朱劍鋒，祁姣姣，靳改改，曾凱斌，庫(kù)靜雅，高小菲，馬澤誠(chéng)，王計(jì)偉，胡文鋒,*

（1.生物源生物技術(shù)股份有限公司，廣東 深圳 518118；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州 510642；3.安佑集團(tuán)研究院微生物研究所，江蘇 太倉(cāng) 215400）

有機(jī)廢棄物主要包括餐廚垃圾、畜禽糞便、植物殘余物、動(dòng)物尸體等，含有大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如果處理不當(dāng)，極易腐爛變質(zhì)，散發(fā)惡臭，傳播細(xì)菌和病毒，破壞生態(tài)環(huán)境，造成污染[1-2]。利用微生物發(fā)酵將有機(jī)廢物轉(zhuǎn)化為廉價(jià)、營(yíng)養(yǎng)豐富、更易吸收的蛋白質(zhì)飼料，不僅能夠提高資源的利用效率，而且對(duì)消除環(huán)境污染、改善生態(tài)環(huán)境都具有重要意義[1,3-4]。

目前市售有機(jī)廢棄物發(fā)酵菌種，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)于纖維類含量高的原料如豆渣，多采用霉菌等絲狀真菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵[5-7]。然而，霉菌繁殖時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量菌絲，使發(fā)酵物料固化，這不利于昆蟲等飼喂。另外一些霉菌如用于豆渣發(fā)酵的白地霉，存在安全性爭(zhēng)議[8]。本研究旨在采用乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌、復(fù)合酶等，對(duì)有機(jī)廢棄物進(jìn)行發(fā)酵，以達(dá)到縮短其發(fā)酵時(shí)間、提高酸溶蛋白、還原糖等小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量，利于其儲(chǔ)存，方便和安全飼喂的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑及菌種

10126U纖維素酶，山東澤生生物科技有限公司；餐廚余：由深圳市朗坤生物科技有限公司提供。豆渣：本試驗(yàn)所用的豆渣，是含水量約為73%的新鮮豆渣經(jīng)烘干后，無(wú)菌條件下加入無(wú)菌水得到的，其含水量、物理特性等基本特性與其新鮮狀態(tài)一致。試驗(yàn)所需菌種，均為市售商品化菌粉（布拉迪酵母，2.00×1010cfu·g-1；啤酒酵母，2.00×1010cfu ·g-1；植物乳桿菌，1.00×1011cfu· g-1；鼠李糖乳桿菌，1.00×1011cfu·g-1；干酪乳桿菌，1.00×1011cfu· g-1；地衣芽孢桿菌，1.00×1011cfu ·g-1；枯草芽孢桿菌，1.00×1011cfu·g-1；納豆芽孢桿菌，1.00×1011cfu · g-1）。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

YSQ-LS-SII全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；FE20 pH計(jì)，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；二合一臭味檢測(cè)儀，深圳市沃賽特科技有限公司。K9840自動(dòng)凱式定氮儀，上海還能實(shí)驗(yàn)儀器科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 測(cè)定方法

水分測(cè)定參照GBT6435-2014，還原糖和總糖采用3,5-二硝基水楊酸法，粗蛋白質(zhì)測(cè)定采用凱氏定氮法，具體操作和計(jì)算參照GB/T 6432—1994。粗脂肪測(cè)定參照GBT6433-2006，霉菌總數(shù)測(cè)定參照GBT13092-2006，NH4及H2S通過(guò)臭味檢測(cè)儀自動(dòng)測(cè)定，AS測(cè)定參照GB/T13079-2006，Pb測(cè)定參照GB/T13080-2004。

pH的測(cè)定：每次測(cè)pH前要先把儀器用校準(zhǔn)液校準(zhǔn)，每個(gè)樣品取1 g試樣加99 mL蒸餾水或自來(lái)水，靜置15 min，測(cè)定pH，測(cè)完pH要把儀器的筆插入保護(hù)液中。

酸溶性蛋白含氮量測(cè)定方法：稱取樣品干樣2.00 g，加入15%三氯乙酸（TCA）溶液10 mL，混合均勻，靜置5 min[9]。將溶液定量轉(zhuǎn)移，4 000 r·min-1離心10 min后，取5 mL上清液放入凱氏燒瓶中，采用凱氏定氮法測(cè)定含氮量，具體操作和計(jì)算參照GB/T 6432—1994。

活菌計(jì)數(shù)：取相應(yīng)的試樣,加入帶玻璃珠的10 mL的無(wú)菌水中，200 r·min-1振蕩30 min，為待測(cè)試樣液。采用十倍稀釋法，取3個(gè)適宜稀釋度，分別移取100μL于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基表面（酵母菌采用PDA培養(yǎng)基，乳酸菌采用MRS培養(yǎng)基；芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌，采用LB培養(yǎng)基），用玻璃棒輕輕地將菌懸液均勻地涂抹于培養(yǎng)基表面。芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌于37℃恒溫培養(yǎng)24 h，乳酸菌于30℃培養(yǎng)48 h，酵母菌于28℃培養(yǎng)24 h，取長(zhǎng)有30～300個(gè)菌落的平板計(jì)數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次，同時(shí)做空白對(duì)照。

1.2.2 菌種有效活菌數(shù)的檢測(cè)

菌種有效活菌數(shù)的檢測(cè)見1.2.1活菌計(jì)數(shù)方法。

1.2.3 菌種頡頏作用探究

分別稱取適量菌粉加入無(wú)菌液體培養(yǎng)基中（酵母菌采用PDA培養(yǎng)基，乳酸菌采用MRS培養(yǎng)基，芽孢桿菌采用LB培養(yǎng)基），恒溫培養(yǎng)0.5～1 h。將活化好的菌液，以“口”型劃線于MRS瓊脂平板上（經(jīng)預(yù)試驗(yàn)判定，試驗(yàn)所用菌種均能在MRS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)），34℃恒溫培養(yǎng)，觀察。

1.2.4 菌種初篩試驗(yàn)設(shè)計(jì)

菌種初篩見表1。按表1中的劑量水平配置成相應(yīng)的發(fā)酵專用菌粉。將新鮮餐廚余加入麥麩，調(diào)節(jié)其水分為55%，分別加入各菌粉，攪拌均勻，37℃發(fā)酵15 h，后轉(zhuǎn)移到30℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)發(fā)酵33 h。

另外，將上述菌粉加入少量無(wú)菌水中（含有玻璃珠），37℃，150 r·min-1活化2 h，和豆渣攪拌均勻進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程為37℃，發(fā)酵24 h，后轉(zhuǎn)移到30℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)發(fā)酵24 h。

發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定其pH、NH3、H2S。然后，將其置于65℃烘箱中烘至水分約10%，測(cè)定還原糖、酸溶蛋白含量。

表1 菌種初篩

1.2.5 菌種復(fù)合酶發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計(jì)

上述試驗(yàn)中有機(jī)廢棄物中豆渣沒(méi)有發(fā)酵起來(lái)，下面在投料中加入纖維素酶和木瓜蛋白酶，幫助分解豆渣中的纖維素，為酵母菌和乳酸菌提供更多的能量。采用正交表L32（49）設(shè)計(jì)試驗(yàn)，見表2。發(fā)酵過(guò)程同1.2.4。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.6 發(fā)酵中試試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用麥麩分別調(diào)節(jié)餐廚余水分55%、豆渣水分60%，接入最優(yōu)比例菌粉，豆渣的發(fā)酵過(guò)程為37℃，發(fā)酵24 h，后轉(zhuǎn)移到30℃，的培養(yǎng)箱中繼續(xù)發(fā)酵24 h。餐廚余發(fā)酵過(guò)程為37℃，發(fā)酵15 h，后轉(zhuǎn)移到30℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)發(fā)酵30 h。發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定pH、還原糖、酸溶蛋白、NH3、H2S及霉菌總數(shù)、芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌，大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等菌數(shù)和重金屬（AS、Pb）含量等指標(biāo)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 有機(jī)廢棄物理化指標(biāo)檢測(cè)

餐廚垃圾、豆渣等有機(jī)廢棄物原料常規(guī)主要成分及含量檢測(cè)結(jié)果見表3。

由表3可知，餐廚余和豆渣營(yíng)養(yǎng)豐富，餐廚余粗蛋白質(zhì)含量為37.03%、豆渣粗蛋白質(zhì)含量16.44%；兩者pH均＞5，同時(shí)，兩者含有大量的水分。當(dāng)溫度適宜時(shí)，其會(huì)迅速滋生大量的病菌和臭味，嚴(yán)重污染環(huán)境，存在安全隱患。

2.2 菌種有效活菌數(shù)檢測(cè)

菌種有效活菌數(shù)檢測(cè)結(jié)果見表4。

2.3 菌種頡頏試驗(yàn)結(jié)果

菌種頡頏試驗(yàn)結(jié)果見表5。

由表5可知，植物乳桿菌對(duì)枯草芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌均有微弱的頡頏作用，鼠李糖乳桿菌對(duì)納豆芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌均有頡頏作用。

表3 餐廚垃圾、豆渣等有機(jī)廢棄物原料常規(guī)主要成分及含量

2.4 菌種初篩試驗(yàn)結(jié)果

餐廚余發(fā)酵菌種初篩見表6。

由表6可知，混合菌種發(fā)酵餐廚余試驗(yàn)中，沒(méi)有酵母菌的組合，均會(huì)長(zhǎng)霉。長(zhǎng)霉的組合，其發(fā)酵結(jié)束后還原糖含量相對(duì)其他組均高。但是長(zhǎng)霉后，原料結(jié)塊，對(duì)于養(yǎng)殖是不利的。提高其還原糖的含量可以通過(guò)加入纖維素酶來(lái)達(dá)到目的。

豆渣發(fā)酵菌種初篩結(jié)果見表7。

表4 菌種有效活菌數(shù) cfu·g-1

由表7可知，混合菌種發(fā)酵豆渣實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵結(jié)束后，各組pH均＞5.0，顯示沒(méi)有發(fā)酵成功，根本原因是豆渣原料中含有大量的纖維、小分子還原糖含量過(guò)低（0.3365%）。芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌不能良好生長(zhǎng)。故可以通過(guò)外加酶來(lái)達(dá)到發(fā)酵的目的。

2.5 加酶復(fù)合菌發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

加酶復(fù)合菌發(fā)酵餐廚余和豆渣結(jié)果見表8、9。

最優(yōu)組合確定標(biāo)準(zhǔn)為，發(fā)酵結(jié)束后，各廢棄物的 4.0≤pH≤4.5，NH3＜10 ppm、H2S＜3 ppm，無(wú)異味，并具有較高的還原糖和酸溶蛋白含量。依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)分析如下，由表8可知，綜合考慮加酶復(fù)合菌發(fā)酵餐廚余結(jié)果，6號(hào)、9號(hào)、11號(hào)、12號(hào)、15號(hào)、16號(hào)、21號(hào)、22號(hào)、24號(hào)、25號(hào)、26號(hào)、27號(hào)、28號(hào)等組合，均為較優(yōu)組合。9號(hào)、16號(hào)、21號(hào)、27號(hào)、28號(hào)為最優(yōu)組合。由表9可知，綜合考慮加酶復(fù)合菌發(fā)酵豆渣結(jié)果，1號(hào)、2號(hào)、19號(hào)、25號(hào)、27號(hào)、28號(hào)、30號(hào)、31號(hào)、32號(hào)等組合，均為較優(yōu)組合。27號(hào)為最優(yōu)組合。

表5 菌種頡頏試驗(yàn)結(jié)果

表6 餐廚余發(fā)酵菌種初篩

表7 豆渣發(fā)酵菌種初篩

表8 加酶復(fù)合菌發(fā)酵餐廚余

續(xù)表

表9 加酶復(fù)合菌發(fā)酵豆渣

綜合上述分析，27號(hào)組合（即布拉迪酵母0.125%、枯草芽孢桿菌0.03%、植物乳桿菌0.1%、纖維素酶200 U·g-1、納豆芽孢桿菌0.03%、啤酒酵母0.25%、干酪乳桿菌0.05%）為發(fā)酵有機(jī)廢棄物最優(yōu)組合發(fā)酵菌粉。

2.6 發(fā)酵中試產(chǎn)物指標(biāo)測(cè)定

發(fā)酵餐廚常規(guī)主要成分及含量見表10。

由表10可知，餐廚余經(jīng)發(fā)酵后，其還原糖含量14.42%、粗蛋白質(zhì)含量30.41%、小肽含量34.16%；并含有芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌等益生菌。其致病菌，AS、Pb等重金屬均為檢出。經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，其營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)得到提高，安全得到保障。

發(fā)酵豆渣常規(guī)主要成分及含量見表11。

由表11可知，豆渣經(jīng)發(fā)酵后其還原糖含量5.137%、粗蛋白質(zhì)含量24.45%、小肽含量42.94%；并含有芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌等益生菌。其致病菌，AS、Pb等重金屬均未檢出。經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，其營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)得到提高，安全得到保障。

表10 發(fā)酵餐廚常規(guī)主要成分及含量

表11 發(fā)酵豆渣常規(guī)主要成分及含量

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)表明，采用布拉迪酵母0.125%、枯草芽孢桿菌0.03%、植物乳桿菌0.1%、納豆芽孢桿菌0.03%、啤酒酵母0.25%、干酪乳桿菌0.05%，纖維素酶200 U·g-1對(duì)有機(jī)廢棄物進(jìn)行處理，其具有發(fā)酵速度快、物料發(fā)酵結(jié)束后疏松、營(yíng)養(yǎng)豐富、安全等優(yōu)點(diǎn)。

混菌發(fā)酵是利用各菌之間的相互配合作用，提高發(fā)酵效益[10-11]。本試驗(yàn)選用纖維素酶制劑，可以在短時(shí)間內(nèi)分解粗纖維，為芽孢桿菌的迅速繁殖提供基礎(chǔ)能源。特別是在處理含有高粗纖維的原料時(shí)，纖維素酶的加入對(duì)于加速發(fā)酵進(jìn)程具有更顯著的意義[12-13]。芽孢桿菌分泌蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等多種酶系，從而全面啟動(dòng)混菌發(fā)酵。酵母菌屬于兼性厭氧菌，生活在偏酸環(huán)境中，菌體蛋白含量高達(dá)50%～60%，發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生酒香味，可以改善適口性。乳酸菌能夠?qū)⑻妓衔锇l(fā)酵成乳酸，同時(shí)產(chǎn)生細(xì)菌素、類細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，有效抑制有害微生物的活動(dòng)和有機(jī)物的急劇腐敗分解[14]?？赡苷墙?jīng)過(guò)以上酶菌的協(xié)同作用，使得該復(fù)合菌劑處理有機(jī)廢棄物時(shí)，可達(dá)到高效、安全且產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)豐富，更利于儲(chǔ)存與食用等優(yōu)點(diǎn)。該復(fù)合菌劑對(duì)處理有機(jī)廢棄物具有積極的意義。