陳穎，鄭圣晗，孔令琳，朱鵬飛，吳允，郭其新，陳國(guó)宏，常國(guó)斌

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

1961年Schierman和Nordskog將雞的B基因座定義為主要組織相容性復(fù)合體( major histocompatibility complex，MHC)，由BF/BL、BG區(qū)域和Y區(qū)組成.BF/BL區(qū)域含有典型的MHC基因，BG區(qū)域決定紅細(xì)胞抗原，這兩個(gè)區(qū)域共同組成MHC的1個(gè)區(qū)域；Y區(qū)又稱為遺傳不連鎖基因簇Y(restriction fragment polymorphism-Y， Rfp-Y)，單獨(dú)為1個(gè)區(qū)域.92 kb的BF/BL核心區(qū)域共有19個(gè)基因，其中包括了BTN1(B-butyrophilin 1)基因[1-4].BTN1編碼E3泛素蛋白連接酶TRIM39，而E3泛素蛋白連接酶是一個(gè)蛋白大家族，根據(jù)結(jié)構(gòu)不同主要可分為HECT(homologous to E6-APC terminus)結(jié)構(gòu)域、Ring結(jié)構(gòu)域和U-box結(jié)構(gòu)域等蛋白家族[5-7].在現(xiàn)有的關(guān)于腫瘤細(xì)胞生物學(xué)的研究中，發(fā)現(xiàn)E3泛素蛋白連接酶具有調(diào)控細(xì)胞凋亡、增殖及周期等功能.例如，E3泛素蛋白鏈接酶中的CHIP、BARD1/BRCA1、FBW7、Pirh2和WWP2在卵巢癌中均有抑制癌基因的作用[5].目前人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TRIM39家族的蛋白成員已經(jīng)達(dá)到65個(gè)左右，從已有的報(bào)道中可知這個(gè)家族的重要性，這些蛋白與癌癥、遺傳性疾病以及神經(jīng)系統(tǒng)異常等都有著密切的關(guān)系.例如先天性的opitz-G綜合征與MID1基因的突變有著密切的關(guān)系；RFP與RET酪氨酸蛋白激酶結(jié)合形成致瘤性復(fù)合體參與腫瘤的形成.盡管這些蛋白發(fā)揮功能的具體機(jī)制目前還不清楚，但研究發(fā)現(xiàn)TRIM39家族成員在蛋白泛素化過程中發(fā)揮重要的功能[7-10].

至今尚無關(guān)于雞BTN1基因的研究報(bào)道，尚不了解不同品種雞BTN1基因之間的序列差異、候選抗病SNPs(單核苷酸多態(tài)性)位點(diǎn)以及InDels(插入和缺失).本研究對(duì)25個(gè)品種雞進(jìn)行目標(biāo)序列捕獲測(cè)序，并以NCBI上Gallus gallus(GG,Gene ID:693259)BTN1基因序列為參考，為探明國(guó)內(nèi)外雞品種之間BTN1 基因序列差異以及利用該基因的候選抗病SNPs位點(diǎn)和InDels為抗病育種提供參考依據(jù).

1 材料與方法

本研究對(duì)25個(gè)品種雞進(jìn)行目標(biāo)序列捕獲測(cè)序，‘仙居雞(XJ)’‘大骨雞(DG)’‘茶花雞(CH)’‘河南斗雞(DJ)’‘藏雞(ZJ)’‘白耳黃雞(BE)’‘泰和烏骨雞(WG)’‘固始雞(GS)’‘狼山雞(LS)’‘蕭山雞(XS)’‘鹿苑雞(LU)’‘北京油雞(BY)’這12個(gè)地方品種雞來自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所的國(guó)家地方禽種資源基因庫(kù).另外，‘安卡紅雞(AK)’‘羅斯雞(RS)’‘如皋黃雞(RG)’‘雪山草雞(XC)’‘文昌雞(WC)’‘隱性白羽肉雞(YB)’‘太湖雞(TH)’‘溧陽(yáng)雞(LY)’‘東鄉(xiāng)綠殼蛋雞(LD)’‘來航雞(LH)’‘青腳麻雞(QM)’以及‘廣西黃雞(GXH)’這12個(gè)品種雞來自揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院遺傳資源實(shí)驗(yàn)室的禽種資源基因庫(kù)，‘紅色原雞(HY)’亞種來自云南省野生動(dòng)物救護(hù)中心[11].

采集翅靜脈血，用酚仿法提取血液基因組DNA.每個(gè)品種的10個(gè)DNA樣混池送深圳華大基因公司進(jìn)行目標(biāo)序列捕獲測(cè)序.利用MEGA6.06軟件將測(cè)序數(shù)據(jù)與參考序列進(jìn)行比對(duì)，分析Intron、Exon的SNPs、InDels各個(gè)品種間的變異規(guī)律.各個(gè)品種雞BTN1基因的Exon和Intron起始位點(diǎn)、終止位點(diǎn)與參考序列一致.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種雞BTN1基因的SNPs和InDels分析

為了探究我國(guó)不同地方品種雞BTN1基因的序列差異，查閱NCBI上Gallus gallus(GG,Gene ID:693259)的BTN1基因序列，以此為參照.通過對(duì)比可知，25個(gè)品種雞中BTN1基因Exon上共發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNPs，無InDels，Intron上有70個(gè)SNPs和71個(gè)InDels.對(duì)不同品種雞BTN1基因的Intron做SNPs分析(表1).Intron上的SNPs主要發(fā)生在Intron13、Intron18、Intron22和Intron23上，而InDels在大多數(shù)Intron上均有發(fā)生，但主要發(fā)生在Intron10和Intron13上，分別為4個(gè)插入和2個(gè)缺失、4個(gè)插入和3個(gè)缺失.其余Exon、Intron并無SNPs、InDels變化.

對(duì)25個(gè)品種雞BTN1基因的Exon進(jìn)行SNPs位點(diǎn)分析，Exon的SNPs位點(diǎn)主要位于Exon5、Exon17上(表2).如‘皋雞’‘泰和烏骨雞’‘紅色原雞’‘蕭山雞’‘青腳麻雞’‘太湖雞’和‘來航雞’共同的錯(cuò)義突變均位于Exon5上.‘固始雞’‘泰和烏骨雞’‘雪山草雞’‘蕭山雞’‘安卡雞’‘太湖雞’‘廣西黃雞’‘白耳雞’和‘來航雞’的共同的錯(cuò)義突變均位于Exon17上.表2中的‘泰和烏骨雞’‘蕭山雞’‘太湖雞’和‘來航雞’有2個(gè)SNPs位點(diǎn)，其余品種雞只有1個(gè)SNPs位點(diǎn)，而對(duì)于25個(gè)品種雞的其他品種并無SNPs位點(diǎn).

表1 Exon和Intron核酸變化表

堿基突變個(gè)數(shù)為在25個(gè)品種雞上突變種類個(gè)數(shù)，D表示堿基缺失，I表示插入.

The number of base mutations indicates the number of mutations in 25 chicken breeds.D and I represent base deletions and insertions,respectively.

2.2 不同品種雞BTN1基因系統(tǒng)聚類分析

利用MEGA6.06對(duì)26個(gè)品種雞的BTN1基因進(jìn)行比較分析，以探究BTN1基因在不同品種雞上的同源性.選用Construct/Test Neighbor-Joining Tree(NJ)方法構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap的值設(shè)置成1 000[12].

由圖1可知，26個(gè)品種雞中‘藏雞’和‘茶花雞’親緣關(guān)系較近；其次，‘安卡紅雞’和‘白耳黃雞’親緣關(guān)系相近；‘如皋黃雞’和‘來航雞’親緣關(guān)系相近，單獨(dú)為一類.

前表示突變前的堿基或氨基酸；>后表示突變后的堿基或氨基酸；數(shù)字表示發(fā)生突變的位點(diǎn).

before that the base or amino acid before mutation；>after that the base or amino acid after mutation;Numbers indicate the site of the mutation.

圖1 不同品種雞NJ進(jìn)化樹分析Figure 1 NJ phylogenetic tree analysis of different breeds

3 討論

BTN1基因全長(zhǎng)14 225 bp，位于雞的16號(hào)染色體上，處于139 473～153 697的位置，包含了38個(gè)Exon和37個(gè)Intron.BTN1基因的序列較長(zhǎng)，但是每個(gè)Exon只有20 bp，38個(gè)Exon只有兩個(gè)有SNPs位點(diǎn)，而37個(gè)Intron中的SNPs或者InDels多達(dá)70個(gè)，表明BTN1上的Exon多態(tài)性低，Intron具有豐富的多態(tài)性.研究表明基因中的Intron雖然不參與蛋白質(zhì)的編碼，但是Intron對(duì)于蛋白質(zhì)的調(diào)控和編碼起到了重要的作用[13].試驗(yàn)結(jié)果顯示SNPs和InDels數(shù)量在10個(gè)以上的Intron有Intron10、Intron13、Intron18、Intron22和Intron23，在它們之間還有一個(gè)有SNPs的Exon17，可以看出大部分的SNPs和InDels位點(diǎn)都是位于 Intron10和Intron23之間，即144 081～148 224之間，說明該區(qū)域具有豐富的多態(tài)性.

系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建具有多樣性，但是并無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，系統(tǒng)進(jìn)化樹不同遺傳計(jì)算方法也不一樣.在科學(xué)研究中，可以根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行選擇.本研究為了方便、直觀地解釋不同雞品種之間的親緣關(guān)系，選用最常用的NJ樹，并通過Bootstrap一致性處理[12].有研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)地方品種雞的雜合度值要明顯高于歐洲地區(qū)的部分地方品種，并且我國(guó)許多地方家禽品種與其相比具有抗病力高、免疫能力強(qiáng)等特點(diǎn)[14-16].本研究中‘羅斯雞’‘隱性白羽肉雞’‘來航雞’和‘安卡紅雞’屬于國(guó)外品種，其余為我國(guó)地方品種.隱性白羽肉雞與羅斯雞作為主要的商業(yè)用雞，兩者均存在抗病力差的問題，尤其是先天免疫性能相對(duì)較差.通過序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，‘羅斯雞’與‘隱性白羽肉雞’在BTN1的外顯子上均無SNPs位點(diǎn)，這可能對(duì)于選育抗病品系具有重要意義.王存波等[17]研究發(fā)現(xiàn)‘安卡紅雞’的抗病性較強(qiáng).在本研究中，與羅斯雞和隱性白羽肉雞相比，‘安卡紅雞’和‘來航雞’在BTN1的Exon17上有一個(gè)錯(cuò)義突變的SNPs位點(diǎn)，這可能是它們之間抗病力存在差異的原因之一.‘廣西黃雞’‘太湖雞’‘泰和烏骨雞’‘雪山草雞’和‘蕭山雞’等具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗病力強(qiáng)等優(yōu)良特性的品種在Exon17上均存在同一SNPs位點(diǎn).同時(shí)，與抗病性較強(qiáng)的‘安卡紅雞’‘雪山草雞’相比，‘來航雞’在BTN1的Exon5上存在一個(gè)錯(cuò)義突變的SNPs位點(diǎn).

我國(guó)地方品種雞分布區(qū)域廣泛，同一省份地方雞種繁多，例如江蘇省內(nèi)的雞品種就有‘狼山雞’‘鹿苑雞’‘溧陽(yáng)雞’‘太湖雞’和‘如皋黃雞’，但是在本研究中被分為3個(gè)大類，表明這5個(gè)品種雞之間的同源性較低，親緣關(guān)系較遠(yuǎn).其他區(qū)域的品種雞也不聚在同一大類，且大部分品種雞擁有良好的生產(chǎn)性能和高抗病性，表明我國(guó)的地方品種雞之間的同源性較低，很可能與我國(guó)地方品種雞多樣的生態(tài)類型以及豐富的遺傳多樣性有關(guān).‘太湖雞’‘泰和烏骨雞’和‘蕭山雞’聚為一類，表明親緣關(guān)系相近，且均具有適應(yīng)性強(qiáng)，耐粗飼等優(yōu)良特點(diǎn).總體來說，相對(duì)于國(guó)外品種雞，我國(guó)地方品種雞的BTN1基因遺傳變異更多樣，反映了我國(guó)地方品種雞具有豐富的先天免疫基因資源.

綜上所述，BTN1基因的Exon17和Exon5上SNPs位點(diǎn)對(duì)抗病性具有一定意義，但具體功能還有待研究.在以后的研究中，我們可以充分利用這些遺傳資源，以便探索我國(guó)優(yōu)良地方品種雞免疫性能的遺傳機(jī)制，為雞抗病育種奠定基礎(chǔ).