徐昭梅，謝新喬，鄧邵文

［紅塔煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，云南玉溪653100］

激光掃描共聚焦顯微技術(shù)由顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)、激光光源、電子攝像和計算機(jī)圖像處理系統(tǒng)4個部分組成，其主要的技術(shù)優(yōu)勢是分辨率高、成像速度快、自動化程度高，能獲得連續(xù)的光學(xué)切片，對較厚（＞10μm）樣品的快速三維重建，可全方位認(rèn)識樣品組織結(jié)構(gòu)的形貌形態(tài)［1］。激光掃描共聚焦顯微技術(shù)在冶金、化工、生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛，能觀測樣品表面的三維微觀形貌特征，并對微觀的形貌參數(shù)（如深度、高度、長寬、體積、面積、粗糙度等）進(jìn)行定量分析，因而激光掃描共聚焦顯微技術(shù)可以為煙葉外觀特征的量化研究提供有效手段。

煙葉組織粗糙度與煙葉葉齡、著生部位、品種特性、栽培管理、調(diào)制技術(shù)、土壤環(huán)境和氣候條件等密切相關(guān)［2］。王信民等將葉面組織作為外觀區(qū)域特征的評價指標(biāo)之一，葉面組織指煙葉表面狀態(tài)及木質(zhì)化程度給予視覺、觸覺的粒面精細(xì)程度和質(zhì)感，可分為粗糙、較粗糙、較細(xì)膩和細(xì)膩4個檔次［3］。王亞平等認(rèn)為，葉片結(jié)構(gòu)與粗糙度密切相關(guān)，將葉片結(jié)構(gòu)分解為粗糙度、充實度、彈性、柔軟度等4個因子描述詞，對粗糙度的釋義為通過視覺或觸覺感受到葉片表面細(xì)膩、凹凸不平的程度，正常成熟的煙葉，部位越高，細(xì)胞結(jié)構(gòu)越緊密，表皮的葉面組織越粗糙［4］。在感官分析技術(shù)中，葉面組織的粗糙細(xì)膩程度屬于表面幾何質(zhì)地特性的范疇［5］；粗糙度是作為質(zhì)地特性的因子之一［6］，而現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)［7］中對葉面組織粗糙度的規(guī)范相對模糊。在機(jī)械、紡織領(lǐng)域，粗糙度的表征已取得實質(zhì)性進(jìn)展，而在煙葉評級領(lǐng)域［8-9］，對葉面組織粗糙度的量化及量值確定至今仍未見報道［3，10］。因此，本研究針對煙葉表皮的葉面組織參比樣進(jìn)行系統(tǒng)研究，合理劃分梯度并描述，使用激光掃描共聚焦顯微鏡定量表征葉面微觀形貌，運(yùn)用心理物理學(xué)定律［11］驗證，為煙葉評級從傳統(tǒng)技藝走向科學(xué)、成為學(xué)科提供參考依據(jù)，實現(xiàn)傳統(tǒng)評級可傳承和現(xiàn)代評級可量化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

選用云南玉溪地區(qū)的K326全葉位的初烤煙樣品作為參比樣品的供試材料；選用云南玉溪世界煙草品種園種植的紅花大金元、K326、KRK26、NC71、云煙97、中煙100、云煙87和福建三明種植的翠碧1號，收集第9至第10有效葉位的初烤煙樣品作為品種識別的供試材料。

所用儀器為Olympus OLS4100激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 評價小組的成立 依據(jù)GB/T 16291.1—2012《感官分析 選拔、培訓(xùn)與管理評價員一般導(dǎo)則 第1部分：優(yōu)選評價員》［12］，邀請13位獲得中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院感官分析優(yōu)選評價員資格的評價員組成評價小組。

1.2.2 評價樣品的準(zhǔn)備 采集樣品后，將1/3的葉尖部、1/3的葉基部和葉緣去除，制作成8 cm×6 cm的長方形葉片。依據(jù)YC/T 291—2009《煙葉分級實驗室環(huán)境條件》［13］，進(jìn)行48 h以上的溫濕平衡，使煙葉水分達(dá)到并保持在16%～18%。

1.2.3 粗糙度評價 評價小組通過感官分析技術(shù)對參比樣進(jìn)行多次測試，確定參比樣實物、檔次、特征描述；使用15 cm線性標(biāo)度對樣品粗糙度進(jìn)行感覺強(qiáng)度的量化，作為樣品粗糙度的感官標(biāo)度值；選取葉片中間離主脈約2 cm的位置，避開支脈、殘傷、油印或病斑部分打孔取樣，采用Olympus OLS4100激光掃描共聚焦顯微鏡，放大倍數(shù)為20×50，掃描范圍為257μm×257μm，對樣品葉面進(jìn)行3D形貌觀察及粗糙度參數(shù)測量。

利用感官強(qiáng)度值與儀器測量值作斯蒂文心理物理功效回歸分析，即ln S＝ln K+n ln I。其中：S為感覺響應(yīng)強(qiáng)度（即感官標(biāo)度值）；K為常數(shù)；I為物理刺激強(qiáng)度（即儀器測量值）。驗證粗糙細(xì)膩度的感官標(biāo)度值與儀器測量值之間的相關(guān)性。采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 參比樣的測試

表1為13位評價員對葉面組織粗糙度參比樣品進(jìn)行Friedman檢驗［14］的測試結(jié)果，評價小組經(jīng)多次測試，將所有樣品的粗糙度劃分成7個檔次。3j（p+1）＝74.26（Ftest為聯(lián)合假設(shè)檢驗，j、p為自由度，R為常數(shù)），查文獻(xiàn)［15］中的表可知α＝0.05、j＝13、p＝7時對應(yīng)的臨界值為12.37，F(xiàn)test＝74.26＞12.37，因此可以判斷7個樣品在整體上是存在顯著差異的，參比樣實物如圖1所示。

表1 葉面組織粗糙度參比樣感官測試結(jié)果

2.2 確定參比樣

2.2.1 感官評價 葉面組織粗糙度的7個檔次的描述詞可用細(xì)膩、較細(xì)膩、稍細(xì)膩、中等、稍粗糙、較粗糙和粗糙進(jìn)行表征；并對每個檔次進(jìn)行描述性分析；使用15 cm線性標(biāo)度［16］對樣品進(jìn)行感覺強(qiáng)度的量化，如表2所示。

2.2.2 形貌觀察 由圖2可知，煙葉表面主要為嵴狀隆起，其中7檔粗糙，6檔較粗糙，6、7檔表面均有尖銳的針狀隆起，5檔稍粗糙，4檔中等，且4、5檔表面有粒狀隆起，3檔稍細(xì)膩，2檔較細(xì)膩，1檔細(xì)膩，且1、2、3檔表面波狀脊隆起較為平緩。1檔細(xì)膩，隆起最大高值為18.31μm；2檔較細(xì)膩，隆起最高值為29.18μm；3檔稍細(xì)膩，隆起最高值為39.12μm；4檔中等，隆起最高值為57.45μm；5檔稍粗糙，隆起最高值為81.65μm；6檔較粗糙，隆起最高值為120.77μm；7檔粗糙，隆起最高值為213.48μm。

由表3可知，7種不同檔次粗糙度的煙葉表面形貌特征參數(shù)Sa差異明顯，隨著粗糙度的增強(qiáng)，表面形貌平均高度Sa有上升的趨勢，Sa大小排序如下：7檔（粗糙）＞6檔（較粗糙）＞5檔（稍粗糙）＞4檔（中等）＞3檔（稍細(xì)膩）＞2檔（較細(xì)膩）＞1檔（細(xì)膩），與樣品粗糙度感官評價結(jié)果的順序一致。表面形貌高度的尖峭度Sku在各粗糙度檔次之間無顯著差異，3檔（稍細(xì)膩）、6檔（較粗糙）和7檔（粗糙）的Sku＜3，表示表面形貌脊?fàn)盥∑鸲酁檩^鈍化的類型；1檔（細(xì)膩）、2檔（較細(xì)膩）和5檔（稍粗糙）的Sku值接近3，表示表面形貌脊?fàn)盥∑疠^尖銳的類型和較鈍化的類型幾乎一樣多；4檔（中等）的Sku＞3，表示表面形貌脊?fàn)盥∑鸲酁檩^尖銳的類型。

表2 葉面組織粗糙度感官評價

表3 葉面組織粗糙度主要物理參數(shù)分析

綜上所述，在4檔（中等）、5檔（稍粗糙）、6檔（較粗糙）和7檔（粗糙）的樣品里，隨著粗糙度的增加，隆起最大高度也有變大的趨勢，說明葉面的隆起最大高度和平均高度Sa對粗糙度貢獻(xiàn)率較大，蠟質(zhì)層和角質(zhì)層也起一定的影響作用；在1檔（細(xì)膩）、2檔（較細(xì)膩）和3檔（稍細(xì)膩）的樣品里，由于葉表面無明顯顆粒物，隆起最高值的變化梯度不大，說明葉面的隆起最大高度對粗糙度影響不大，主要是表面形貌平均高度Sa對粗糙度的影響較大。

2.2.3 量值確定

2.2.3.1 相關(guān)分析 將儀器測量的粗糙度相關(guān)參數(shù)與感官標(biāo)度值做相關(guān)分析（表4），篩選特征物理量。

表4 葉面組織粗糙度感官強(qiáng)度與物理參數(shù)的相關(guān)分析

由表4可知，感官強(qiáng)度與表面形貌平均高度Sa呈極顯著正相關(guān)且相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.98，感官強(qiáng)度與尖峭度Sku的相關(guān)性未達(dá)顯著水平。因此將表面形貌平均高度Sa作為葉面組織粗糙度的典型特征指標(biāo)。

2.2.3.2 斯蒂文心理物理功效函數(shù)驗證 心理物理學(xué)研究表明，感覺響應(yīng)強(qiáng)度與物理刺激強(qiáng)度的自然對數(shù)值呈線性關(guān)系：S＝KIn。將該式轉(zhuǎn)換為自然對數(shù)式，即ln S＝ln K+n ln I，也稱為斯蒂文心理物理功效函數(shù)。

以儀器測量值的自然對數(shù)（ln Sa）為自變量X、粗糙度感官標(biāo)度值的自然對數(shù)（ln M）為因變量Y，建立的回歸模型如下：

說明樣品的粗糙度感覺量（M）的變化與儀器測量的物理量（Sa）之間符合心理物理學(xué)冪定律，在一定程度上說明樣品的選擇和特征參數(shù)的甄選是合理的，最終據(jù)此建立初烤煙葉面粗糙度參比樣（表5）。

表5 葉面組織粗糙度參比樣體系

2.3 粗糙度在品種識別中的應(yīng)用

如圖3所示，翠碧1號葉表面隆起有直徑41.26μm、高16.83 μm 的中空圓柱體結(jié)構(gòu)，葉面隆起最大高度為24.66μm；紅花大金元葉面隆起最大高度為28.23μm；KRK26葉面隆起最大高度為32.28μm；NC71葉面隆起最大高度為30.87μm；K326葉面隆起最大高度為25.86μm；云煙87葉面隆起最大高度為26.56μm；云煙97葉面隆起最大高度為40.51μm；中煙100葉面隆起最大高度為45.47μm。

由表6可知，表面形貌高度的尖峭度Sku在各品種的中部初烤煙之間無顯著差異。8種不同品種的中部初烤煙表面形貌粗糙度參數(shù)Sa差異明顯，結(jié)合圖3的微觀形貌分析，可將8個品種分為5個類型，其中翠碧1號為第1類，屬于細(xì)膩檔次，且葉表面有獨(dú)特的中空圓柱體結(jié)構(gòu)；紅花大金元和云煙87為第2類，屬于細(xì)膩至較細(xì)膩檔次；NC71、K326和KRK26為第3類，屬于較細(xì)膩至稍細(xì)膩檔次；云煙97為第4類，屬于中等檔次，中煙100為第5類，屬于中等至稍粗糙檔次。Sa大小為中煙100＞云煙97＞KRK26＞K326＞NC71＞云 煙87＞紅花大金元＞翠碧1號。

3 結(jié)論

采用激光掃描共聚焦顯微鏡對葉面組織的微觀形貌進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)煙葉表面存在大量的嵴狀隆起區(qū)域，可將煙葉分為細(xì)膩、較細(xì)膩、稍細(xì)膩、中等、稍粗糙、較粗糙和粗糙7個檔次，其粗糙度參數(shù)Sa分別為2.95、3.60、4.54、5.56、6.67、8.26、10.34μm。基于心理物理學(xué)定律建立起了烤煙葉面組織粗糙度參比樣體系，為煙葉評級提供了一把可參考的標(biāo)尺。不同品種初烤煙的粗糙度也有一定差異，中煙100葉面組織粗糙度最大，翠碧1號葉面組織粗糙度最小且葉表面隆起有直徑41.26μm、高16.83μm的中空圓柱體結(jié)構(gòu)。

表6 不同烤煙品種葉面組織粗糙度的主要物理參數(shù)