宋炎博,王捍東

(1．揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009； 2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人畜共患病防控協(xié)同中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

青蒿琥酯(Artesunate，AS)，化學(xué)名為二氫青蒿素-1,2-α-琥珀酸單酯，是具有倍半萜結(jié)構(gòu)的抗瘧藥青蒿素的衍生物[1]，臨床上用于搶救和治療腦型瘧疾和惡性瘧疾。青蒿琥酯對(duì)剛地弓形蟲(chóng)和其他致病頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)具有良好的殺滅作用，只需要幾微摩爾用量就能有效殺滅弓形蟲(chóng)[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯除了具有良好的抗瘧疾效果，還有顯著的抑制腫瘤細(xì)胞作用，且不易產(chǎn)生耐藥性[3]。此外，青蒿琥酯還具有抗真菌、細(xì)菌[4]、病毒[5,6]等效果。青蒿琥酯具有良好的生物學(xué)活性，同時(shí)也具有一定的毒副作用。White TE等通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明青蒿琥酯具有明顯的胚胎毒性[7]。本研究通過(guò)對(duì)雞胚注射和雛雞口服不同劑量的青蒿琥酯，探討青蒿琥酯急性毒性以及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要藥物及試驗(yàn)器材

青蒿琥酯(桂林南藥股份有限公司，批號(hào)：H10930195)；溶劑(碳酸氫鈉注射液)為澄明，無(wú)色液體；溶劑(氯化鈉注射液)為澄明，無(wú)色液體；1mL無(wú)菌一次性注射器(江蘇長(zhǎng)城醫(yī)療器械有限公司，批號(hào)：20150401，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：YZB/國(guó)1794-2011)；打孔器；針筒式濾膜細(xì)菌過(guò)濾器(島津技術(shù)上海商貿(mào)有限公司，批次：130922052，孔徑：0.22μm)；碘酊；酒精棉球；中性福爾馬林溶液；萬(wàn)盛微電腦全自動(dòng)漢顯孵化機(jī)(南京萬(wàn)盛孵化設(shè)備有限公司，型號(hào)：WSC-4型，325枚)；生物安全柜(蘇州凈化，SW-CJ-2F雙人雙面)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

海蘭白種蛋購(gòu)自江蘇省儀征市大巷永康種雞場(chǎng)，9日齡。

雛雞：由江蘇省儀征市大巷永康種雞場(chǎng)購(gòu)回的海蘭白種蛋經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室自行孵化出來(lái)(孵化過(guò)程參照上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心起草的標(biāo)準(zhǔn)：DB31/T305-2014)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1青蒿琥酯對(duì)雞胚急性毒性預(yù)試驗(yàn)

1.3.2青蒿琥酯對(duì)雞胚急性毒性正式試驗(yàn)

種蛋從貯藏室拿出后,在孵化箱內(nèi)恒溫38℃，60%濕度下平衡4～12h。在注射前，先用碘酊涂擦氣室，然后用75%的酒精涂擦氣室脫碘。在靠近氣室1.5cm處的蛋殼上開(kāi)一小孔。試驗(yàn)前通過(guò)反復(fù)毒理預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出100%致死劑量和0%致死劑量，最終得出最大致死劑量為125μg，最小致死劑量為50μg，因此設(shè)四個(gè)劑量梯度：125μg，100μg，75μg，50μg。然后，將不同劑量的青蒿琥酯注射到雞胚尿囊腔0.1mL，置于38℃孵化箱內(nèi)，每天照雞胚一次，觀(guān)察存活情況，將死胚揀出，計(jì)算死亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。用簡(jiǎn)化寇氏法計(jì)算半數(shù)致死量。LD50計(jì)算公式[8]: LD50= lg-1[ Xm-i(P-0.5)],式中, Xm為最大劑量的對(duì)數(shù)值, P 為各劑量組死亡率, i 為相鄰對(duì)數(shù)劑量之差。

1.3.3雛雞毒性研究

選取體重相近的3日齡雛雞，分組，每組6只，設(shè)3個(gè)劑量梯度：40mg/kg，20mg/kg，10mg/kg，空白對(duì)照組不作任何處理。通過(guò)口服一次給藥, 給藥后觀(guān)察4d，記錄各組雛雞的體重變化情況。剖殺各組雛雞，取肝臟放入中性福爾馬林固定，HE染色，鏡下觀(guān)察組織結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量青蒿琥酯對(duì)雞胚影響

圖1 雞胚照蛋及雞胚病變圖

由圖1可以看出，125μg青蒿琥酯注射雞胚尿囊腔后雞胚血管全部脫落，雞胚胎全身出血?？瞻讓?duì)照組雞胚血管完好，血管清晰，雞胚胎無(wú)任何病變。

2.2 青蒿琥酯在雞胚上急性毒性試驗(yàn)

∑p=1.3333

根據(jù)改良寇氏法，LD50=log-1[Xm-i(∑p-0.5)]

=log-1[0.3979-0.0739(1.3333-0.5)]

=log-10.3363=2.17mg/kg

可信限的求法: X=log-1(lgLD50±1.96*SX50)

=10(lg2.17±1.96*0.0174)

=2.01mg/kg～2.38mg/kg

由計(jì)算結(jié)果可得青蒿琥酯LD50為2.17mg/kg，換算成劑量為108.5μg，95%可信限為100.5μg～119μg，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

表1 不同劑量青蒿琥酯注射液注射雞胚死亡率統(tǒng)計(jì)(n=6)

注：按照改良寇氏計(jì)算方法，死亡率用小數(shù)表示

2.3 不同劑量青蒿琥酯對(duì)雛雞生長(zhǎng)影響

表2 用藥前后雛雞平均體重變化(n=6) g

用藥前，各組雛雞之間體重不具備顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明各組體重相當(dāng)。灌藥第1天，高劑量組與其他各組差異顯著(P<0.05)，溶劑對(duì)照組、中等劑量組、低劑量組與對(duì)照組無(wú)差異(P>0.05)；第2天高劑量組與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，用藥組之間差異顯著(P<0.05)，溶劑對(duì)照組與空白組無(wú)差異(P>0.05)，用藥組與空白組差異極顯著(P<0.01)；第3天高劑量組與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，高劑量組與中等劑量組和低劑量組間差異顯著(P<0.05)；第4天高劑量組與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，高劑量組與中等劑量組和低劑量組間差異顯著(P<0.05)。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明，高劑量青蒿琥酯能明顯抑制雛雞生長(zhǎng)，隨著劑量降低，青蒿琥酯抑制生長(zhǎng)效應(yīng)減輕，溶劑對(duì)照組(橄欖油)對(duì)雛雞生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用，與空白對(duì)照組相比，橄欖油組生長(zhǎng)速度稍快。

如表3所示，40 mg/kg組肝體比顯著低于其他四組(P<0.05)，溶劑對(duì)照組與空白對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明溶劑對(duì)雛雞肝臟無(wú)明顯影響。高劑量組肝體比與中低劑量組之間有顯著差異(P<0.05)，中等劑量組肝體比與低劑量組之間差異顯著(P<0.05)，以上數(shù)據(jù)說(shuō)明高劑量青蒿琥酯對(duì)肝臟的損傷較其他組嚴(yán)重，溶劑對(duì)照組對(duì)肝臟基本無(wú)損傷。

表3 各用藥組雛雞肝體比

2.4 雛雞肝組織HE染色石蠟切片

由圖2可以很明顯地看出空白組與溶劑對(duì)照組肝細(xì)胞排列整齊，肝索明顯。高劑量組肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，中等劑量組出現(xiàn)部分結(jié)構(gòu)損壞，低劑量組無(wú)明顯病變。結(jié)果表明，溶劑對(duì)肝臟沒(méi)有損傷，高劑量青蒿琥酯能明顯引起肝損傷。

圖2 各組雛雞肝臟H.E染色石蠟切片(40x)

3 討論

目前，青蒿琥酯在雞胚以及雛雞上的毒性研究幾乎沒(méi)有報(bào)道。本研究從雞胚與雛雞兩方面研究青蒿琥酯毒性，研究結(jié)果表明：青蒿琥酯在雞胚上的LD50為2.17 mg/kg，40 mg/kg能明顯抑制雛雞生長(zhǎng)。因此本研究結(jié)果揭示了青蒿琥酯存在胚胎毒性。

靳永剛等[9]用硫代巴比妥酸法測(cè)定靜脈注射該藥后大白鼠的肝、腸組織內(nèi)丙二醛含量的變化，結(jié)果表明青蒿琥酯在體內(nèi)、體外代謝過(guò)程中均可產(chǎn)生自由基，并可引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化和組織損傷。由此認(rèn)為青蒿琥酯毒性可能是在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的大量自由基作用于細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。青蒿琥酯可以導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能障礙，從而引起ROS代謝障礙，發(fā)生氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡[10]。有關(guān)研究表明，高劑量 Art(100～300 mg/kg,靜注)能引起人和動(dòng)物造血系統(tǒng)、肝臟和遺傳毒性[11]。婁小娥等[12]的研究結(jié)果表明,大鼠在妊娠6～10 d給予Art,對(duì)胚胎具有顯著的毒性作用,隨劑量增高,吸收胎和死胎率明顯增加。每日7.5mg/kg劑量組吸收胎率比對(duì)照組顯著升高。細(xì)胞凋亡通常與線(xiàn)粒體損傷有關(guān)，李天星等[13]發(fā)現(xiàn)動(dòng)物胚胎肝造血細(xì)胞比骨髓細(xì)胞對(duì)此藥物更為敏感。

綜上所述，Art結(jié)構(gòu)中的過(guò)氧橋鍵不僅是其抗瘧活性的重要基團(tuán)，也是其毒性作用的原因之一[14]。青蒿琥酯對(duì)雞胚急性毒性以及雛雞毒性的作用機(jī)理尚不清楚，有待于今后深入研究。