谷愛軍 于 文

（西安開米股份有限公司，陜西 西安，710075）

目前，洗滌劑抑菌性能測試方法主要為GB 15979-2002《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準》、QB/T 2738-2012《日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評價方法》和衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2002]282號 《消毒技術(shù)規(guī)范》[2002年版]。采用懸液法對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進行抑菌性能測定時，三種方法均需在35℃±2℃培養(yǎng)48h。《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）菌落總數(shù)的檢驗方法中，可在每100mL卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂中加入1mL 0.5%TTC溶液[1]。筆者通過研究無色、無味的氯化三苯四氮唑（簡稱TTC）作為指示劑，應(yīng)用在抑菌試驗測試中，期望能建立快速測定日化產(chǎn)品抑菌效果評價的方法，以提高配方開發(fā)的效率。

1 實驗試劑及設(shè)備

1.1 主要試劑

2,3,5—三苯基氯化四氮唑，又稱氯化三苯基四氮唑 [triphenyltet2razolium chloride(TTC) ]、紅四唑等，化學式分析純，國藥集團化學試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，0.03mol/L，pH7.2），自配；標準硬水（硬度342mg/L），自配；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，生化試劑，北京路橋技術(shù)有限公司。

試驗菌株為金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、大腸埃希菌（ATCC 25922），中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 實驗設(shè)備

恒溫水浴鍋，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；渦旋儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；恒溫生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技儀器有限公司；TYJ-2A菌落計數(shù)器，上海宏匯電器廠；生物安全柜，型號BSC-1100II A2-x，濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗用日化產(chǎn)品

采購于大型超市，標貼宣稱具有抑菌功能的洗手液、洗衣液、餐具凈等產(chǎn)品。

2 實驗部分

2.1 菌懸液的配制

按照QB/T 2738-2012方法，無菌操作取金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、大腸埃希菌（ATCC 25922）五代的24h新鮮培養(yǎng)物，分別制備陽性菌懸液， 要求濃度為：取0.1mL滴入5.0mL PBS液內(nèi)，回收菌數(shù)在1×104～9×104cfu/mL[3]。

2.2 測試方法

按照QB/T 2738-2012《日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評價方法》抑菌率檢測方法進行測試，計算回收菌落數(shù)。

2.3 不同的滅菌方式對TTC的影響

配制0.1%TTC溶液500mL，分裝于螺口玻璃瓶中。A瓶：TTC溶液單獨避光高壓滅菌后，吸取1.0mL，加入至已滅菌并冷卻至50℃左右的100mL營養(yǎng)瓊脂中，混合；B瓶：TTC溶液采用0.45m m微孔濾膜過濾除菌，吸取1.0mL，加入至已滅菌并冷卻至50℃左右的100mL營養(yǎng)瓊脂中，混合；C瓶：吸取1.0mL TTC溶液，于100m瓊脂中混勻后121℃高壓滅菌15min。

吸取0.1mL菌懸液，加入到含5.0mL PBS的試管中，迅速混勻后，取混合液0.5mL加入到4.5mLPBS試管中（做適當稀釋，取其中2～3個稀釋度的稀釋液），吸取0.5mL置于滅菌平板內(nèi)，分別傾注A瓶、B瓶、C瓶及營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基各2個平皿，搖勻待冷卻后翻轉(zhuǎn)平皿至36℃±1℃培養(yǎng)48h，以營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)的回收菌數(shù)作為對照，以平板菌落數(shù)在30～300計數(shù)，各組測得的回收菌數(shù)見表1。

表1 不同的滅菌方式對TTC指示劑的影響

由表1可知：A瓶和B瓶菌落回收數(shù)，與營養(yǎng)瓊脂對照組的相對偏差均＜10%，而C瓶外觀呈現(xiàn)紅褐色，培養(yǎng)的陽性菌回收菌數(shù)與對照組有明顯差異。因此，本實驗選擇以A瓶顯色培養(yǎng)基的制備方法，即TTC經(jīng)單獨高壓滅菌再與50℃營養(yǎng)瓊脂混勻的方式進行后續(xù)試驗。

2.4 不同濃度TTC對陽性菌的影響

配制含TTC系列梯度的營養(yǎng)瓊脂5瓶，各瓶含TTC的濃度依次為0.01mg /mL、0.02mg /mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL。吸取0.1mL菌懸液，加入到含5.0mLPBS的試管中，迅速混勻；取混合液0.5mL加入到4.5mLPBS試管中，吸取樣液1mL置于滅菌平板內(nèi)（做適當稀釋后，取其中2～3個稀釋度的稀釋液），分別用含TTC系列梯度的營養(yǎng)瓊脂傾注5個平皿，充分混合均勻，待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿，置 36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48h±2h，同時做不加TTC的營養(yǎng)瓊脂對照及空白對照，以30～300 cfu/mL菌落生長數(shù)計數(shù)平板，各組測得的回收菌數(shù)見表2。

表2 含不同濃度TTC對陽性菌的影響

由表2可知：含0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mLTTC營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基都對大腸桿菌均無抑制現(xiàn)象；但對金黃色葡萄球菌顯色均敏感，當TTC濃度大于0.02mg/mL時，平皿的回收菌數(shù)與營養(yǎng)瓊脂對照組比較相對偏差略大，有一定的抑制現(xiàn)象，而且濃度越高，抑菌作用越明顯?？赡芘c革蘭氏陽性菌細胞壁上肽聚糖和磷壁酸含量高，而革蘭氏陰性菌肽聚糖和磷壁酸含量少，此外，還有脂蛋白、外膜、脂多糖等結(jié)構(gòu)的不同而導(dǎo)致對TCC敏感性不同[4]。 最終選擇0.02mg/mL的TTC作為顯色劑，既保證菌落良好的顯色效果，且不抑制細菌的生長。

2.5 不同色素對含0.02mg /mL TTC顯色培養(yǎng)基的影響

試驗用樣品選自超市采購的洗衣液（藍色、藍綠色）、洗手液（藍色、紅色、綠色、白色含珠光漿、橙黃色餐具凈等宣稱抑菌的日化產(chǎn)品。測試方法按照QB/T 2738《日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評價方法》和QB/T 2850《抗抑菌洗滌劑》[5]進行試驗。試驗采用顯色培養(yǎng)基24h與48h對照培養(yǎng)結(jié)果，并與營養(yǎng)瓊脂48h對照培養(yǎng)進行比對。結(jié)果見表3。

由表3可知：選購市場上常見的含各種色素的日化洗滌劑產(chǎn)品，按照QB/T 2738《日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評價方法》的要求進行懸液法抑菌試驗。試驗在36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h菌落已呈現(xiàn)紅色，易于計數(shù)，比標準要求的48h培養(yǎng)觀察縮短了時間，菌落數(shù)與48h觀察結(jié)果的誤差率＜10%，無明顯差異。TTC顯色培養(yǎng)基24h與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基48h培養(yǎng)計數(shù)誤差率＜10%，無明顯差異。樣品中所含的各種色素對TTC顯色無干擾。其原理為：簡稱TTC可被活細胞中的脫氫酶還原生成三苯甲臜類物質(zhì)而沉積，使細胞顯示出相應(yīng)的紅色或紫色[6]。

表3 TTC顯色培養(yǎng)基應(yīng)用到帶色的日化產(chǎn)品中的抑菌效果

3 結(jié)果與討論

TTC最常用在種子活性測定、植物疫病檢測、活組織活性檢測及菌落總數(shù)的測定。通過試驗發(fā)現(xiàn):TTC同樣適用于日化洗滌劑產(chǎn)品抑菌性能的測試。含0.02mg/mL的TTC顯色營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)均適宜，既能保證菌落良好的顯色效果且不抑制細菌的生長。在24h培養(yǎng)即可觀察出實驗結(jié)果，回收的菌數(shù)與48h觀察結(jié)果一致，且色素對其無影響。所以，建立快速檢測日化產(chǎn)品抑菌效果的試驗方法，可縮短檢測時間，并可應(yīng)用于大批量的樣品抑菌效果的評價。