宋 浩，蔣增海，薛 杰，楊 鳳，楊龍飛

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)為豬流行性腹瀉病(porcine epidemic diarrhea，PED)的病原，屬于冠狀病毒科中的冠狀病毒屬，單股正鏈RNA病毒[1]。PED的主要臨床癥狀為嘔吐、脫水和腹瀉，是一種急性、高度接觸性腸道傳染病。各種年齡的豬均易感，但仔豬危害更嚴(yán)重，發(fā)病率可達(dá)100%。自2010年以來(lái)，PEDV的流行區(qū)域逐漸擴(kuò)大，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。

PEDV只有一個(gè)血清型，存在4種結(jié)構(gòu)蛋白：S蛋白、M蛋白、sM蛋白和N蛋白，還有一個(gè)位于sM蛋白和S蛋白之間的ORF3，主要編碼一個(gè)功能未知的多肽性片段[4]。S蛋白由1383個(gè)氨基酸組成，劃分為S1區(qū)和S2區(qū)，并且易發(fā)生變異，因此S蛋白經(jīng)常被用來(lái)研究國(guó)內(nèi)外不同毒株之間的親緣性關(guān)系[5]。

2018年3月，河南省焦作市某豬場(chǎng)飼養(yǎng)母豬80多頭，母豬所產(chǎn)15窩仔豬幾乎全部發(fā)病死亡，出生后1～3日齡發(fā)病最嚴(yán)重，臨床表現(xiàn)癥狀為嘔吐、拉稀、吐奶和排黃色水樣糞便。剖檢發(fā)病仔豬，觀(guān)察到小腸充血,腸管顯著擴(kuò)張，腸管內(nèi)充滿(mǎn)透明液體。內(nèi)容物稀薄、呈黃色。初步懷疑為流行性腹瀉病毒感染，取腸內(nèi)容物進(jìn)行豬流行性腹瀉病毒RT-PCR分析檢測(cè)，確診為流行性腹瀉病毒陽(yáng)性。經(jīng)了解，該豬場(chǎng)進(jìn)行過(guò)流行性腹瀉疫苗預(yù)防，具體免疫程序：使用傳染性胃腸炎-流行性腹瀉二聯(lián)活疫苗，冬季所有豬只普防，懷孕母豬在臨產(chǎn)前15d再次免疫。據(jù)調(diào)查該二聯(lián)疫苗由經(jīng)典毒株制備而成。為了分析疫苗免疫失敗原因，將擴(kuò)增的部分S基因產(chǎn)物送基因公司測(cè)序，然后將測(cè)序結(jié)果與其他毒株進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，研究PEDV毒株之間的親緣性。

1 材料與方法

1.1 病料

疑似豬流行性腹瀉病豬小腸內(nèi)容物，采集于河南省焦作市某豬場(chǎng)1周齡以后死亡的仔豬。

1.2 主要試劑

Trigol總RNA提取試劑盒(購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。一步法高效RT-PCR試劑盒(購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司)。DNA Marker(博邁德生物公司)。

1.3 病料處理

取一段豬小腸置于研缽中，剪碎并充分研磨，加入一定PBS(100mg加入200μL)，混勻，反復(fù)凍融2次,然后加入1mL Trigol,室溫放置5min，使其充分裂解，之后放入-70℃冰箱保存或直接提取RNA。

1.4 病毒總RNA提取

根據(jù)Trigol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，取1.3加入Trigol后的組織，12000rpm,離心5min，棄去沉淀，按200μL氯仿/mL Trigol比例加入氯仿，振蕩混勻，室溫放置15min(禁用漩渦振蕩器)。之后放入離心機(jī)，4℃12000rpm離心15min,吸取上層水相，轉(zhuǎn)移到另一EP管中，加入上清量0.7倍體積的異丙醇，室溫放置15min,4℃12000rpm離心5min,棄上清。室溫晾干5～10min,之后加入50μL ddH2O或TE buffer,放置5min,-20℃保存以用于RT-PCR檢測(cè)。

1.5 引物設(shè)計(jì)和檢測(cè)

參照GeneBank PEDV YN144S基因序列(登錄號(hào)KT021232.1)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物PED-S1-P1、PED-S1-P2，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，擴(kuò)增目的片段大小為969bp。

PED-S1-P1:5’-TCGCCATGGGGAACTGCCATTCAGCGTAT-3’;

PED-S1-P2:5’-CTAGGATCCCGTGGGTGCAATCTTGACTT-3’。

1.6 病毒樣品RT-PCR檢測(cè)

本研究采用一步法高效RT-PCR試劑盒檢測(cè)，總反應(yīng)體系25μL：One Step Enzyme Mix1μL、2×One Step Mix (Dye Plus)12.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、RNA模板3μL、Rnase free ddH2O 補(bǔ)足至終體積25μL。PCR反應(yīng)條件為：50℃30min、94℃預(yù)變性2min,之后進(jìn)入循環(huán)94℃30s、退火溫度62℃30s、72℃30s，34個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物7μL，在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)中觀(guān)看有無(wú)特異性陽(yáng)性條帶，陽(yáng)性條帶送至生工測(cè)序。

1.7 部分S基因序列分析

將獲得的部分S基因與在GenBank下載的22株P(guān)EDV毒株(表1)，利用DNAstar軟件進(jìn)行同源性分析并用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

表1 參考毒株來(lái)源及名稱(chēng)

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

取產(chǎn)物7 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，所得結(jié)果與預(yù)計(jì)擴(kuò)增大小一致，目的片段為969bp(圖1)。

圖1 樣品PEDV RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 S基因序列同源性分析

檢測(cè)毒株與2016年分離的CH-SCAY-2014野毒株同源性最高，為99.1%；與經(jīng)典毒株CV777、韓國(guó)分離毒株DR13、Chinju99之間的同源性分別為94.8%、96.6%、92.9%；與2014-2017年GenBank登錄的毒株之間的同源性較高，為98.1%～99.1%(圖2)。

從進(jìn)化樹(shù)(圖3)可以看出，分為2個(gè)分支：G1和G2。G1包括2011年福建毒株(XM1-2)、2016-2017年各地分離的毒株(XY1S、PC22A等)，其中檢測(cè)毒株與XM1-2毒株親緣性不如其它毒株。G2包括經(jīng)典毒株CV777、韓國(guó)毒株DR13、Chinju99。

3 討論

豬流行性腹瀉在世界各地廣泛流行，如美國(guó)、日本、中國(guó)、加拿大等國(guó)家都存在PED疫情[6-7]。據(jù)了解，近幾年河南省的豬場(chǎng)不斷發(fā)生豬流行性腹瀉感染[8-9]。由于豬流行性腹瀉與傳染性胃腸炎臨床癥狀相似，僅憑病理檢查不容易鑒別，因此，常常通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，如RT-PCR、EILSA等來(lái)檢測(cè)。其中RT-PCR敏感性更高、特異性更強(qiáng)，已成為病毒檢測(cè)技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的方法之一[10]。本試驗(yàn)采用RT-PCR法檢測(cè)樣品，結(jié)果為PEDV陽(yáng)性，并經(jīng)測(cè)序，將所測(cè)得序列進(jìn)行序列分析。

經(jīng)過(guò)查閱，2015-2016年李舜等[11]對(duì)廣東省分離的16株毒株進(jìn)行了S基因序列分析，結(jié)果顯示其中15株毒株與經(jīng)典株CV777親緣性較遠(yuǎn)，同源性87.6%～88.2%，表明廣東省目前流行毒株存在基因變異。吳旺霞等[12]對(duì)浙江省12株流行毒株的S基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與經(jīng)典毒株CV777同源性為93.3%～94.9%，說(shuō)明浙江地區(qū)流行毒株也發(fā)生了變異。本試驗(yàn)所分離的PEDV流行毒株與經(jīng)典株CV777同源性為94.8%，親緣性較遠(yuǎn)，存在變異，與上述研究結(jié)果一致，這可能是該發(fā)病豬場(chǎng)疫苗免疫失敗的重要原因之一。對(duì)于變異毒株的出現(xiàn)，傳統(tǒng)PEDV疫苗可能無(wú)法保護(hù)豬群，我們建議豬場(chǎng)使用變異毒株疫苗來(lái)預(yù)防該病。

圖2 PEDV不同毒株S基因遺傳進(jìn)化樹(shù)

圖3 PEDV不同毒株同源性比較結(jié)果

除了接種疫苗預(yù)防，我們還可以采用生物安全措施來(lái)預(yù)防該病。如：豬場(chǎng)及時(shí)干燥通風(fēng)，定期對(duì)地面、設(shè)施、用具進(jìn)行消毒，場(chǎng)區(qū)內(nèi)的水槽、料槽定期清潔以及飼料保持干燥，糞便及時(shí)清理等。發(fā)病以后，應(yīng)及時(shí)對(duì)發(fā)病豬場(chǎng)進(jìn)行隔離消毒,隔離發(fā)病豬只, 及時(shí)對(duì)感染豬舍地面、用具等進(jìn)行消毒,禁止相關(guān)人員進(jìn)入正常豬舍,以避免交叉感染[13]。治療方面，可以使用生物制品療法：注射高免血清、干擾素等；或者中獸醫(yī)學(xué)療法：如徐國(guó)棟等[14]介紹，對(duì)不同地區(qū)的PED感染豬使用冠能注射液進(jìn)行治療，總治愈率為98%，效果滿(mǎn)意。