼苗的生長速率較‘小紅蕓豆’快，去除脅迫后恢復速率也快，說明低溫弱光脅迫對‘小紅蕓豆’幼苗的傷害較嚴重，生長抑制作用更大.

低溫弱光脅迫下氧自由基隨著時間的延長會不斷積累[18]，而ROS的產(chǎn)生被認為是細胞應激反應和防御途徑的激活[19].本試驗中，隨低溫弱光脅迫處理時間延長，丙二醛、過氧化氫及超氧陰離子含量呈不斷升高的趨勢,其中‘小紅蕓豆’的氧自由基(超氧陰離子、過氧化氫)上升幅度均比‘英國大紅蕓豆’大，丙二醛的積累和增幅也顯著高于‘英國大紅蕓豆’，說明‘英國大紅蕓豆’較‘小紅蕓豆’的抗逆能力更強.SOD、POD、CAT、APX是植物體內(nèi)最主要的抗氧化酶系，其活性變化可以反映植物的抗逆境脅迫能力[20].但對植物在低溫弱光脅迫下主要抗氧化酶活性變化的研究結論存在差異，可能與植物種類及處理有關.有研究表明低溫弱光脅迫下產(chǎn)生的氧自由基能誘導SOD、POD、CAT酶活性的增強[21]，劉偉等[22]研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜幼苗在低溫弱光脅迫初期SOD、POD、CAT活性先上升，隨著脅迫時間的延長其活性逐漸下降.本試驗研究得出SOD、POD、CAT活性在處理期間呈現(xiàn)先升后降的趨勢，氧自由基的不斷積累超過了植物自身清除能力，與劉偉的結論一致.也與周艷紅[23]在黃瓜中的研究結論一致.在處理初期SOD、POD均在5d達到最高值，而CAT在3 d就達到最高值隨后下降,說明CAT對低溫弱光比較敏感.除了SOD、POD、CAT在低溫弱光脅迫下有升高趨勢，APX的活性和GSH含量都呈下降趨勢，且下降幅度隨處理時間延長不斷增大，表明在低溫弱光脅迫下降低了APX活性，隨著氧自由基的不斷積累抑制并破壞了APX及GSH的合成及結構，所以增幅不斷增大，這與前人研究結果一致[24-26].說明植物抗氧化系統(tǒng)中，抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)在協(xié)同起作用.2個紅蕓豆品種的抗氧化酶及抗氧化物質(zhì)變化趨勢雖然相同，但變化幅度不同，在脅迫初期‘英國大紅蕓豆’的SOD、CAT、POD上升幅度均比‘小紅蕓豆’大，隨處理時間延長，‘英國大紅蕓豆’的下降幅度也比‘小紅蕓豆’小，并且恢復速率也較快，‘小紅蕓豆’的APX及GSH在脅迫下下降幅度比‘英國大紅蕓豆’大，并且恢復速率較慢.說明在低溫弱光脅迫下，‘英國大紅蕓豆’能保持較高的抗氧化酶及抗氧化物質(zhì)的活性.

低溫弱光脅迫下植物葉片葉綠素含量不僅直接關系著植物的光合同化過程，而且也是衡量植物耐低溫弱光性的重要生理指標之一[27-29].本試驗發(fā)現(xiàn)，低溫弱光脅迫下紅蕓豆幼苗的葉綠素含量(Chla、Chlb、總葉綠素)均呈下降趨勢，但‘小紅蕓豆’的下降幅度比‘英國大紅蕓豆’更顯著，并且恢復速率較慢.葉綠素在光合作用中有吸收傳遞轉(zhuǎn)換光能的作用，其含量的大小直接影響植物光合作用的強弱，由此可知在低溫弱光脅迫下‘英國大紅蕓豆’比‘小紅蕓豆’有更好的捕獲光能和利用光能的能力.光抑制是植物普遍存在的現(xiàn)象，發(fā)生光抑制時過剩的光能會對光合機構造成傷害，從而使Fv/Fm下降[30-32].本試驗中低溫弱光脅迫下紅蕓豆的Fv/Fm均呈下降趨勢，并且隨著脅迫時間的延長下降幅度不斷增大，但‘小紅蕓豆’下降幅度更大，這與葉綠素含量下降的結果相一致.說明低溫弱光對‘小紅蕓豆’的葉綠素含量及光合機構傷害較大，而對‘英國大紅蕓豆’則傷害較輕，并且恢復速率較快，表明后者具有較強的抗低溫弱光的能力.

4 結論

綜上所述，低溫弱光脅迫會抑制紅蕓豆幼苗的生長，葉綠素含量降低.由于活性氧氧的積累誘導了紅蕓豆葉片中SOD、POD和CAT活性的升高，但隨著脅迫處理時間的延長SOD、POD、CAT活性下降，而APX活性、GSH含量一直呈下降趨勢，在恢復期間SOD、POD、CAT、APX的活性及GSH含量均逐漸上升，說明抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)協(xié)同清除自由基，并在恢復期間MDA、H2O2、O2-含量不斷降低，短時低溫弱光脅迫沒有對紅蕓豆抗氧化系統(tǒng)造成不可逆?zhèn)?，‘英國大紅蕓豆’比‘小紅蕓豆’具有較強的抗氧化脅迫能力.低溫弱光脅迫對‘小紅蕓豆’PSⅡ的光抑制作用更為顯著，然而在恢復期間2個紅蕓豆品種均能恢復到接近正常水平，但‘小紅蕓豆’恢復速率較慢，說明低溫弱光脅迫沒有對紅蕓豆光合機構及葉綠素合成造成不可逆?zhèn)?‘英國大紅蕓豆’比‘小紅蕓豆’具有更強的抗低溫弱光的能力，日光溫室栽培建議選用‘英國大紅蕓豆’作為栽培品種，并且在連綿陰雨天氣或冬春季時，應在7 d時及時補光增溫，否則造成更嚴重的傷害甚至死亡.