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        日化產(chǎn)品抑菌效果快速檢測方法

        2019-03-22 06:12:58谷愛軍
        中國洗滌用品工業(yè) 2019年3期
        關(guān)鍵詞:菌數(shù)平皿懸液

        谷愛軍 于 文

        (西安開米股份有限公司,陜西 西安,710075)

        目前,洗滌劑抑菌性能測試方法主要為GB 15979-2002《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準》、QB/T 2738-2012《日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評價方法》和衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2002]282號 《消毒技術(shù)規(guī)范》[2002年版]。采用懸液法對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進行抑菌性能測定時,三種方法均需在35℃±2℃培養(yǎng)48h。《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)菌落總數(shù)的檢驗方法中,可在每100mL卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂中加入1mL 0.5%TTC溶液[1]。筆者通過研究無色、無味的氯化三苯四氮唑(簡稱TTC)作為指示劑,應(yīng)用在抑菌試驗測試中,期望能建立快速測定日化產(chǎn)品抑菌效果評價的方法,以提高配方開發(fā)的效率。

        1 實驗試劑及設(shè)備

        1.1 主要試劑

        2,3,5—三苯基氯化四氮唑,又稱氯化三苯基四氮唑 [triphenyltet2razolium chloride(TTC) ]、紅四唑等,化學式分析純,國藥集團化學試劑有限公司;磷酸鹽緩沖液(PBS,0.03mol/L,pH7.2),自配;標準硬水(硬度342mg/L),自配;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,生化試劑,北京路橋技術(shù)有限公司。

        試驗菌株為金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、大腸埃希菌(ATCC 25922),中國普通微生物菌種保藏管理中心。

        1.2 實驗設(shè)備

        恒溫水浴鍋,鄭州長城科工貿(mào)有限公司;渦旋儀,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;恒溫生化培養(yǎng)箱,上海一恒科技儀器有限公司;TYJ-2A菌落計數(shù)器,上海宏匯電器廠;生物安全柜,型號BSC-1100II A2-x,濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司。

        1.3 試驗用日化產(chǎn)品

        采購于大型超市,標貼宣稱具有抑菌功能的洗手液、洗衣液、餐具凈等產(chǎn)品。

        2 實驗部分

        2.1 菌懸液的配制

        按照QB/T 2738-2012方法,無菌操作取金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、大腸埃希菌(ATCC 25922)五代的24h新鮮培養(yǎng)物,分別制備陽性菌懸液, 要求濃度為:取0.1mL滴入5.0mL PBS液內(nèi),回收菌數(shù)在1×104~9×104cfu/mL[3]。

        2.2 測試方法

        按照QB/T 2738-2012《日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評價方法》抑菌率檢測方法進行測試,計算回收菌落數(shù)。

        2.3 不同的滅菌方式對TTC的影響

        配制0.1%TTC溶液500mL,分裝于螺口玻璃瓶中。A瓶:TTC溶液單獨避光高壓滅菌后,吸取1.0mL,加入至已滅菌并冷卻至50℃左右的100mL營養(yǎng)瓊脂中,混合;B瓶:TTC溶液采用0.45m m微孔濾膜過濾除菌,吸取1.0mL,加入至已滅菌并冷卻至50℃左右的100mL營養(yǎng)瓊脂中,混合;C瓶:吸取1.0mL TTC溶液,于100m瓊脂中混勻后121℃高壓滅菌15min。

        吸取0.1mL菌懸液,加入到含5.0mL PBS的試管中,迅速混勻后,取混合液0.5mL加入到4.5mLPBS試管中(做適當稀釋,取其中2~3個稀釋度的稀釋液),吸取0.5mL置于滅菌平板內(nèi),分別傾注A瓶、B瓶、C瓶及營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基各2個平皿,搖勻待冷卻后翻轉(zhuǎn)平皿至36℃±1℃培養(yǎng)48h,以營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)的回收菌數(shù)作為對照,以平板菌落數(shù)在30~300計數(shù),各組測得的回收菌數(shù)見表1。

        表1 不同的滅菌方式對TTC指示劑的影響

        由表1可知:A瓶和B瓶菌落回收數(shù),與營養(yǎng)瓊脂對照組的相對偏差均<10%,而C瓶外觀呈現(xiàn)紅褐色,培養(yǎng)的陽性菌回收菌數(shù)與對照組有明顯差異。因此,本實驗選擇以A瓶顯色培養(yǎng)基的制備方法,即TTC經(jīng)單獨高壓滅菌再與50℃營養(yǎng)瓊脂混勻的方式進行后續(xù)試驗。

        2.4 不同濃度TTC對陽性菌的影響

        配制含TTC系列梯度的營養(yǎng)瓊脂5瓶,各瓶含TTC的濃度依次為0.01mg /mL、0.02mg /mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL。吸取0.1mL菌懸液,加入到含5.0mLPBS的試管中,迅速混勻;取混合液0.5mL加入到4.5mLPBS試管中,吸取樣液1mL置于滅菌平板內(nèi)(做適當稀釋后,取其中2~3個稀釋度的稀釋液),分別用含TTC系列梯度的營養(yǎng)瓊脂傾注5個平皿,充分混合均勻,待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿,置 36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48h±2h,同時做不加TTC的營養(yǎng)瓊脂對照及空白對照,以30~300 cfu/mL菌落生長數(shù)計數(shù)平板,各組測得的回收菌數(shù)見表2。

        表2 含不同濃度TTC對陽性菌的影響

        由表2可知:含0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mLTTC營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基都對大腸桿菌均無抑制現(xiàn)象;但對金黃色葡萄球菌顯色均敏感,當TTC濃度大于0.02mg/mL時,平皿的回收菌數(shù)與營養(yǎng)瓊脂對照組比較相對偏差略大,有一定的抑制現(xiàn)象,而且濃度越高,抑菌作用越明顯??赡芘c革蘭氏陽性菌細胞壁上肽聚糖和磷壁酸含量高,而革蘭氏陰性菌肽聚糖和磷壁酸含量少,此外,還有脂蛋白、外膜、脂多糖等結(jié)構(gòu)的不同而導(dǎo)致對TCC敏感性不同[4]。 最終選擇0.02mg/mL的TTC作為顯色劑,既保證菌落良好的顯色效果,且不抑制細菌的生長。

        2.5 不同色素對含0.02mg /mL TTC顯色培養(yǎng)基的影響

        試驗用樣品選自超市采購的洗衣液(藍色、藍綠色)、洗手液(藍色、紅色、綠色、白色含珠光漿、橙黃色餐具凈等宣稱抑菌的日化產(chǎn)品。測試方法按照QB/T 2738《日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評價方法》和QB/T 2850《抗抑菌洗滌劑》[5]進行試驗。試驗采用顯色培養(yǎng)基24h與48h對照培養(yǎng)結(jié)果,并與營養(yǎng)瓊脂48h對照培養(yǎng)進行比對。結(jié)果見表3。

        由表3可知:選購市場上常見的含各種色素的日化洗滌劑產(chǎn)品,按照QB/T 2738《日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評價方法》的要求進行懸液法抑菌試驗。試驗在36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h菌落已呈現(xiàn)紅色,易于計數(shù),比標準要求的48h培養(yǎng)觀察縮短了時間,菌落數(shù)與48h觀察結(jié)果的誤差率<10%,無明顯差異。TTC顯色培養(yǎng)基24h與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基48h培養(yǎng)計數(shù)誤差率<10%,無明顯差異。樣品中所含的各種色素對TTC顯色無干擾。其原理為:簡稱TTC可被活細胞中的脫氫酶還原生成三苯甲臜類物質(zhì)而沉積,使細胞顯示出相應(yīng)的紅色或紫色[6]。

        表3 TTC顯色培養(yǎng)基應(yīng)用到帶色的日化產(chǎn)品中的抑菌效果

        3 結(jié)果與討論

        TTC最常用在種子活性測定、植物疫病檢測、活組織活性檢測及菌落總數(shù)的測定。通過試驗發(fā)現(xiàn):TTC同樣適用于日化洗滌劑產(chǎn)品抑菌性能的測試。含0.02mg/mL的TTC顯色營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)均適宜,既能保證菌落良好的顯色效果且不抑制細菌的生長。在24h培養(yǎng)即可觀察出實驗結(jié)果,回收的菌數(shù)與48h觀察結(jié)果一致,且色素對其無影響。所以,建立快速檢測日化產(chǎn)品抑菌效果的試驗方法,可縮短檢測時間,并可應(yīng)用于大批量的樣品抑菌效果的評價。

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