鄧榮榮， 羅芯怡， 葉乃菁， 吳新萍， 謝燈飄， 李明權(quán)

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川成都 610075）

腎小管上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡是急性腎損傷，尤其是缺血性急性腎損傷發(fā)生及惡化的重要機(jī)制[1-3］，氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥機(jī)制、鈣超載等均有所參與。其中氧化應(yīng)激可通過(guò)誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞活性氧簇爆發(fā)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，參與腎臟缺血再灌注損傷[4］和急性腎損傷[5］，成為重要致病機(jī)制之一。

前期課題組發(fā)現(xiàn)，腎衰康灌腸液對(duì)缺氧／復(fù)氧損傷的人腎小管上皮細(xì)胞 （HK-2）凋亡具有明顯抑制作用。因此，本實(shí)驗(yàn)基于 “治未病”思想，從細(xì)胞水平觀察腎衰康灌腸液含藥血清預(yù)防HK-2細(xì)胞缺氧／復(fù)氧損傷的效果，并基于氧化應(yīng)激探討其作用機(jī)制。

1 材料

腎衰康灌腸液 （濃縮型，海南天元制藥廠，批號(hào)20130801）。HK-2細(xì)胞 （上海生物資源庫(kù)）。ROS測(cè)定試劑盒 （貨號(hào) Ab39476）、 AKT （貨號(hào) 4691 CST）、 NF-κB（貨號(hào)6956 CST）、 MAPK （貨號(hào)2532 CST） （英國(guó) Abcam公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （美國(guó)Thermo Scientific公司）；熒光定量試劑盒、LC-96熒光定量PCR儀 （瑞士羅氏公司）。9只健康新西蘭大白兔 （雄性5只、雌性4只）購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體質(zhì)量 （2.2±0.2）kg，生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK（川）2013-17，使用許可證號(hào) SYXK（川）2017-179，于成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)半屏蔽系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室以標(biāo)準(zhǔn)飼料分籠飼養(yǎng)，自由飲水，12 h明暗自動(dòng)切換，保持溫度 （20±2）℃、相對(duì)濕度 （60±5）%，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 血清制備 將9只家兔按體質(zhì)量隨機(jī)分成空白組、PBS組、腎衰康灌腸液高劑量組，每組3只?？瞻捉M家兔正常喂養(yǎng)，不進(jìn)行灌腸給藥；PBS組家兔給予PBS緩沖液灌腸，劑量6.4 mL／（kg·d）；腎衰康灌腸液高劑量組家兔給予腎衰康灌腸液灌腸，劑量6.4 mL／（kg·d）（該劑量是按照人120 mL／d劑量與家兔體表面積的2倍換算得出），每天灌腸4次，每次間隔2～3 h，共3 d。第4天上午完成1次灌腸后，立即對(duì)各組家兔進(jìn)行采血、離心、取上清、過(guò)濾除菌操作，得到相應(yīng)血清，再進(jìn)一步制備中劑量（50%高劑量含藥血清+50%空白血清）、低劑量 （25%高劑量含藥血清+75%空白血清）含藥血清。

2.2 分組及造模 在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下，以含10%胎牛血清的DMEM／F12細(xì)胞培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)HK-2細(xì)胞。同步化24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、PBS組及含藥血清高、中、低劑量組，其中對(duì)照組、PBS組用“2.1”項(xiàng)下含PBS血清培養(yǎng)，含藥血清組用 “2.1”項(xiàng)下相應(yīng)劑量含藥血清培養(yǎng)。預(yù)處理24 h后，PBS緩沖液漂洗細(xì)胞，再換常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)，同時(shí)向PBS組、含藥血清組加入 CoCl2原液（250 μmol／L） 以使其終濃度為 500 μmol／L，于37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，進(jìn)行缺氧／復(fù)氧損傷造模。

2.3 細(xì)胞凋亡／死亡率檢測(cè) 采用CFSE／PI染色、Annexin V-FITC／PI雙染色、流式細(xì)胞分析，檢測(cè) “2.2”項(xiàng)下5組細(xì)胞造模后0、4、12、24 h凋亡／損傷情況。

2.4 細(xì)胞ROS水平檢測(cè) 按 “2.2”項(xiàng)下方法常規(guī)培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，同步化24 h后，隨機(jī)分為空白組、模型組、預(yù)防組，其中空白組、模型組用 “2.1”項(xiàng)下PBS血清培養(yǎng)，預(yù)防組用 “2.1”項(xiàng)下高劑量含藥血清培養(yǎng)。預(yù)處理24 h后，PBS緩沖液漂洗3組細(xì)胞，再換常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)，同時(shí)向模型組、預(yù)防組加入CoCl2，按 “2.2”項(xiàng)下方法造模。通過(guò)ROS熒光探針結(jié)合倒置顯微鏡，檢測(cè)3組造模前后0、1、2、4、6、8 h細(xì)胞ROS水平。

2.5 AKT、NF-κB、MAPK mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用PCR技術(shù)，檢測(cè)PBS組、含藥血清組造模后0、4、8、12、24 h細(xì)胞AKT、NF-κB、MAPK mRNA表達(dá)，PCR引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。其中，AKT正向 AGCGACG TGGCTATTGTGAAG，反向 GCCATCATTCTTGAGGAGGAAG T；NF-κB正向ATGTGGAGATCATTGAGCAGC， 反向CCTGGTCCTGTGTAGCCATT；MAPK正向 TACACCAACCTCTCGTACATCG，反向CATGTCTGAAGCGCAGTAAGATT，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2 min，94℃ 20 s，60℃ 45 s，循環(huán)40次，讀取CT。然后，計(jì)算三者CT與內(nèi)參基因β-actin CT之差ΔCT， 再與PBS組的 ΔCT相減得到 ΔΔCT， 最后通過(guò)公式 2T-ΔΔC測(cè)定含藥血清組三者表達(dá)相對(duì)于PBS組的倍數(shù)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS13.0軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用s）表示，2組間比較采用Student t檢驗(yàn)；多組間比較方差齊者采用單因素方差分析，不齊者采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 缺氧／復(fù)氧損傷對(duì)HK-2細(xì)胞ROS水平的影響[6］圖1顯示，造模后細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度明顯高于造模前，表明以CoCl2進(jìn)行缺氧／復(fù)氧損傷造模時(shí)可引起HK-2細(xì)胞ROS積聚，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖1 缺氧／復(fù)氧損傷對(duì)HK-2細(xì)胞ROS水平的影響

3.2 含藥血清對(duì)HK-2細(xì)胞CFSE／PI染色的影響 圖2～6顯示，造模后0 h，各組細(xì)胞尚未發(fā)生凋亡／損傷；造模后4～12 h，各組細(xì)胞凋亡／死亡率明顯增加，但含藥血清組明顯低于對(duì)照組、PBS組，并以高劑量組最低；造模后24 h，對(duì)照組、PBS組、含藥血清低劑量組仍有較低水平的細(xì)胞凋亡／損傷存在，而高、中劑量組已回到正常水平。

圖2 含藥血清對(duì)HK-2細(xì)胞CFSE／PI染色的影響 （0 h）

圖3 含藥血清對(duì)HK-2細(xì)胞CFSE／PI染色的影響 （4 h）

圖6 含藥血清對(duì)HK-2細(xì)胞CFSE／PI染色的影響（0～24 h）

3.3 含藥血清對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡／死亡率的影響 圖7～8顯示，造模后0 h，各組細(xì)胞均主要分布于雙染陰性左下象限，即細(xì)胞凋亡／損傷尚未出現(xiàn)；造模后12 h，各組細(xì)胞凋亡分布明顯增多，但含藥血清中、高劑量組表現(xiàn)出明顯的抑制作用 [凋亡／死亡率為中劑量組 （20.9±0.7）%、高劑量組 （18.4±0.7）%， 顯著低于對(duì)照組的 （28.1±2.2）%、PBS組的 （27.7±2.5）%， P＜0.05）； 造模后 24 h， 對(duì)照組、PBS組能檢測(cè)到明顯細(xì)胞凋亡，凋亡／死亡率為（22.5±2.2）%，而含藥血清組細(xì)胞凋亡已降至較低水平，低、中、高劑量下凋亡／死亡率分別為（10±0.9）%、 （7.7±0.7）%、（6.6±0.7）% 。

圖7 含藥血清對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡／死亡率的影響 （Ⅰ）

圖8 含藥血清對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡／死亡率的影響 （Ⅱ）

3.4 含藥血清對(duì)HK-2細(xì)胞ROS水平的影響 圖9顯示，各組在造模前均未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞綠色熒光，即均處于氧化還原平衡狀態(tài)；造模后模型組細(xì)胞出現(xiàn)大量綠色熒光，表明造模可引起ROS水平明顯增高，細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。其中預(yù)防組明顯少于模型組。圖10顯示，預(yù)防組、模型組均在造模后0 h即達(dá)到ROS水平峰值，隨后均逐漸減少至消失，但預(yù)防組在造模后4 h即基本恢復(fù)至正常，而模型組需在造模后8 h。

3.5 含藥血清對(duì)HK-2細(xì)胞AKT、NF-κB、MAPK mRNA表達(dá)的影響 圖11顯示，與PBS組比較，造模后0～4 h含藥血清組 AKT、NF-κB、MAPK mRNA表達(dá)下降，4～12 h逐漸升高，而且對(duì)NF-κB、MAPK mRNA表達(dá)呈現(xiàn)一定劑量依賴(lài)性，與PBS組比較有顯著差異 （P＜0.05）。

4 討論

急性腎損傷是一種臨床上常見(jiàn)的綜合征[7］，其中急性腎小管壞死主要由缺血和中毒引起，缺血性可占發(fā)病的75%[8］。缺血再灌注性腎損傷是引發(fā)缺血性急性腎損傷的重要機(jī)制之一，但由于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)其缺乏切實(shí)有效的治療方法，不僅導(dǎo)致病死率高達(dá)50%以上[9］，而且有相當(dāng)數(shù)量的患者最終進(jìn)展為終末期腎病，需長(zhǎng)期替代治療。

圖9 造模前后各組HK-2細(xì)胞ROS水平比較

腎衰康灌腸液由大黃、黃芪、丹參、紅花組成，作為以急性腎損傷為適應(yīng)證的唯一應(yīng)用于臨床的純中藥制劑，臨床療效確切。前期課題組發(fā)現(xiàn)，腎衰康灌腸液含藥血清可抑制缺氧／復(fù)氧損傷后HK-2細(xì)胞凋亡，但它是否對(duì)缺氧／復(fù)氧損傷誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡具有預(yù)防作用尚不明確。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CFSE／PI染色、Annexin V-FITC／PI雙染色結(jié)合流式細(xì)胞分析、ROS熒光檢測(cè)、PCR技術(shù)，從細(xì)胞、基因?qū)用孢M(jìn)行考察。

圖10 造模后模型組、預(yù)防組HK-2細(xì)胞ROS水平比較

圖11 含藥血清對(duì)HK-2細(xì)胞AKT （A）、NF-κB （B）、MAPK （C） mRNA表達(dá)的影響

細(xì)胞凋亡是Kerr等[10］在1972年提出的有別于細(xì)胞壞死的細(xì)胞程序性死亡，而氧化應(yīng)激是導(dǎo)致細(xì)胞病理性過(guò)度凋亡的主要機(jī)制之一，它可通過(guò)ROS等氧化損傷線粒體功能及結(jié)構(gòu)[11］、 升高胞漿內(nèi) Ca2+濃度[12］、 激活某些死亡基因程序 （如Bax、P53等）[13］等途徑來(lái)導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度凋亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腎衰康灌腸液含藥血清對(duì)缺氧／復(fù)氧損傷誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡具有明顯預(yù)防作用，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，即高劑量下效果最強(qiáng)。ROS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，腎衰康灌腸液含藥血清預(yù)處理對(duì)缺氧／復(fù)氧損傷誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)具有明顯抑制作用，具體表現(xiàn)為細(xì)胞ROS集聚明顯減少，而且經(jīng)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)它對(duì)與ROS調(diào)節(jié)相關(guān)的AKT、NF-κB、MAPK等通路[14-15］具有一定調(diào)控作用。

綜上所述，腎衰康灌腸液含藥血清可預(yù)防HK-2細(xì)胞缺氧／復(fù)氧損傷，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激、減少細(xì)胞ROS過(guò)量聚積有關(guān)。